閆路路， 王昭萍??， 蘇家齊， 閆喜武， 于瑞海(.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 6600；.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南海資源開發(fā)與保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 5000；.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 60)

熊本牡蠣(♀)×葡萄牙牡蠣(♂)雜交子代的營(yíng)養(yǎng)成分和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)分析?

閆路路1， 王昭萍1??， 蘇家齊2， 閆喜武3， 于瑞海1
(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南海資源開發(fā)與保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510300；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023)

本研究分析了熊本牡蠣(♀)×葡萄牙牡蠣(♂)雜交子代和自繁子代的基本營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸含量、脂肪酸成分和脂肪相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，雜交子代牡蠣的脂肪含量為(13.66±1.99)%，顯著高于自繁子代；脂肪酸成分分析中，雜交子代ω3/ω6多不飽和脂肪酸的比例為4.18±0.62，高于自繁子代；DHA含量為(16.73±3.35)%，高于自繁子代但與自繁子代的差異不顯著，EPA含量介于2種自繁子代之間；在脂肪相關(guān)基因表達(dá)方面，PPARα、INSIG和SREBP基因在部分可食用組織中的表達(dá)結(jié)果與子代中脂肪含量比較的結(jié)果相吻合雜交子代的脂肪含量顯著高于自繁子代的脂肪含量。結(jié)果表明，熊本牡蠣與葡萄牙牡蠣的雜交子代在脂肪含量和脂肪酸結(jié)構(gòu)上存在一定的雜種優(yōu)勢(shì)。

熊本牡蠣；葡萄牙牡蠣；雜交牡蠣；營(yíng)養(yǎng)成分；基因表達(dá)

牡蠣屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)珍珠貝目(Pterioida)牡蠣科(Ostreidae)，為全球性分布類群；是一種重要的海洋生物資源，更是世界上最重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)類群之一，其養(yǎng)殖總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量在所有的貝類養(yǎng)殖種類中位居首位[1]。牡蠣肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸、微量元素和礦物質(zhì)等，具有極高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。同時(shí)，很多學(xué)者在不同牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分方面做了較多的研究，如長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[2]、近江牡蠣(C.rivularis)[3]、褶牡蠣(C.plicatula)[4]、紅樹林牡蠣(C.corteziensis)[5]等，這為牡蠣產(chǎn)業(yè)尤其是養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供了較豐富的實(shí)踐參考和理論支持。

雜交育種在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用十分廣泛，主要用于水產(chǎn)動(dòng)物育種中提高生長(zhǎng)速度、抗病力、抗逆性、含肉率、飼料轉(zhuǎn)化率、成活率以及改良肉質(zhì)、創(chuàng)造新品種、保存和發(fā)展有益的突變體、搶救瀕于滅絕的良種等[6]。近年來(lái)貝類雜交逐漸得到各國(guó)育種學(xué)家的重視并取得了一定的成果，牡蠣雜交可以促進(jìn)種間基因交流，引入異種有利基因，形成優(yōu)勢(shì)新物種[7]。近年來(lái)，學(xué)者們開展了多種牡蠣的種間雜交組合，如長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)×葡萄牙牡蠣(C.angulata)[8]、有明牡蠣(C.ariakensis)×熊本牡蠣(C.sikamea)[9]、長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)×美洲牡蠣(C.virginica)[10]等。并且發(fā)現(xiàn)部分雜交組合的牡蠣如香港牡蠣(C.hongkongensis)×葡萄牙牡蠣(C.angulata)[11]，熊本牡蠣(C.sikamea)×葡萄牙牡蠣(C.angulata)(待發(fā)表)在生長(zhǎng)、存活等方面存在一定的雜交優(yōu)勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)牡蠣雜交的研究主要集中在生長(zhǎng)、存活、對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性以及育性等方面，而相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)、生理調(diào)控和基因水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面的研究還處于空白，限制了牡蠣雜交技術(shù)的發(fā)展提高和應(yīng)用推廣。

