徐丹 陶陶 張繼榮 古麗玲

HIF-1α對(duì)腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的研究進(jìn)展

徐丹 陶陶 張繼榮 古麗玲

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor -1，HIF-1)是一種在低氧條件下發(fā)揮作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HIF-1蛋白α亞基受細(xì)胞內(nèi)氧分壓的影響，常氧條件下HIF-1α被降解而表達(dá)很少，低氧條件下HIF-1α被激活而大量表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)其下游多種效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而發(fā)揮作用，HIF-1的生物學(xué)功能由HIF-1α決定。腦缺血再灌注時(shí)可導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，有助于機(jī)體更好地耐受低氧環(huán)境而發(fā)揮腦保護(hù)作用。本文就HIF-1α對(duì)其重要靶基因Bcl-2、Bax及Caspase-3在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)和調(diào)節(jié)作用做一綜述，為臨床以HIF-1α基因作為靶點(diǎn)治療腦缺血再灌注損傷提供參考。

缺氧誘導(dǎo)因子-1，α亞基；腦缺血；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；bcl-2相關(guān)X蛋白；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是 Semenza等[1]于1992年首次發(fā)現(xiàn)的一種能與促紅細(xì)胞生成素基因相結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1 是一種異二聚體復(fù)合物，由 HIF-1α和 HIF-1β亞基組成的DNA結(jié)合性蛋白分子。HIF-1β為基礎(chǔ)表達(dá)蛋白，主要在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；HIF-1α則受氧分壓的調(diào)控，正常情況下HIF-1α的半衰期僅約5 min，低氧條件下HIF-1α的降解受到抑制，表達(dá)增加并激活下游多種靶基因而發(fā)揮作用，HIF-1 主要通過(guò)HIF-1α亞基參與組織細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，輕度缺氧，即細(xì)胞內(nèi)氧濃度在1%～3%范圍時(shí)，HIF-1發(fā)揮抑制凋亡的作用；而長(zhǎng)期重度缺氧時(shí)，即氧濃度在0～0.5%范圍內(nèi)時(shí)HIF-1α則大量表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。本文對(duì)HIF-1α在腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷中抑制凋亡的作用研究進(jìn)行綜述。

1 HIF-1α與腦I/R損傷

HIF-1α在多種缺血缺氧性疾病與損傷中扮演十分重要的角色，研究表明HIF-1α與腦血管疾病密切相關(guān)[4]。盡管近年來(lái)溶栓劑及血管內(nèi)技術(shù)的進(jìn)展降低了腦缺血的死亡率，但腦I/R損傷仍然是影響腦缺血嚴(yán)重程度的重要因素。腦I/R損傷時(shí)缺血中心區(qū)腦組織由于血氧供應(yīng)急劇下降，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，激活細(xì)胞死亡通路，神經(jīng)細(xì)胞很快發(fā)生不可逆壞死，而周邊的缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元由于再灌注側(cè)支循環(huán)的建立依然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡以細(xì)胞凋亡為主。Tominaga等[5]于1993年首先發(fā)現(xiàn)并證實(shí)腦缺血可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，隨后研究人員亦發(fā)現(xiàn)腦缺血早期即可檢測(cè)出凋亡細(xì)胞，于24 h達(dá)高峰[6]。細(xì)胞凋亡是涵蓋基因調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)及凋亡效應(yīng)的執(zhí)行的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)機(jī)體的生存和穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。

腦缺血使半暗帶的腦血流量下降，減少了該區(qū)的氧供，誘導(dǎo)缺血半暗帶區(qū)HIF-1α積聚活化、表達(dá)上調(diào)，有助于腦缺血后半暗帶的血循環(huán)恢復(fù)和葡萄糖的運(yùn)輸、介導(dǎo)缺氧后的低氧適應(yīng)，對(duì)腦組織發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞存活抑制凋亡的保護(hù)作用[4]。由此可見(jiàn)，腦I/R在導(dǎo)致腦組織損傷的同時(shí)也啟動(dòng)了自身的抗損傷機(jī)制，這種抗損傷過(guò)程可能與HIF-1α的表達(dá)上調(diào)有重要聯(lián)系。HIF-1α的分布和作用十分廣泛，但都與其調(diào)控下游靶基因來(lái)增強(qiáng)腦組織對(duì)缺氧的耐受性有關(guān)。HIF-1α參與調(diào)控的下游靶基因多達(dá)100余種，均與能量代謝或供氧有關(guān)，包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)及凋亡相關(guān)基因等，HIF-1α能特異性結(jié)合這些基因上的低氧反應(yīng)元件(HRE)，通過(guò)這些靶基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物來(lái)啟動(dòng)機(jī)體對(duì)缺血缺氧的一系列病理生理機(jī)制，如促進(jìn)血管生成、調(diào)控?zé)o氧代謝、促進(jìn)紅細(xì)胞表達(dá)增加、幫助細(xì)胞增殖遷移分化、抑制細(xì)胞凋亡等，從而使缺氧的組織保持氧穩(wěn)態(tài)[2，7]。研究人員對(duì)局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)，缺血半暗帶區(qū)HIF-1α表達(dá)上調(diào)的同時(shí)VEGF表達(dá)亦增加，從而促進(jìn)血管生成來(lái)對(duì)抗缺血缺氧性損傷，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)干預(yù)減少HIF-1α的降解，則能誘導(dǎo)EPO及 VEGF 表達(dá)上調(diào)，明顯提高紅細(xì)胞攜氧能力，減輕缺血后腦水腫及血管滲漏[8-9]。缺血腦組織神經(jīng)元存活與否與HIF-1α的穩(wěn)定密切相關(guān)，HIF-1α能在機(jī)體受到各種應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活，發(fā)揮腦保護(hù)作用[10]。

