倪 嵐， 王桂榮， 楊 炯△

1武漢大學中南醫(yī)院呼吸內科，武漢 4300712美國紐約州立大學上州醫(yī)學院外科，紐約州 13210

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SP-B基因內含子4區(qū)(CA)n模體上SRp20蛋白結合位點的初步研究*

倪 嵐1， 王桂榮2， 楊 炯1△

1武漢大學中南醫(yī)院呼吸內科，武漢 4300712美國紐約州立大學上州醫(yī)學院外科，紐約州 13210

目的 探討SP-B基因內含子4區(qū)第8號(CA)n模體上可能存在的剪切蛋白結合位點，為進一步研究第8號(CA)n模體影響SP-B mRNA剪切的機制提供實驗基礎。方法 軟件分析特定(CA)n模體的潛在RNA結合蛋白，并合成含有特定蛋白潛在結合位點的模體RNA序列的探針及突變序列探針，用凝膠阻滯遷移(EMSA)技術研究相關(CA)n模體的RNA序列與其潛在結合蛋白的相互作用。結果 軟件分析預測第8號(CA)n模體上可能存在特定剪切蛋白SRp20的結合位點；EMSA實驗中當抗體或突變探針競爭時特異性結合帶(遷移帶)均消失，顯示第8號(CA)n模體RNA序列上的“CAUC”能夠與SRp20特異性結合。結論 SP-B內含子4區(qū)第8號(CA)n模體的保守序列上存在SRp20的特異性結合位點，從而可能影響SP-B mRNA剪切。

SP-B基因； RNA結合蛋白； SRp20

精確的剪切過程有賴于剪切位點的正確識別以及各種剪切蛋白和RNA之間的相互作用。剪切調控蛋白可結合到稱為外顯子/內含子剪切增強子(ESE/ISE，exonic/intronic splicing enhancer)或者外顯子/內含子剪切沉默子(ESS/ISS，exonic/intronic splicing silencer)的特殊RNA序列，前者增強附近的剪切位點的剪切，后者正好相反。人類SP-B基因內含子4區(qū)的前半部分存在11個以(CA)n為特征的模體(motif)，每個模體由一段20個堿基左右的保守序列和CA重復序列(2到17個)構成(圖1)。我們的前期研究顯示SP-B基因內含子4區(qū)第8號(CA)n模體對SP-B mRNA剪切產生明顯的增強作用[1]，第8號模體可能為剪切增強子，但其具體作用方式并不清楚。我們利用在線軟件分析了內含子4區(qū)相關(CA)n模體的特定RNA序列的潛在RNA結合蛋白，并利用凝膠阻滯遷移技術(EMSA)研究第8號模體保守序列上的RNA序列與其潛在結合蛋白SRp20的相互作用，探討第8號(CA)n模體上可能存在的剪切蛋白結合位點，為進一步研究第8號(CA)n模體影響SP-B mRNA剪切的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

CHO-K1細胞(CCL-61)購于ATCC中心；SRSF3(NM_003017)Human cDNA ORF克隆、TurboFectin 8.0轉染試劑盒購于Origene公司；pEGM-11Z載體連接試劑盒購于Promega公司；Quick change lightning site-directed mutagenesi試劑盒購于Stratagene公司；質粒(大)小規(guī)模抽提試劑盒、凝膠純化試劑盒購于Qiagen公司；RNA抽提柱購于Zymo Research公司；AmpliScribe T7-Flash Biotin-RNA轉錄試劑盒購于Epicentre公司；NE-PER核-胞漿蛋白制備試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒、化學發(fā)光RNA EMSA試劑盒、化學發(fā)光核酸檢測試劑盒購于Thermo Scientific公司；SRp20抗體1(抗SFRS3抗體)ab73891、SRp20抗體2 ab80291、抗beta-actin抗體(BA3R)ab125248、二抗山羊抗兔IgG(H+L)-HRP購于Abcam公司；PVDF膜購于Millipore公司；正極尼龍膜購于Roche公司；RNA-bee購于TEL-TEST公司。臺式低速離心機、高速低溫離心機購于Eppendorf公司；分光光度計、恒溫搖床購于Fisher公司；垂直電泳槽、電轉移槽購于Bio-rad公司；XL-1000UV交聯(lián)儀購于Spectronics公司。