本文對(duì)一齡的葡萄牙牡蠣、熊本牡蠣以及熊本牡蠣(♀)與葡萄牙牡蠣(♂)雜交獲得的子一代雜交牡蠣進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)成分分析，分別比較了這3種牡蠣的基本營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸含量、脂肪酸成分。另外通過(guò)熒光定量PCR，檢測(cè)了3種牡蠣組織中的脂代謝相關(guān)基因表達(dá)。本研究結(jié)果將為牡蠣雜交育種方向上的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣的雜交子代與自繁子代為本實(shí)驗(yàn)室于2014年7月至2015年7月間培育的一齡牡蠣，在北海育苗場(chǎng)進(jìn)行養(yǎng)成。本實(shí)驗(yàn)用的一齡熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和雜交子代牡蠣的殼高分別為(35.79±2.00)、(58.03±2.00)和(44.46±2.00)cm。

1.2 樣品處理

將每種30個(gè)解剖，整體取出、搗碎、混勻，一部分低溫烘干，105℃繼續(xù)烘干，密封保存，并置于干燥器中，用于除糖原外的一般營(yíng)養(yǎng)成分分析和氨基酸測(cè)定；另一部分冷凍干燥，用于糖原和脂肪酸測(cè)定。另外分別解剖3個(gè)牡蠣，按照外套膜、性腺、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán)4種組織進(jìn)行解剖，分別裝入凍存管中，迅速冷凍在液氮中，于-80℃冰箱中冷凍保存，用于脂肪相關(guān)基因的絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中所有牡蠣均根據(jù)Haiyan Wang等[12]報(bào)道的方法進(jìn)行物種鑒定，確認(rèn)后方可進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)與定量實(shí)驗(yàn)。

1.3 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定方法

依據(jù)南京建成考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒說(shuō)明書，測(cè)定牡蠣中總蛋白；依據(jù)GB/T 5009.6-2003，索氏提取法測(cè)定粗脂肪；依據(jù)GB 5009.3-2010，105℃常壓干燥法測(cè)定水分；依據(jù)蒽酮硫酸法測(cè)定糖原；依據(jù)GB/T 5009.124-2003，使用日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸成分；樣品經(jīng)皂化、甲酯化后，采用島津GC-2010氣相色譜測(cè)定脂肪酸。

根據(jù)FAO/WHO(1981)修訂的人體必需氨基酸均衡模式進(jìn)行比較，氨基酸評(píng)分指待測(cè)蛋白質(zhì)中必需氨基酸與理想氨基酸或參考蛋白質(zhì)中相應(yīng)的必須氨基酸的比值[13]。計(jì)算公式為：AAS=食物中每克蛋白質(zhì)中氨基酸含量(mg)/理想模式或參考蛋白質(zhì)中每克蛋白質(zhì)中氨基酸含量(mg)×100%。

1.4 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

用Trizol Reagent試劑分別提取牡蠣4個(gè)組織中的總RNA，并用DNase I去除DNA。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，確保無(wú)彌散現(xiàn)象。用NonoDrop2000測(cè)定總RNA的濃度和純度，A260/280介于1.9～2.1之間的RNA認(rèn)為純度合格。取900 ng總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書方法合成cDNA第一鏈，分裝保存于-20℃。

1.5 引物來(lái)源

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所得的胰島素誘導(dǎo)基因(INSIG)序列設(shè)計(jì)熒光定量引物。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因(SREBP)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體基因(PPARα)引物序列來(lái)自于文獻(xiàn)[14-15](見表1)。

1.6 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品制備

將純化的各基因目的片段與Peasy-T1克隆載體鏈接后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)單克隆質(zhì)粒。挑取單克隆白斑，37℃搖菌16h后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(g/μL)/質(zhì)粒分子量(g/mol)，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。按終濃度為109、108、107、106、105和104copies/μL分別進(jìn)行稀釋，并作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)驗(yàn)所用儀器為Roche羅氏LightCycler?480熒光定量PCR儀，數(shù)據(jù)分析采用羅氏公司提供的二階導(dǎo)數(shù)法進(jìn)行絕對(duì)定量分析。

本實(shí)驗(yàn)采用TaKaRa公司的提供的SYBR? Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20μL，其中模板2 μL，上下游引物各0.8 μL(終濃度0.4 μmol/L)，SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10 μL，dH2O滅菌水6.4 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線檢驗(yàn)，確保產(chǎn)物為單峰。并將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確保產(chǎn)物只有單一條帶。

1.8 數(shù)據(jù)處理

各測(cè)定項(xiàng)目數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,不同實(shí)驗(yàn)組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)差異性的比較采用單因素方差分析方法(Duncan LSD)，差異顯著性設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分含量比較

