程景廣，于 敏，戴曉風(fēng)，張增虎，劉 娜，安 可，史曉翀，張曉華(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

東太平洋結(jié)核區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究?

程景廣，于 敏??，戴曉風(fēng)，張增虎，劉 娜，安 可，史曉翀，張曉華
(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

東太平洋結(jié)核區(qū)位于東北太平洋，在深海海底含有豐富的多金屬結(jié)核，而微生物在多金屬結(jié)核的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過DY29航次獲得了該區(qū)域多個實(shí)驗樣品，包括結(jié)核、結(jié)核覆蓋的沉積物、無結(jié)核覆蓋的沉積物和底層海水，并對這些樣品進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)和活性檢測。結(jié)果表明，東太平洋結(jié)核區(qū)擁有豐富的微生物資源，共分離保藏細(xì)菌1 200株，其中402株細(xì)菌完成16S rRNA基因測序，分屬于4個門，65個屬和135個種。4個門分別為變形菌門(Proteobacteria，占81.59%)、放線菌門(Actinobacteria，占8.21%)、厚壁菌門(Firmicutes，占8.21%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，占1.99%)；優(yōu)勢屬為鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)等。兩種沉積物樣品中可培養(yǎng)放線菌門和厚壁菌門的細(xì)菌豐度較高，結(jié)核中分離得到的細(xì)菌包含較高比例的α-變形菌綱，4種樣品類型中γ-變形菌綱的細(xì)菌均占最大比例。對結(jié)核樣品分離得到的細(xì)菌進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)具有過氧化氫酶及酯酶(吐溫20和吐溫40)活性的菌株所占比例較高，并首次篩選出一些未報道的具有錳氧化能力的菌株。綜合以上結(jié)果，東太平洋結(jié)核區(qū)不同樣品的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性較高，微生物資源豐富，而具有錳氧化能力菌株的分離鑒定對研究深海多金屬結(jié)核的形成及深海礦產(chǎn)資源的開發(fā)都具有重要的意義。

東太平洋結(jié)核區(qū)；可培養(yǎng)細(xì)菌；酶學(xué)性質(zhì)；錳氧化細(xì)菌；16S rRNA 基因

深海錳結(jié)核是一種含有錳、鐵、鎳、鈷和銅等多種金屬的團(tuán)狀疏松礦石，又稱為多金屬結(jié)核，廣泛分布于4 000～6 000 m的深海[1]。據(jù)估計全世界大洋海底的結(jié)核儲量大約3萬億t，而僅太平洋的儲量就有1.7萬億t，其次為印度洋和大西洋，其中克拉里昂-克里伯頓斷裂帶(Clarion-Clipperton Fracture Zone, CCFZ)位于東北太平洋，該區(qū)結(jié)核的豐度和品位最高，被認(rèn)為是最具有商業(yè)價值的結(jié)核區(qū)[2-3]。

海洋中的微生物以數(shù)量大、種類多和適應(yīng)能力強(qiáng)等原因備受關(guān)注，特別是深海的極端環(huán)境微生物，是目前研究的熱點(diǎn)之一。深海環(huán)境一般為高壓、低溫、黑暗、高鹽、寡營養(yǎng)，而生活在此生態(tài)系統(tǒng)中的微生物卻具有豐富的物種多樣性及功能活性。深海多金屬結(jié)核區(qū)作為一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，其所孕育的微生物群落與其他地區(qū)有一定差異。深海微生物的分離培養(yǎng)一直是研究海洋微生物的基礎(chǔ)內(nèi)容，對研究微生物的生理學(xué)功能、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和在生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用具有重要的意義。