1.2 (CA)n模體區(qū)的增強子和沉默子分析及結合蛋白預測

利用可變性剪切數(shù)據(jù)庫(Alternative Splicing Database，ASD)項目研究SP-B基因內含子4區(qū)的前一部分包含有11個模體加上第11號模體后的46 bp序列，分析增強子或沉默子潛在的結合位點及潛在的剪切蛋白。

1.3 相關(CA)n模體的RNA序列與其潛在結合蛋白SRp20的相互作用

1.3.1 轉染及核蛋白抽提 為得到大量SRp20用于RNA凝膠阻滯實驗，選取可過表達SRp20的載體SRSF3(NM_003017)Human cDNA ORF克隆轉染CHO-K1細胞(中國倉鼠卵巢細胞，培養(yǎng)條件見參考文獻[1])使后者大量表達SRp20，然后抽取核蛋白。當CHO-K1細胞匯合度為60%時，每盤(10 cm)轉染6 μg載體克隆DNA。轉染試劑為TurboFectin 8.0。

用NE-PER核-胞漿蛋白制備試劑盒進行細胞核蛋白抽提：冷凍PBS液洗滌細胞培養(yǎng)皿2次，在培養(yǎng)皿加入1 mL PBS，收取細胞至EP管；4℃下3 000 r/min離心5 min棄上清；將細胞懸浮于1 mL的PBS中，4℃下2 000 r/min離心10 min棄上清；目測沉淀物體積約為50 μL，將細胞懸浮于10倍體積(500 μL)的胞漿蛋白裂解液CER Ⅰ，劇烈振蕩15 s使沉淀充分溶解，冰上孵育10 min；加27.5 μL胞漿蛋白裂解液CERⅡ(冰上)，劇烈振蕩5 s后冰上孵育1 min；劇烈振蕩5 s，4℃下14 000 r/min離心5 min，上清液快速轉移至EP管儲存；將沉淀懸浮于250 μL核蛋白裂解液NER(冰上)，劇烈振蕩15 s后置于冰上孵育10 min，反復每10 min冰上孵育后振蕩15 s，總共40 min；4℃下14 000 r/min離心10 min，快速轉移上清(核蛋白抽提物)至EP管并于-70℃保存。

BCA法測定蛋白質濃度：按25體積BCA試劑A+24體積BCA試劑B +1體積BCA試劑C配制BCA工作液。將蛋白樣品加于上述溶液中，37℃孵育60 min，移至比色皿，分別測定待測樣品孔A570nm值，軟件計算待測樣品的蛋白含量。

1.3.2 Western blot檢測 配制聚丙烯酰胺凝膠，取4 μg蛋白行SDS-PAGE電泳。預電泳電壓60 V 30 min后，蛋白上樣電壓調為100 V電泳至溴酚藍進入凝膠底部停止電泳。在海綿上放1張濾紙，依次放凝膠、PVDF膜、濾紙和海綿，于冰浴垂直電轉槽40 V轉印2 h。電轉結束后取FVDF膜置于10 mL TBST內，加封閉液10 mL室溫孵育1 h。4℃下加一抗,8 h后TBST洗膜。室溫下加對應HRP二抗(1∶3 000)孵育1 h。洗膜后將PVDF膜于ECL試劑中孵育1 min，暗室中置于膠片曝光。凝膠成像分析系統(tǒng)密度掃描并測量條帶的灰度值，以內參灰度值為基礎，測定各組的相對比值。檢測完畢后，將PVDF膜TBST洗膜10 min×3次。加入抗體洗脫液20 mL，50℃ 40 min。重新洗膜、封閉并加入抗體檢測。

1.3.3 凝膠阻滯探針制備 ①pGEM-11Z M8-D(CA)及pGEM-11Z M8-G4-D(CA)質粒構建：合成含有第8號模體保守序列的質粒pGEM-11Z M8-D(CA)(即M8，pGEM-11Z為載體)以及此段序列的突變質粒pGEM-11Z M8-G4-D(CA)(即G4，用“GGGG”代替“CATC”)。M8合成引物為2053/2054，2053：5′-CCATCCAGACACATACCGCGG-CCGCATGCATAAGC-3′；2054：5′-GCTTATGCATGCGGCCGCGGTATGTGTCTGGATGG-3′。G4合成引物為2061/2062，2061：5′-GATTCGC-ACTCGGGGCAGACACATACCGCGGCCGC-3′，2062：5′-GCGGCCGCGGTATGTGTCTGCCCCG-AGTGCGAATC-3′。M8和G4以合成pcDNA3.1 minigene M8[1]過程中的pGEM-11Z M8為模板合成，片段兩端已有酶切位點EcoR Ⅰ和NotⅠ。合成利用Quick change lightning site-directed mutagenesis合成試劑盒，反應系統(tǒng)：5 μL 10×反應緩沖液，0.5 μL模板DNA，2種引物各1 μL，1 μL dNTP混合物，1.5 μL Quick solution試劑，加40 μL ddH2O使反應總體積達50 μL。系統(tǒng)中加入1 μL Quick change lightning酶后行PCR。PCR過程：95℃ 2 min；95℃ 20 s，60℃ 10 s，68℃ 90 s，共18個循環(huán)；68℃ 5 min。加入2 μLDpnⅠ酶至反應體系，混合后直接放入37℃水浴5 min，轉化至XL-10超級大腸埃希菌感受態(tài)細胞，擴增后進行克隆選擇。