2 腦I/R損傷后HIF-1α與Bcl-2、Bax表達(dá)

細(xì)胞凋亡涉及多種蛋白分子的參與，而B(niǎo)cl-2家族蛋白是其中不可或缺的一類(lèi)蛋白質(zhì)，1984年Tsujimoto等[11]從人類(lèi)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞異位染色體t(14；18)上首次克隆出Bcl-2基因，迄今為止已發(fā)現(xiàn)并確定了Bcl-2家族的25個(gè)成員，并根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的不同分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類(lèi)，兩類(lèi)蛋白相互協(xié)調(diào)以決定細(xì)胞是否走向凋亡[12]。生理狀態(tài)下，不同家族成員在各組織中的表達(dá)量不盡相同，但其結(jié)構(gòu)非常相似，具有高度同源性。Bcl-2和Bax是家族中最重要的一對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡且互相對(duì)抗的因子，它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)均有表達(dá)。Bcl-2是家族中的最重要的抗凋亡因子，主要在核膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮作用。Bax則是促凋亡蛋白的典型代表，與Bcl-2的同源性為21%，它以非活性形式分布于胞漿中或細(xì)胞骨架上，腦缺血早期神經(jīng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激后，Bax發(fā)生構(gòu)象改變，從胞漿中轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，使線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放并釋放出細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿后與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和前體Caspase-9結(jié)合形成“Cyto C-Apaf-1-proCaspase-9”凋亡復(fù)合體，從而激活前體Caspase-9，活化的 Caspase-9進(jìn)而激活其下游的前體Caspase-3， Caspase-3通過(guò)水解多種蛋白底物而使細(xì)胞走向凋亡。細(xì)胞色素C還可產(chǎn)生自由基，阻止線粒體產(chǎn)生ATP而誘導(dǎo)線粒體損傷[13]。與此同時(shí)Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開(kāi)放，從而抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，最終抑制Caspase級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)而抑制凋亡[14]。隨著I/R時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體啟動(dòng)凋亡機(jī)制，Bax表達(dá)增加使細(xì)胞受損加重，Bcl-2被降解而表達(dá)下調(diào)。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡還可能與它調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的鈣離子流或發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)[15]。研究表明Bcl-2家族蛋白對(duì)線粒體釋放細(xì)胞色素C具有最明顯而重要的調(diào)控效應(yīng)[16]。Bcl-2 和 Bax 在細(xì)胞中根據(jù)二者的含量不同形成不同的復(fù)合物而發(fā)揮截然相反的作用，當(dāng)Bcl-2的含量高于Bax二者結(jié)合形成異源二聚體時(shí)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用；而當(dāng)Bax的含量高于Bcl-2而形成Bax同源二聚體時(shí)，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

大量研究證實(shí)腦I/R后相互對(duì)抗的Bcl-2和Bax的區(qū)域性表達(dá)與凋亡細(xì)胞具有同步性。Qian等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α表達(dá)可使Caspase-9和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，并抑制PI3K/Akt通路而使Bcl-2表達(dá)下調(diào)，降低Bcl-2/Bax比值?？傊?，腦I/R損傷誘導(dǎo)HIF-1α積聚活化，一方面通過(guò)上調(diào)EPO、VEGF及Bcl-2等抑制凋亡，另一方面抑制促凋亡蛋白Bax及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)等，還能產(chǎn)生抗氧化因子等來(lái)保護(hù)受損的腦組織[19-20]。

3 腦I/R損傷后HIF-1α與Caspase-3

細(xì)胞凋亡的實(shí)質(zhì)是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程，Caspase家族在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。它們是一組天門(mén)冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，與白介素-1β轉(zhuǎn)換酶(interleukin-1β converting enzyme，ICE)具有同源性，家族成員均以無(wú)活性的酶原形式存在。酶原結(jié)構(gòu)包括氨基端的原域，中間的大亞基(P20域)和小亞單位(P10域)3個(gè)部分。根據(jù)原域的長(zhǎng)度，酶在凋亡途徑中的位置和前體活化方式將Caspase分為兩類(lèi)：起始者胱天蛋白酶，包括Caspase-8、-9和-10，它們位于級(jí)聯(lián)活化反應(yīng)的上游，由于原域較長(zhǎng)而能在凋亡信號(hào)的刺激下通過(guò)自剪接的方式自我激活，然后順序激活下游Caspase而啟動(dòng)凋亡；效應(yīng)者胱天蛋白酶，包括Caspase-3、-6和-7，位于級(jí)聯(lián)活化途徑的下游，它們的原域相對(duì)較短，必須通過(guò)起始者胱天蛋白酶的切割才被激活，活化后可水解胞內(nèi)多種重要的功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，最終使細(xì)胞走向凋亡。