目前，采用培養(yǎng)方法對深海多金屬結(jié)核區(qū)微生物種群組成的研究較少。史君賢等[4]對東太平洋鐵錳結(jié)核區(qū)不同樣品(水樣，結(jié)核和沉積物)中鐵錳相關(guān)細(xì)菌的豐度進(jìn)行了比較，并分離出347株細(xì)菌，鑒定為11個屬。近年來，越來越多的學(xué)者采用非培養(yǎng)方法研究了結(jié)核區(qū)不同樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)，如Xu等[5]在2005年采用克隆文庫法首次對東太平洋結(jié)核區(qū)沉積物樣品的多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門中的γ-變形菌綱為優(yōu)勢類群。Xu等[6]在2008年使用克隆文庫法對東北太平洋結(jié)核區(qū)不同深度的沉積物樣品進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)不同深度的沉積物的優(yōu)勢類群也為γ-變形菌綱。Wang等[7]在2010年使用克隆文庫法對CCFZ區(qū)四個站位的沉積物樣品進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢門均為變形菌門，但優(yōu)勢綱卻各不相同。Wu[8]等在2013年使用克隆文庫法對深海多金屬結(jié)核樣品和周圍的沉積物樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)沉積物樣品的多樣性比結(jié)核樣品高。由此可見，利用非培養(yǎng)方法能夠較好地了解深海多金屬結(jié)核區(qū)的微生物種群組成，但由于無法獲得純培養(yǎng)的菌株，對于認(rèn)識該區(qū)域微生物的生態(tài)功能還需要進(jìn)一步通過可培養(yǎng)的方法進(jìn)行研究。

多金屬結(jié)核的形成需要生物與化學(xué)的協(xié)同作用[9-11]，然而迄今為止，深海結(jié)核的具體形成原因還不清楚，但越來越多的研究證實(shí)了多金屬結(jié)核的形成離不開微生物，如閻葆瑞等[12]通過模擬試驗論證了多金屬結(jié)核的微生物成礦機(jī)制，Ehrlich等[13-15]做了大量工作研究細(xì)菌在錳結(jié)核形成過程中對錳離子的轉(zhuǎn)化作用。本研究對多金屬結(jié)核區(qū)中結(jié)核樣品、結(jié)核覆蓋的沉積物樣品、無結(jié)核覆蓋的沉積物樣品和底層海水樣品進(jìn)行了可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)，研究了該區(qū)域微生物的多樣性及基礎(chǔ)代謝活性，并進(jìn)一步分離鑒定出了具有錳氧化活性的菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在2013年8—9月期間，通過參加由“科學(xué)六號”考察船所執(zhí)行的“大洋29”航次科考，獲得了大量CCFZ區(qū)樣品。水樣采用CTD采水器獲取，選取的水樣為底層水；沉積物采用抓斗式和箱式采泥器獲得。使用R2A和2216E培養(yǎng)基進(jìn)行現(xiàn)場涂布，將未涂布的樣品置于4 ℃，帶回實(shí)驗室進(jìn)一步處理。采樣站位的經(jīng)緯度及水深等數(shù)據(jù)如表1所示，采取的樣品分為四種類型：底層海水、結(jié)核、結(jié)核覆蓋的沉積物和無結(jié)核覆蓋的沉積物。

1.2 菌株的分離、純化及保藏

用無菌藥匙挑取適量的沉積物樣品或搗碎的結(jié)核樣品置于生理鹽水中，并分別進(jìn)行10、100、1 000倍梯度稀釋。將各稀釋梯度的樣品涂布于R2A、2216E和SPG-4[16]固體培養(yǎng)基平板，每個梯度2個平行，同時對水樣進(jìn)行類似的處理。為了篩選出具有錳氧化能力的菌株，將部分站位的樣品涂布到K板[17]上，然后將涂布的平板分別置于4、10、和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。依據(jù)平板上菌株的大小、顏色和形態(tài)等特征挑取單菌落，劃線純化3次后接種斜面，用含15%甘油的保種液保種，并置于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

1.3 菌株DNA的提取和16S rRNA基因測序

采用煮沸法或酚氯仿抽提法[18]提取菌株的基因組DNA。以通用引物B8F和B1510[16]對菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以限制性內(nèi)切酶Hae III進(jìn)行酶切，將酶切圖譜不同的PCR產(chǎn)物委托北京六合華大有限公司進(jìn)行測序。

1.4 根據(jù)16S rRNA基因序列進(jìn)行菌株的分類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測序所得的16S rRNA基因序列與韓國標(biāo)準(zhǔn)菌數(shù)據(jù)庫 (www.ezbiocloud.net)進(jìn)行比對，根據(jù)相似度最高的序列確定菌株的分類地位。將所有菌株的16S rRNA基因序列(相同序列用其中一條取代)利用MEGA 6.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自舉法1 000次檢測進(jìn)化樹的可靠性。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)的檢測