②探針合成標記：測序正確的pGEM-11Z M8-D(CA)及pGEM-11Z M8-G4-D(CA)質粒在NotⅠ酶切2 h后線性化成為模板，RNA探針體外轉錄合成利用AmpliScribe T7-Flash Biotin-RNA轉錄試劑盒。反應體系：110 ng線性化模板DNA，2 μL反應緩沖液，8 μL NTP/Biotin-UTP預混合物，2 μL 100 mmol/L DTT，0.5 μL RiboGuard RNase抑制劑，2 μL聚合酶液，加入去RNase水至總體積20 μL。反應體系在37℃水浴1 h，加入1 μL去RNase的DNase Ⅰ后繼續(xù)于37℃15 min以去除DNA模板。同時用non-Biotinilated NTPs制備未標記探針作為對照。RNA轉錄物加入RNA-bee，再用RNA MiniPrep columns進行純化。分別得到RNA探針M8和G4。M8：CGAAUUGGCCAAGACGGCCGAGCUCGAAUUCGCACUCCAUCCAGAC-ACAUACCGCGGC；G4：CGAAUUGGCCAAGA-CGGCCGAGCUCGAAUUCGCACUCGGGGCAG-ACACAUACCGCGGC。

1.3.4 凝膠阻滯遷移實驗 ①探針/蛋白濃度實驗：選取25、50、100、200 ng Biotin標記M8探針進行單獨反應，檢測探針質量和濃度。選取不同量(0.5、1、2、4 μg)核蛋白抽提物與不同濃度Biotin標記M8探針進行反應，以觀察蛋白與探針產生的結合條帶。綜合以上結果選取最佳探針濃度與蛋白量進行反應。凝膠阻滯遷移實驗過程如下：探針和核蛋白抽提物混合,室溫孵育20 min，再置于80℃水浴10 min后轉移至冰上。反應體系：2 μL 10×REMSA binding buffer，1%(v/v)Glycerol，2 μg tRNA，40 U RNAse OUT，10 nmol/L HEPES pH7.3，20 nmol/L KCl，1 nmol/L MgCl2，1 nmol/L DTT，并和探針、核蛋白抽提物以及Nuclease-free water共同構成20 μL反應體積。室溫下靜置20 min后于4℃下進行非變性6% PAGE膠電泳(100 V，4.5 h)。電泳后將一塊同膠等大的正極尼龍膜在轉膜緩沖液(0.5×TBE)中平衡5 min后貼于膠上，將4層平衡后的濾紙鋪于尼龍膜上，膠另一面貼4層已平衡濾紙。置整個體系于轉膜設備中，恒電流400 mA下轉膜30 min。紫外燈(254 nm，120 mJ/cm2)交聯(lián)45 s，使標記探針固定在膜上。37～50℃下將膜于洗滌緩沖液中漂洗2 min并于10 mL封閉液中振蕩孵育30 min，室溫下20 mL抗體孵育液中振蕩孵育30 min，室溫下10 mL洗滌緩沖液漂洗2次，每次15 min，10 mL緩沖液中平衡2～5 min。加1 mL顯影液室溫孵育5 min，暗室中膠片曝光1 h。②未標記(冷)探針競爭實驗：Biotin標記M8探針50 ng與核內蛋白抽提物4 μg進行反應，同時未標記冷探針10、20、40 μg(相當于標記探針的200×、400×、800×)與核內蛋白及標記探針50 ng共同孵育，觀察冷探針競爭情況，反應過程同①所述。冷探針競爭實驗是為證明結合條帶為探針與蛋白抽提物產生，而非其他非探針產生的偽影。③抗體競爭實驗：Biotin標記M8探針50 ng與核內蛋白抽提物4 μg進行反應，同時Biotin標記M8探針50 ng、核內蛋白抽提物4 μg與抗體anti-SFRS3混合體系進行反應。抗體anti-SFRS3濃度分別為1 μg、2 μg?？贵w如能使結合條帶減弱或消失，說明與M8探針上序列結合的蛋白確實為SRp20。反應過程同①所述。④突變探針競爭實驗：Biotin標記M8探針50 ng，核內蛋白抽提物濃度選取4 μg，同時標記突變探針G4 10 μg、20 μg(相當于標記探針M8的200×、400×)及未標記冷探針M8 10、20、40 μg(相當于標記探針200×、400×、800×)分別與標記探針M8競爭反應，對比觀察特異性結合帶濃度。突變探針G4是在M8探針基礎上使“CAUC”突變?yōu)椤癎GGG”，如果突變探針使特異性結合帶減弱消失，說明SRp20蛋白與M8上保守序列的“CAUC”特異性結合的可靠性。反應過程同①所述。