由表2可知，熊本牡蠣(SS)、葡萄牙牡蠣(AA)和它們的雜交子代(SA)的蛋白含量均占干重的49%以上；脂肪在雜交子代中含量最高，占干重的(13.66±1.99)%，顯著高于熊本牡蠣(7.56±1.17)%和葡萄牙牡蠣(5.94±1.88)%，表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì)(P<0.05)；3種牡蠣的糖原含量在4.94%～5.84%之間，葡萄牙牡蠣糖原含量最高為(5.84±0.85)%，雜交子代介于2種自繁子代之間，三者沒有顯著差異；水分含量在雜交子代SA中含量最低，為(74.66±3.86)%，低于熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣但差異不顯著。

注：表中總蛋白、粗脂肪、糖原含量為干重百分比；水分為濕重百分比；*表示差異顯著，P<0.05，下同。SS：熊本牡蠣；AA：葡萄牙牡蠣；SA：熊本牡蠣與葡萄牙牡蠣的雜交子代，下同。

Note:the contents of protein,fat and glycogen are the percentage of dry weight;moisture composition is the percentage of wet weight;*means significant test,P<0.05,the same below.SS meansC.sikamea,AA meansC.angulata,SA was their hybrid oyster, the same below.

2.2 氨基酸組成分析

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣及其雜交子代整體的氨基酸含量，結(jié)果詳見表3。由表3可見3種牡蠣氨基酸含量較為豐富，經(jīng)LSD多重分析發(fā)現(xiàn)3種牡蠣氨基酸含量無(wú)顯著差異，總氨基酸含量在51.89%～54.56%之間，必需氨基酸含量均占到19.85%以上，非必需氨基酸含量在26.58%～27.91%之間，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值均在70%以上，超過(guò)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)的60%。

實(shí)驗(yàn)根據(jù)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，對(duì)除色氨酸外的7種必需氨基酸進(jìn)行評(píng)分(見表4)。除蛋氨酸+半胱氨酸評(píng)分低于100，其他氨基酸評(píng)分均在100以上，最高的是賴氨酸，在163.80～183.30之間。其中，葡萄牙牡蠣的異亮氨酸評(píng)分為135.00±1.08，顯著高于其他2組(P<0.05)。由以上結(jié)果判定，此3種牡蠣在氨基酸含量和氨基酸組成上均沒有顯著差異，且都屬于優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)食物。

注：*表示差異顯著。*means significant test.

2.3 脂肪酸組成分析

由基本營(yíng)養(yǎng)成分分析可知，雜交子代SA在脂肪含量上表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步探索雜交子代與親本子代在脂肪酸中的差異，于是本實(shí)驗(yàn)對(duì)熊本牡蠣SS、葡萄牙牡蠣AA和雜交子代SA在脂肪酸組成成分及含量方面進(jìn)行分析。

從脂肪酸組成看，熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣的雜交子代和自繁子代中均含有19種脂肪酸(見表5)。飽和脂肪酸(SFA)5種，占總脂肪酸的32.38%～36.42%。不飽和脂肪酸(UFA)14種，在脂肪酸中占主導(dǎo)地位，含量在63.28%～66.76%之間，其中單不飽和脂肪酸(MUFA)4種，占脂肪酸含量的22.75%～24.50%；多不飽和脂肪酸(PUFA)10種，占40.16%～42.56%。在5種飽和脂肪酸中，碳原子數(shù)目較少的軟脂酸(16:0)和硬脂酸(18:0)占主導(dǎo)地位，雜交子代中軟脂酸(16:0)含量高于自繁子代。在單不飽和脂肪酸中，花生一烯酸(20:1)和油酸(18:1)含量最高，雜交子代中花生一烯酸(20:1)含量介于2種自繁子代之間，無(wú)顯著差異；油酸(18:1)含量高于2種自繁子代，并且顯著高于葡萄牙牡蠣(P<0.05)。10種不飽和脂肪酸包括4種ω6族脂肪酸，5種ω3族脂肪酸。ω6脂肪酸主要從植物油和肉之中獲得，ω3主要從海產(chǎn)品中獲得[16]。ω3和ω6脂肪攝入的失衡，即ω6/ω3多不飽和脂肪酸的比例過(guò)高，會(huì)造成人體內(nèi)環(huán)境紊亂，引發(fā)疾病[17]。本實(shí)驗(yàn)中，雜交子代的ω3/ω6多不飽和脂肪酸的比例為4.18±0.62，高于熊本牡蠣(3.86±0.01)和葡萄牙牡蠣(3.14±0.07)，同時(shí)雜交子代中ω6族脂肪酸含量顯著低于葡萄牙牡蠣(P<0.05)?？梢钥闯觯s交子代的多不飽和脂肪酸營(yíng)養(yǎng)成分(ω3/ω6脂肪酸比例)更適合人類對(duì)ω3脂肪酸的攝入，可以防止攝入過(guò)多的ω6脂肪酸而導(dǎo)致人體內(nèi)環(huán)境的紊亂。