將分離自結(jié)核樣品的菌株分別檢測以下酶學(xué)活性或生物活性：在接種有待測菌株的2216E平板上加入盧戈氏碘液以檢測瓊膠酶活性，有透明圈出現(xiàn)則結(jié)果為陽性；參照張曉華等的檢測方法對菌株脂酶(吐溫20、40、80)，明膠酶，β-半乳糖苷酶，藻膠酶和過氧化氫酶的活性進(jìn)行檢測[19]；以平板法(報告菌為根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens, A136)檢測菌株是否能夠產(chǎn)生密度感應(yīng)(Quorum sensing, QS)信號分子[20]；參照tang等的檢測方法對菌株的密度感應(yīng)猝滅(Quorum quenching, QQ)活性進(jìn)行檢測[21]；在接種有待測菌株的K板上滴加LBB以檢測其是否具有錳氧化活性，菌落顯藍(lán)色即結(jié)果為陽性[17]。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分類鑒定

根據(jù)不同站位菌落的形態(tài)差異共分離保藏菌株1 200株，對這些菌株提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物酶切圖譜的不同，共402株細(xì)菌完成16S rRNA基因測序。經(jīng)比對后，這402株菌分屬于4個門，65個屬和135個種。四個門分別為變形菌門(Proteobacteria)，共328株，占81.59%；放線菌門(Actinobacteria)，共33株，占8.21%；厚壁菌門(Firmicutes)，共33株，占8.21%；擬桿菌門(Bacteroidetes)，共8株，占1.99%。其中變形菌門的細(xì)菌屬于α-變形菌綱和γ-變形菌綱，菌株數(shù)目和所占比例分別為126、 202和31.34%， 50.24%(見圖1)。由此可見，γ-變形菌綱是分離獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌的主要類群。

屬水平分析發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢屬為鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)、赤桿菌屬(Erythrobacter)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、副球菌屬(Paracoccus)和海桿菌屬(Marinobacter)等(見圖2)。其中，龐蒂亞克亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacterpontiacus)在可培養(yǎng)細(xì)菌中所占比例最高(10.45%)，其他優(yōu)勢種包括南方鹽單胞菌(Halomonasmeridiana)、麥?zhǔn)辖惶鎲伟?Alteromonasmacleodii)、產(chǎn)類胡蘿卜素副球菌(Paracoccuscarotinifaciens)、威尼斯不動桿菌(Acinetobactervenetianus)、檸檬色赤桿菌(Erythrobactercitreus)、昆明假單胞菌(Pseudomonaskunmingensis)和南海沉積物赤桿菌(Erythrobacternanhaisediminis)等(見圖3)，上述優(yōu)勢種均屬于變形菌門。

2.2 不同樣品的可培養(yǎng)細(xì)菌類群比較

4種不同樣品所分離得到的細(xì)菌種類與數(shù)目各異，其中結(jié)核樣品中共分離得到110株菌，分屬于40種；結(jié)核覆蓋的沉積物樣品共分離得到102株菌，分屬于62種；無結(jié)核覆蓋的沉積物樣品共分離得到58株，分屬于34種；水樣分離得到132株，分屬于46種。不同樣品分離得到的最高豐度菌株如表2所示。在4種不同的樣品中，結(jié)核覆蓋的沉積物樣品分離得到的菌株分屬于3個門類，即變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，而除這3個門的細(xì)菌之外，其他3種樣品中還分離得到了擬桿菌門的細(xì)菌(見圖4)。相比其他樣品類型，2種沉積物樣品中分離出較多的放線菌門和厚壁菌門細(xì)菌，而結(jié)核中分離出較多屬于α-變形菌綱的菌株，4種樣品類型中γ-變形菌綱細(xì)菌均占最大比例。

(A：代表無結(jié)核覆蓋的沉積物樣品；B：代表結(jié)核覆蓋的沉積物樣品；C：代表結(jié)核樣品，D代表水樣。A: sediment samples overlaying nodules on its surface； B: sediment samples without overlaying nodules on its surface；C: nodule samples； D: bottom water samples.)