Caspases蛋白酶調(diào)控凋亡主要與死亡受體途徑、線粒體依賴(lài)途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路有關(guān)。其中，在死亡受體途徑中，死亡受體能與相應(yīng)的“死亡配體”特異性結(jié)合，將凋亡信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，使Caspase-8在連接分子的媒介下通過(guò)自我剪切而活化，經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)并最終活化Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)活化的Caspase-8還能降低線粒體內(nèi)膜電位使Bcl-2家族成員裂解，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，起到凋亡放大作用[21]。在線粒體依賴(lài)中，線粒體內(nèi)釋放細(xì)胞色素C是最關(guān)鍵的一步[22]。Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白共同參與了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。由此可見(jiàn)，Caspase家族是多條凋亡通路的聚集點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最后通路，Caspase蛋白酶不僅能自我活化還能激活其下游的家族成員，因此凋亡信號(hào)通路一旦啟動(dòng)，即以級(jí)聯(lián)放大的形式發(fā)展，直到蛋白底物被裂解，凋亡才結(jié)束。Caspase-3是各種細(xì)胞凋亡途徑的必經(jīng)之路，在不同凋亡途徑中扮演“凋亡執(zhí)行者”的角色。在各種凋亡信號(hào)刺激下，不同的家族蛋白酶剪切并激活前體Caspase-3，使前體Caspase-3在Asp28-Ser29和Aspl75-Serl76位置處被剪切，形成P20和P10兩個(gè)片段，兩種亞單位再結(jié)合形成有活性的Caspase-3，活化的Caspase-3可通過(guò)以下3種機(jī)制使細(xì)胞解體：酶解細(xì)胞外基質(zhì)及骨架蛋白、裂解DNA修復(fù)蛋白、降解相關(guān)凋亡抑制物[23]。

正常成年大鼠腦組織中通常具有Caspase蛋白酶的抑制劑-X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，防止前體Caspase被偶然激活使組織細(xì)胞受損。研究證實(shí)腦缺血早期即可在缺血半暗帶區(qū)檢測(cè)出大量活化的Caspase-3，與凋亡細(xì)胞的表達(dá)區(qū)域一致，并于24 h表達(dá)最多，提示腦I/R損傷早期細(xì)胞凋亡與Caspase-3的激活密切相關(guān)[24]。Caspase-3的異常激活和表達(dá)上調(diào)是I/R損傷啟動(dòng)缺血腦區(qū)受損神經(jīng)元凋亡最重要的環(huán)節(jié)，Caspase-3通過(guò)各種途徑參與觸發(fā)腦I/R后的細(xì)胞凋亡，而抑制Caspase-3被激活可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[25]。Caspase-3 還可通過(guò)水解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的抑制作用，從而發(fā)揮促進(jìn)凋亡的發(fā)生[26]。腦缺血時(shí)HIF-1α不僅能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax來(lái)抑制Caspase-3，還能通過(guò)VEGF機(jī)制、TNF-α通路及ERKl/2信號(hào)通路來(lái)調(diào)控Caspase-3的活性，從而抑制Caspase級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終減少神經(jīng)細(xì)胞損傷[27-28]。

綜上所述，腦I/R損傷后，挽救缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡能有效減少神經(jīng)細(xì)胞壞死和神經(jīng)功能缺損。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)腦組織缺血缺氧可使缺血半暗帶HIF-1α表達(dá)增加，由于HIF-1α能調(diào)控下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，因此以HIF-1α作為腦缺血的治療靶點(diǎn)所產(chǎn)生的療效可能比針對(duì)單個(gè)其下游的靶基因治療更為顯著。值得注意的是，目前對(duì)HIF-1α的研究探索還停留在動(dòng)物模型階段，而且低氧條件下HIF-1α發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)也可能促進(jìn)凋亡。深入研究HIF-1α及其下游靶基因在腦I/R損傷中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，充分發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用并避免損傷作用，必將為今后的臨床防治提供實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

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貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目[黔省專(zhuān)合字(2006)60號(hào)]；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[黔衛(wèi)計(jì)發(fā)(2014)41號(hào)]；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2007]2096號(hào))

550002 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科〔徐丹(現(xiàn)在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科讀研究生)、陶陶、古麗玲〕；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(張繼榮)

陶陶，Email:835707237@qq.com

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