在ω3族脂肪酸中，含量最高的是EPA(20:5ω3)和DHA(22:6ω3)。牡蠣雜交子代中DHA含量高于自繁子代牡蠣，EPA含量介于2種自繁子代之間，同時(shí)DHA與EPA的總和在雜交子代牡蠣脂肪酸中占(26.03±4.32)%，僅次于熊本牡蠣的(26.15±0.74)%，含量最低的為葡萄牙牡蠣，占(21.46±1.80)%。由于DHA和EPA對(duì)心腦血管等疾病有一定的預(yù)防和改善作用，所以它們經(jīng)常作為衡量脂肪價(jià)值的重要指標(biāo)[3,18]。實(shí)驗(yàn)顯示，3種牡蠣不飽和脂肪酸含量均較高，有益于心血管疾病患者和其他高風(fēng)險(xiǎn)人群(如中老年人)，從補(bǔ)充EPA和DHA角度考慮，熊本牡蠣和雜交子代優(yōu)于葡萄牙牡蠣。由于3種牡蠣在相同的海區(qū)育成，所以可以排除由于攝取了不同營(yíng)養(yǎng)成分的藻類(如硅藻類含有大量EPA，鞭毛藻類含有大量DHA和EPA[19-21])而導(dǎo)致的脂肪酸差異，推測(cè)這種差異有可能來(lái)自于不同種牡蠣間固有的物種特異性。雜交子代的EPA含量接近于熊本牡蠣，高于葡萄牙牡蠣，并且DHA含量高于熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣，這可能是由于雜交子代在EPA的合成方面遺傳了母本熊本牡蠣高EPA的特性，同時(shí)在DHA含量上表現(xiàn)出了很好的雜種優(yōu)勢(shì)。

注：SFA：飽和脂肪酸；UFO：不飽和脂肪酸；MUFA：?jiǎn)尾伙柡椭舅?；PUFA：多不飽和脂肪酸。不同的上標(biāo)字母代表差異顯著(P<0.05)。

Note:SFA:saturated fatty acid;UFO:unsaturated fatty acid;MUFA:monounsaturated fatty acid;PUFA:polyunsaturated fatty acids.Means with different letters denote significant differences atP<0.05.

2.4 脂肪相關(guān)基因絕對(duì)表達(dá)量分析

由粗脂肪測(cè)定和脂肪酸成分分析可知，3種牡蠣在脂肪含量和脂肪酸組成上確實(shí)存在一定差異，為探究這一差異在牡蠣各組織中的轉(zhuǎn)錄情況，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)3種脂肪相關(guān)基因，即過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體基因(PPARα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因(SREBP1)和基因胰島素誘導(dǎo)基因(INSIG)，分別進(jìn)行絕對(duì)熒光定量。實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序序列均能比對(duì)到目的基因的注釋信息，各基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.990。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量，3個(gè)基因在不同種牡蠣的主要可食用組織(閉殼肌、外套膜、性腺)及內(nèi)臟團(tuán)中的基礎(chǔ)表達(dá)量存在顯著差異(見圖1)。