圖4 不同分離樣品各類群所占的比例

Fig.4 The proportion of each group from different samples

通過比較4種樣品的菌株種類，發(fā)現(xiàn)威尼斯不動桿菌(Acinetobactervenetianus)、檸檬色赤桿菌(Erythrobactercitreus)、南海沉積物赤桿菌(Erythrobacternanhaisediminis)、南方鹽單胞菌(Halomonasmeridiana)和龐蒂亞克亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacterpontiacus)在4種樣品中均有分布，推測這五種菌在深海結(jié)核區(qū)的分布較為廣泛。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)檢測

對分離自結(jié)核樣品的110株菌進(jìn)行多種酶學(xué)性質(zhì)和生物活性(QQ和QS)的檢測，結(jié)果表明幾乎所有菌株均具有過氧化氫酶活性，有較高比例的細(xì)菌具有酯酶(吐溫20、40)活性，而具有β-半乳糖苷酶和酯酶(吐溫80)活性的細(xì)菌所占的比例最少(見表3)。通過K板檢測，共發(fā)現(xiàn)24株細(xì)菌具有錳氧化能力(見表4)，并且錳氧化菌株分布于不同的分離樣品中，對研究錳結(jié)核的形成機(jī)制提供了豐富的菌種資源。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

東太平洋結(jié)核區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5、6為γ-變形菌綱可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖7為α-變形菌綱可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹。由構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，錳氧化細(xì)菌均屬于變形菌門，主要分布于α-變形菌綱的交替單胞菌目和假單胞菌目以及γ-變形菌綱的紅桿菌目。

3 討論

通過培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法研究細(xì)菌的生態(tài)功能和群落結(jié)構(gòu)是相互補(bǔ)充的，非培養(yǎng)方法能夠獲得未培養(yǎng)細(xì)菌的序列信息，而使用培養(yǎng)方法可以獲得菌種資源，進(jìn)而研究菌株的生理功能、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和生態(tài)作用。目前對東太平洋結(jié)核區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究多采用非培養(yǎng)的研究方法[5-8,22]，本研究為了盡可能多的獲得該區(qū)域的菌株資源并分析其多樣性，在分離過程中采用了3個溫度梯度，并使用了不同的培養(yǎng)基，其中2216E為富營養(yǎng)培養(yǎng)基，R2A和SPG-4為寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，K板為錳氧化菌株篩選培養(yǎng)基。采用 R2A和SPG-4共分離得到細(xì)菌119株，50種；K板分離得到35株，14種；2216E分離得到248株，103種；除2216E外的3種培養(yǎng)基所分離的菌株中發(fā)現(xiàn)有32種未在2216E平板中分離得到。因此相比以單種常用培養(yǎng)基(如2216E)對可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用多種培養(yǎng)基能分離出更多的菌種資源。

結(jié)核區(qū)所有樣品所分離獲得的菌株中，γ-變形菌綱的細(xì)菌數(shù)量最多，占所有分離菌株的49.75%，其次是α-變形菌綱，占所有分離菌株的31.34%。該結(jié)果與張海艷等[23]使用培養(yǎng)方法分離東太平洋結(jié)核區(qū)沉積物樣品的結(jié)果類似，占最高比例的類群也為γ-變形菌綱細(xì)菌。屬水平上，假單胞菌屬，交替單胞菌屬，赤桿菌屬，副球菌屬，亞硫酸鹽桿菌，鹽單胞菌屬，海桿菌屬[24]等優(yōu)勢屬均曾經(jīng)報道過具有錳氧化能力，并且其中部分菌種參與錳結(jié)核的形成。種水平上，龐蒂亞克亞硫酸鹽桿菌在所分離菌株中所占比例最高，通過實(shí)驗驗證其具有錳氧化能力，并且該菌種具有氧化亞硫酸鹽的能力[25]，因此其很可能參與該地區(qū)的錳氧化和硫循環(huán)。同時，麥?zhǔn)辖惶鎲伟湍虾３练e物赤桿菌所占的比例也較高，并且其均具有錳氧化能力。

Xu等[5]以培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法研究結(jié)核區(qū)微生物多樣性時，使用培養(yǎng)方法僅獲得了6個屬的細(xì)菌，然而我們采用不同培養(yǎng)基分離出65個屬的細(xì)菌，其中鹽單胞菌為可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢類群，與Xu等[5]的研究結(jié)果相一致。鹽單胞菌屬具有較強(qiáng)的鹽耐受性，并有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在有氧條件下，能以氧氣作為電子受體，而無氧條件下部分菌株則以硝酸鹽作為電子受體。彭亞林等[26]通過實(shí)驗證實(shí)了一株鹽單胞菌有很強(qiáng)的錳耐受和錳氧化能力，因此推測鹽單胞菌能夠參與結(jié)核區(qū)的有機(jī)物和金屬離子的循環(huán)。除鹽單胞菌外，假單胞菌屬在本研究中也占有較大的比例，與Xu等[6]使用非培養(yǎng)方法的結(jié)果類似。假單胞菌屬在海洋中分布極為廣泛，代謝類型多樣，能夠形成生物被膜并利用多種有機(jī)物作為碳源和電子供體。來自不同地區(qū)的許多假單胞菌均具有錳氧化能力，其中對惡臭假單胞菌GB-1[27](Pseudomonasputida)錳氧化活性的研究最為透徹，因此其在錳循環(huán)中應(yīng)發(fā)揮一定的作用。

對4種不同樣品所分離菌株的群落組成進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明結(jié)核覆蓋的沉積物樣品的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性比結(jié)核樣品高。 Wu等[8]通過16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)對結(jié)核樣品和無結(jié)核覆蓋的沉積物樣品進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉積物中所含的物種數(shù)比結(jié)核中的多，Tully等[28]對南太平洋環(huán)流區(qū)的結(jié)核樣品進(jìn)行高通量測序后也發(fā)現(xiàn)結(jié)核覆蓋沉積物的細(xì)菌多樣性比結(jié)核內(nèi)部高。由此可見，通過培養(yǎng)方法獲得的不同樣品細(xì)菌多樣性與非培養(yǎng)方法結(jié)果類似，而推測其原因是由于沉積物中潛在的物質(zhì)能量來源支持了更多微生物的生存，除此之外，結(jié)核內(nèi)部較高的金屬離子濃度也可能抑制某些敏感細(xì)菌的生長。

4種不同的樣品類型均能夠分離得到錳氧化菌，表明東太平洋多金屬結(jié)核區(qū)錳氧化菌分布廣泛。分離獲得的24株錳氧化菌中，抑云玫瑰變色菌(Roseovariusnubinhibens)、星箭頭菌(Sagittulastellata)和南極中山菌(Zhongshaniaantarctica)首次發(fā)現(xiàn)具有錳氧化活性，而其他菌株所在的種屬均已有報道具有錳氧化能力[29]，對東太平洋結(jié)核區(qū)更深入的研究可能發(fā)現(xiàn)更多具有錳氧化活性的菌株。由錳氧化細(xì)菌形成的錳結(jié)核能富集周圍環(huán)境中的其他微量元素，包括鈷、銅、鎳和錳等，因此其在微量元素的循環(huán)中也起到重要作用[9]。此外，錳結(jié)核能夠裂解周圍腐殖質(zhì)產(chǎn)生的低分子量有機(jī)物，從而促進(jìn)該地區(qū)微生物的生長和物質(zhì)循環(huán)[30]。對結(jié)核樣品進(jìn)行酶學(xué)活性檢測發(fā)現(xiàn)，具有錳氧化活性的游海假交替單胞菌和產(chǎn)黑假交替單胞菌具有檢測的所有酶學(xué)活性，進(jìn)一步印證了假交替單胞菌代謝底物的廣泛性。相對于沉積物樣品，Wu等[8]在沉積物與結(jié)核的群落結(jié)構(gòu)比較中發(fā)現(xiàn)有且僅有在結(jié)核樣品存在的菌株中，假交替單胞菌和交替單胞菌豐度較高，因此該屬菌株在結(jié)核的形成中很可能發(fā)揮重要作用。在實(shí)驗中共檢測出13株細(xì)菌具有QS活性，QS能夠影響生物被膜的形成[31]，而Wang等[1]認(rèn)為生物被膜與結(jié)核的形成有關(guān)，從而這些具有QS活性的菌株也可能在結(jié)核的形成過程中發(fā)揮一定的作用。

由構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，γ-變形菌綱可分為6個分類單元，其中南極中山菌(Zhongshania antarctica)獨(dú)立形成1個分類單元，與其他菌株的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)中，共有5個分類單元，其中紅螺菌目(Rhodospirillales)獨(dú)立形成一個分類單元，與其他菌株的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，從系統(tǒng)進(jìn)化樹中也可以看出不同類群的菌株中均含有錳氧化細(xì)菌。