PPARα是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟、心臟、肌肉和巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡中起重要作用[22]。PPARα可以激活脂肪酸新陳代謝，刺激糖質(zhì)新生和酮體的合成，并且能夠控制脂蛋白的合成[23]。有研究表明，PPARα可以促進(jìn)生物體脂肪酸的β氧化過(guò)程[24]，降低脂肪積累。而在腸組織中，PPARα可以降低膽固醇的酯化，抑制乳糜微粒的生成，并增加高密度脂蛋白(High-density lipoprotein, HDL)含量[25]。本實(shí)驗(yàn)中，雜交子代的外套膜和閉殼肌中PPARα的表達(dá)量最低，顯著低于熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣，即SA中PPARα表達(dá)量低于自繁子代，則在這些組織中受PPARα介導(dǎo)的脂肪酸β氧化作用也低于自繁子代，從而自繁子代中的脂肪酸可以適量積累?？傮w來(lái)說(shuō)，牡蠣中主要可食用部分外套膜、性腺、閉殼肌的重量占牡蠣軟體部重量的絕大部分，這與雜交子代牡蠣SA的粗脂肪含量顯著高于自繁子代SS和AA這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。而在內(nèi)臟團(tuán)中，雜交子代的PPARα的表達(dá)量最高，顯著高于熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣，表明了雜交子代可能在脂肪的消化吸收過(guò)程中，轉(zhuǎn)化HDL的能力要高于自繁子代。與哺乳動(dòng)物等高等動(dòng)物不同，水生生物如魚類中血漿HDL所占的比例最大、濃度最高，低密度脂蛋白濃度明顯低于HDL。血漿中高濃度的HDL表明外周組織向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的速率較快[26]。在對(duì)蝦血淋巴中只存在HDL，不含低密度脂蛋白[27]。雜交子代在內(nèi)臟團(tuán)中PPARα的高表達(dá)可能表明其消化道對(duì)脂肪的吸收轉(zhuǎn)化要高于自繁子代，這一結(jié)論還有待于今后的進(jìn)一步研究。

INSIG-SCAP-SREBP通路是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成調(diào)控的重要通路，其中SREBP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，SCAP能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與SREBP結(jié)合構(gòu)成SCAP-SREBP復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)固醇濃度降低時(shí)，SCAP可將SREBPs運(yùn)載至高爾基體，經(jīng)過(guò)兩步水解作用釋放出具有活性的N末端轉(zhuǎn)錄因子片段，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活其下游靶基因，即脂肪合成相關(guān)酶基因，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄作用，促進(jìn)脂質(zhì)的合成與沉積[28-32]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)固醇水平升高時(shí)，INSIG與SREBP和SCAP相互作用，以INSIG-SREBP-SCAP復(fù)合物形式存儲(chǔ)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[33]，即阻止了SREBP向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，不能激活下游脂肪合成相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)中牡蠣閉殼肌中SREBP基因在SA、SS、AA的比值為2.8∶1.5∶1.0，同時(shí)雜交子代牡蠣閉殼肌中SREBP基因表達(dá)量顯著高于SS和AA。牡蠣閉殼肌中INSIG基因在SA、SS、AA的比值為2.2∶2.0∶1.0。雜交子代閉殼肌中SREBP基因的表達(dá)量是SS的1.83倍，AA的2.81倍，且均存在顯著差異。雜交子代牡蠣閉殼肌中INSIG基因的表達(dá)量是SS的1.10倍，AA的2.19倍，雖INSIG同SREBP一樣在SA閉殼肌中的表達(dá)量高于SS和AA，但從比值來(lái)看，SREBP在SA與自繁子代的表達(dá)倍數(shù)較INSIG在SA與自繁子代的表達(dá)倍數(shù)更占優(yōu)勢(shì)。這與雜交子代牡蠣中粗脂肪含量顯著高于自繁子代的結(jié)果相吻合。

SS外套膜中SREBP基因表達(dá)量均顯著高于SA和AA，并且發(fā)現(xiàn)對(duì)SREBP有一定抑制作用的INSIG基因表達(dá)量也顯著高于SA和AA。推測(cè)當(dāng)SS中SREBP基因過(guò)表達(dá)時(shí)，SREBP本應(yīng)激活下游脂合成相關(guān)基因，從而合成大量脂質(zhì)，可INSIG基因表達(dá)量也顯著高于SA和AA，從而抑制了SS中SREBP向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止SS合成過(guò)多的脂肪酸。SA性腺中SREBP基因表達(dá)量顯著低于SS和AA，INSIG基因表達(dá)量顯著高于SS和AA，抑制脂質(zhì)合成，這與SA總體粗脂肪含量顯著高于SS和AA的結(jié)果相反，推測(cè)維持生物體內(nèi)脂類平衡的基因有很多，INSIG-SCAP-SREBP通路是其中的一種途徑，而在生物體內(nèi)還存在其他途徑，如不飽和脂肪酸生物合成通路(map01040)[34]，其他途徑與INSIG-SCAP-SREBP通路共同作用、相互協(xié)作，從而維持牡蠣體內(nèi)脂質(zhì)的平衡。

3 結(jié)語(yǔ)

熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和它們的雜交子代在脂肪的合成和積累上存在顯著差異，這一顯著差異不僅體現(xiàn)在粗脂肪和脂肪酸含量的不同，還體現(xiàn)在脂肪合成和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的不同；雜交子代在脂肪含量、PUFAω3/PUFAω6、DHA和EPA含量上存在雜種優(yōu)勢(shì)，可以為人體提供更為均衡的營(yíng)養(yǎng)，具有一定的養(yǎng)殖潛力和應(yīng)用價(jià)值。

[1] 張躍環(huán), 王昭萍, 喻子牛, 等. 養(yǎng)殖牡蠣種間雜交的研究概況與最新進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 3(4): 621-623. Zhang Yuehuan, Wang Zhaoping, Yu Ziniu, et al. A recent review of interspecific hybridization among cultivated oysters [J]. Journal of Fisheries of China, 2014, 3(4): 621-623.

[2] 劉鵬超, 闕華勇, 張國(guó)范. 長(zhǎng)牡蠣早期胚胎發(fā)育中脂肪酸和氨基酸組成變化的研究[J]. 海洋科學(xué), 2011, 35(10): 16-21. Liu Phengchao, QueHuayong, Zhang Guofan. Changes in fatty acid and amino acid composition during early development of the Pacific oyster (Crassostreagigas) [J]. Marine Sciences, 2011, 35(10): 16-21.

[3] 劉書成, 李德濤, 高加龍, 等. 近江牡蠣等3種貝類的脂類成分分析 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2009, 33(4): 666-671. Liu Shucheng, Li Detao, GaoJialong, et al. Lipid components ofOstrearivularis,paphiaundulataandpinctadamartensii[J]. Journal of Fisheries of China, 2009, 33(4): 666-671.

[4] 陳慧斌, 王梅英, 王莉. 褶牡蠣成分組成及營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)研究 [J]. 寧德師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 21(4): 342-345. Chen Huibin, Wang Meiying, Wang Li. Study on composition and nutrition evaluation ofCrassostreaplicatula[J]. Journal of Ningde Normal University (Natural Science), 2009, 21(4): 342-345.

[5] Rivero-Rodríguez S, Beaumont A R, Lora-Vilchis M C. The effect of microalgal diets on growth, biochemical composition, and fatty acid profile ofCrassostreacorteziensis(Hertlein) juveniles [J]. Aquaculture, 2007, 263(1-4): 199-210.

[6] 蘇家齊. 葡萄牙牡蠣與熊本牡蠣、僧帽牡蠣的種間雜交研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2015. Su Jiaqi. Hybridization BetweenCrassostreaangulataandC.sikamea, Saccostrea Cucullata[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2015.

[7] 張躍環(huán), 王昭萍, 閆喜武, 等. 太平洋牡蠣與近江牡蠣的種間雜交 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012, 36(8): 1215-1224. Zhang Yuehuan, Wang Zhaoping, Yan Xiwu, et al. Interspecific hybridization between two oystersCrassostreagigasandC.ariakensis[J]. Journal of Fisheries of China, 2012, 36(8): 1215-1224.

[8] Soletchnik P, Huvet A, Moine O L, et al. A comparative field study of growth, survival and reproduction ofCrassostreagigas,C.angulataand their hybrids [J]. Aquatic Living Resources, 2002, 15(4): 243-250.

[9] Xu F, Zhang G, Liu X, et al. Laboratory Hybridization betweenCrassostreaariakensisandC.Sikamea[J]. Journal of Shellfish Research, 2009, 28(3): 453-458.

[10] Gaffney P M, Allen S K. Hybridization among Crassostrea species: a review [J]. Aquaculture, 1993, 116(1): 1-13.

[11] Zhang Yuehuan, Zhang Yang, Li Jun,et al. Phenotypic trait ofCrassostreahongkongensis♀×C.angulata♂ hybrids in southern China [J]. Aquaculture Research, 2016, 47(11): 3399-3409.

[12] Wang H, Guo X. Identification ofCrassostreaariakensisand related oysters by multiplex species-specific PCR [J]. Journal of Shellfish Research, 2008, 27(3): 481-487.