本實(shí)驗較為詳細(xì)地對東太平洋多金屬結(jié)核區(qū)不同樣品進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)，表明東太平洋結(jié)核區(qū)擁有豐富的微生物資源；對結(jié)核樣品分離出的菌株進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的檢測，對理解結(jié)核區(qū)微生物的基礎(chǔ)代謝類型奠定了基礎(chǔ)；具有錳氧化能力菌株的鑒定及活性檢測有助于了解結(jié)核的形成過程。然而至今為止，結(jié)核形成的具體原因還是未知的，需要繼續(xù)探索來解開這個謎團(tuán)。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Diversity of Culturable Bacteria in the East Pacific Nodule Province

CHENG Jing-Guang, YU Min, DAI Xiao-Feng, ZHANG Zeng-Hu, LIU Na,AN Ke, SHI Xiao-Chong, ZHANG Xiao-Hua

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The east Pacific nodule province, which is considered as one of the most commercially important nodule areas of the global ocean, is located in the northeast Pacific Ocean. There are plenty of polymetallic nodules on the seabed. The mechanism of formation of manganese nodules is still unclear, but a growing amount of evidences show that nodules can not be formed without bacteria. To investigate the diversity of culturable bacteria in the east pacific nodule province, four kinds of samples were collected during the cruise “DA YANG 29”, including nodule samples, sediment samples overlaying nodules on its surface, sedment samples without overlaying nodules on its surface and bottom seawater samples. A totol of 1 200 bacterial strains were isolated and conserved, and 402 strains were identified using 16S rRNA gene sequencing, which were composed of 4 bacterial phyla, 65 genera and 135 species. The results turned out that the microbial resources in this place were abundant and showed a great diversity. The 4 phyla included Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes, accounting for 81.59%, 8.21%, 8.21% and 1.99% of the totol culturable bacterial community, respectively. Only bacterial strains belonged toα-Proteobacteriaandγ-Proteobacteriawere isolated in this study. In Genus level,Halomonas,PseudomonasandSulfitobacterwere dominant, while the dominant species includedSulfitobacterpontiacus,Halomonasmeridiana,Alteromonasmacleodii,Paracoccuscarotinifaciensetc. The proportion of Actinobacteria and Firmicutes were higher from sediment samples than that of the other two kinds of samples, while the pencentage ofα-proteobacteriawas higher from nodule samples. Isolates from γ-proteobacteria was abundant in all the four kinds of samples. In addition, the enzymatic properties of isolates from the nodule sample were studied. The proportions of bacteria containing catalase or lipase (hydrolysis of Tween20 or Tween40) were high, in contrast, bacteria containing β-galactosidase or lipase (hydrolysis of Tween 80) had a lower proportion. Some unreported manganese oxidizing bacteria were also isolated from different samples, includingRoseovariusnubinhibens,Sagittulastellata,Psychrobacteraquaticus,Zhongshaniaantarctica, other manganese oxidizing bacteria have only been reported in the genus level. All the isolates which had manganese oxidizing activity belonged to Proteobacteria, in the neighbour-joining phylogenetic tree using 16S rRNA gene sequences. In brief, the culturable bacteria were abundant from different samples of the nodule province, the isolation and identification of manganese oxidizing bacteria have significant roles to study the mechanism of polymetallic nodule’s formation and the exploitation of marine minerals.

the east Pacific nodule province; culturable bacteria; enzymatic properties; manganese oxidizing bacteria; 16S rRNA gene

中國大洋協(xié)會項目(DY125-15-R-03)資助 Supported by China Ocean Mineral Resources R & D Association

2016-07-22；

2016-11-07

程景廣(1990-), 男,碩士生, 主要從事海洋微生物研究。 E-mail: chengjingguang1102@qq.com

?? 通訊作者：E-mail: yumin@ouc.edu.cn

Q938.8

A

1672-5174(2017)06-042-11

10.16441/j.cnki.hdxb.20160247

程景廣，于敏，戴曉風(fēng)，等. 東太平洋結(jié)核區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(6): 42-52.

CHENG Jing-Guang, YU Min, DAI Xiao-Feng, et al. Diversity of culturable bacteria in the east Pacific nodule province [J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6): 42-52.