[13] 董黎明, 汪蘋, 李金穗, 等. 異養(yǎng)小球藻主要營(yíng)養(yǎng)成分及氨基酸組成分析 [J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3): 232-237. Dong Liming, Wang Ping, Li Jinhui, et al. Analysis of Nutritional Components and Amino Acid Composition of HeterotrophicChlorellasp[J]. Food Science, 2012, 33(3): 232-237.

[14] Vogeler S, Galloway T S, Lyons B P, et al. The nuclear receptor gene family in the Pacific oyster,Crassostreagigas, contains a novel subfamily group [J]. BMC Genomics, 2014, 15: 369-384.

[15] 封利穎. 蝦夷扇貝IGFBP5、IGF2BP2基因克隆、表達(dá)分析及與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩查[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2013. Feng Liying. IGFBP5 and IGF2BP2 Genes in Yesso Scallop (Patinopectenyessoensis): Molecular Cloning, Expression Analysis and Identification of SNPs Associated with Growth Traits[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2013.

[16] LU Wang. ω3和ω6脂肪酸在體脂增加及肥胖發(fā)展中的作用 [J]. 中華高血壓雜志, 2015, 23(1): 7-15. Wang Lu. ω3 andω6 fatty acids: role in body fat gain and development of obesity [J]. Chin J Hypertens, 2015, 23(1): 7-15.

[17] 伍金華, 周克元. 調(diào)節(jié)食物中ω-6和ω-3脂肪酸合適比例研究的進(jìn)展 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 2006, 33(2): 70-73. Wu Jinhua, Zhou Keyuan. Research progress of adjusting ω-6 and ω-3 fatty acids in the food in anappropriate proportion [J]. Foreign Medical Sciences(Section of Hygiene), 2006, 33(2): 70-73.

[18] 李閱兵, 孫立春, 劉承初, 等. 幾種海水和淡水貝類的大宗營(yíng)養(yǎng)成分比較研究 [J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 21(2): 297-303. Li Bingyue, Sun Lichun, Liu Chengchu, et al. Comparison of macronutrient components of several marine and freshwater shellfish [J]. Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(2): 297-303.

[19] Li X, Xiao F, Han L, et al. Fatty acids of some algae from the Bohai Sea [J]. Phytochemistry， 2002, 59(2): 157-161.

[20] Volkman J K, Jeffrey S W, Nichols P D, et al. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1989, 128(3): 219-240.

[21] Shen Y N, Zhang D L, Zhang B, et al. A baseline study on lipid and fatty acid composition in the pearl oyster,Pinctadafucata[J]. Aquaculture International, 2016, 24(2): 523-536.

[22] Tachibana K, Kobayashi Y, Tanaka T, et al. Gene expression profiling of potential peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) target genes in human hepatoblastoma cell lines inducibly expressing different PPAR isoforms [J]. Nuclear Receptor, 2005, 3(1): 1-17.

[23] Mandard S, Müller M, Kersten S. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha target genes [J]. Ppar Research, 2010, 61(4): 393-416.

[24] Furumoto H, Nanthirudjanar T, Hirata T, et al. Dietary effects of oxidized eicosapentaenoic acid (EPA) and intact EPA on hepatic steatosis induced by a high-sucrose diet and liver-x-receptor α agonist in mice [J]. Journal of Oleo Science, 2016, 65(3): 233-240.

[25] Colin S, Briand O, Touche V, et al. Activation of intestinal peroxisome proliferator-activated receptor-α increases high-density lipoprotein production [J]. European Heart Journal, 2013, 34(32): 2566-2574.

[26] 艾慶輝, 嚴(yán)晶, 麥康森. 魚類脂肪與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控研究進(jìn)展 [J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2016, 40(4): 859-868. Ai Qinghui, Yan Jing, Mai Kangsen. Research progresses of lipids and fatty acids transport in fish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2016, 40(4): 859-868.

[27] 李曉華, 王寶杰, 王雷, 等. 對(duì)蝦血淋巴脂蛋白的生化特征及分子克隆研究進(jìn)展 [J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(11): 80-83. Li Xiaohua, Wang Baojie, Wang Lei, et al. Biochemical characteration and molecular colning of penaeid shrimp hemolymph lipoproteins [J]. Marine Sciences, 2008, 32(11): 80-83.

[28] 劉佳, 李傳飛, 寧波, 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)SCAP/SREBP-1c調(diào)控L02肝細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝 [J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(5): 443-448. Liu Jia, Li Chuanfei, Ning Bo, et al. Endoplasmic reticulum stress regulates lipid synthesis metabolism in L02 hepatocytes through SCAP /SREBP-1c [J]. Journal of Third Military Medical University, 2015, 37(5): 443-448.

[29] 房殿亮. Insig-1/SCAP/SREBP-1c通路對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2013. Fang Dianliang. Effect of Insig-1/scap/Srebp-1c Signal on Lipid Metabolism in Hepatocytes Under Endoplasmic Reticulum Stress[D]. Chongqing: Chongqing University, 2013.

[30] 徐麗. 牛SREBP1基因與牛肉肌內(nèi)脂肪沉積的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013. Xu Li. Study on Beef Intramuscular Fat Deposition of SREBP1 Gene in Cattle[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013.

[31] 楊林輝. TNF-α對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性模型SCAP-SREBP-1c脂質(zhì)合成通路的影響[D]. 重慶: 第三軍醫(yī)大學(xué), 2006. Yang Linhui. Effect of TNF-α on the SCAP-SREBP-1c Pathway of Lipid Synthesis in a Model of Hepatocyte Steatosis[D]. Chongqing: Third Military Medical University, 2006.

[32] 王媛媛. SCAP超表達(dá)對(duì)細(xì)胞脂代謝的影響及其相關(guān)可能機(jī)制研究[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2010. Wang Yuanyuan. Construction of pcDNA-SM22-SCAP(D443N) Eukartotic Expression Vector and Its Investigation of Function[D]. Chongqing: Chongqing Medical University, 2010.

[33] 陳科. insig2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)脂肪代謝相關(guān)基因的影響[D]. 長(zhǎng)沙: 中南大學(xué), 2007. Chen Ke. Construction Eukaryotic Expression Plasmid of Insig2 and Its Influence to Related Genes of Fat Metabolism[D]. Changsha: Central South University, 2007.

[34] Jakobsson A, Westerberg R, Jacobsson A. Fatty acid elongases in mammals: their regulation and roles in metabolism [J]. Progress in Lipid Research, 2006, 45(3): 237-249.

責(zé)任編輯 朱寶象

Determination of Nutritive Components and Expression Analysis of Lipid Metabolism Related Genes of Hybrid of Kumamoto Oyster (♀) and Portuguese Oyster (♂)

YAN Lu-Lu1, WANG Zhao-Ping1, SU Jia-Qi2, YAN Xi-Wu3, YU Rui-Hai1

(1. The Key Laboratory of Mariculture(Ocean University of China),Ministry of Education， Qingdao 266003, China; 2. The South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300, China; 3. Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding of Liaoning Province, College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

The basic components, amino acids, fatty acids and the expression of three genes related to the lipid metabolism (PPARα,INSIG,SREBP) of one year old oysterCrassostrea.sikamea,C.angulataand their hybrid were determined and analyzed, respectively in this study. The results showed that the content of lipid in hybrid was (13.66±1.99)%, significantly higher than that ofC.sikamea(7.56±1.17)% andC.angulata(5.94±1.88)%. PUFAω3/PUFAω6 ratio was 4.18±0.62 in hybrid, higher than that inC.sikamea(3.86±0.01) andC.angulata(3.14±0.07). The content of DHA in hybrid (16.73±3.35)% was slightly by not significantly higher than that in self-propagated parents. The EPA content of hybrid was between that ofC.sikameaandC.angulata. The expression of lipid genes (PPARα,INSIG,SREBP) in some edible tissues of oysters coincided well with lipid content. The results provided a basis thatnutritional heterosis existed in hybrid.

Crassostreasikamea;Crassostreaangulata; hybrid oyster; nutritional component; gene expression

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172403)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China(31172403)

2016-07-08；

2016-12-05

閆路路(1987-)，女，博士生。E-mail：372610194@qq.com

?? 通訊作者：E-mail：zpwang@ouc.edu.cn

S917.4

A

1672-5174(2017)06-053-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160250

閆路路，王昭萍，蘇家齊，等.熊本牡蠣(♀)×葡萄牙牡蠣(♂)雜交子代的營(yíng)養(yǎng)成分和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)分析[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(6): 53-60.

YAN Lu-Lu, WANG Zhao-Ping, SU Jia-Qi, et al.Determination of nutritive components and expression analysis of lipid metabolism related genes of hybrid of Kumamoto oyster (♀) and Portuguese oyster(♂)[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6): 53-60.