2 結果

2.1 SP-B(CA)n模體區(qū)的增強子和沉默子分析及結合蛋白預測

可變性剪切數(shù)據(jù)庫分析SPB內含子4區(qū)(CA)n模體上所有潛在增強子(沉默子)及可能結合的潛在蛋白，依據(jù)出現(xiàn)頻率進行整理作圖，我們發(fā)現(xiàn)第8號模體存在單個特有基序CATC(RNA序列為CAUC)可能是特定蛋白SRp20的結合位點(圖1)。

圖1 SP-B內含子4區(qū)(CA)n模體上可能存在的RNA結合蛋白Fig.1 Potential binding proteins on the (CA)n motifs within the intron 4 region of SP-B

2.2 SRp20蛋白表達

SRp20抗體1 ab73891為家兔多克隆抗體，免疫原來源于人類SFRS3固有區(qū)，SRp20抗體2 ab80291亦為家兔抗體，免疫原來源于人類SFRS3的N端的35～84個氨基酸區(qū)域。選擇2個抗體是為更好地明確SRp20蛋白表達。Western blot檢測結果顯示：SRp20抗體1(1 mg/mL，稀釋1∶500，5 μg)與核內蛋白抽提物4 μg反應，轉染后12 h無表達，36 h表達量較強，較24 h時表達強；SRp20抗體2(1 mg/mL，稀釋1∶500，5 μg)與核內蛋白抽提物4 μg反應，12 h無表達，36 h及48 h表達量相當，均較24 h表達強。故選擇36 h為轉染后收取細胞時間。Endpoint測定轉染后24、36、48 h核蛋白抽提物濃度分別為476.94、725.25、640.79 μg/mL。

2.3 相關(CA)n模體的RNA序列與其潛在結合蛋白SRp20的相互作用

2.3.1 Biotin標記的RNA探針(M8)與核蛋白的反應(探針/蛋白濃度實驗) 單獨檢測Biotin標記M8探針(25、50、100、200 ng)，濃度為50 ng和100 ng時游離探針條帶清晰，故選取這2個探針濃度分別與核內蛋白抽提物(濃度選取0.5、1、2、4 μg)反應。M8探針濃度為50 ng、核蛋白為4 μg時，結合條帶清晰，游離探針少(圖2)。故選取此探針及核蛋白濃度為標準反應濃度以便與競爭探針對照。

M8探針濃度為50 ng和100 ng時游離探針條帶清晰(④⑤)，M8探針濃度為50 ng、核蛋白為4 μg時，結合條帶(bound RNA)清晰(⑩)圖2 Biotin標記的RNA探針(M8)與核蛋白的反應Fig.2 The reaction between Biotin labeled RNA(M8)and nuclear extract

2.3.2 標記/未標記(冷)RNA探針(M8)與核蛋白的反應(未標記冷探針競爭實驗) Biotin標記M8探針50 ng，核內蛋白抽提物濃度選取4 μg時，可見清晰結合條帶；未標記冷探針10、20、40 μg(相當于標記探針的200×、400×、800×)與核內蛋白4 μg及標記探針50 ng共同孵育，可見結合條帶濃度逐漸降低，顯示標記探針被競爭(圖3)，說明結合條帶確為探針M8與核蛋白結合引起而非其他非探針產生的偽影。

M8探針50 ng及核蛋白4 μg時結合條帶清晰(②)，隨著未標記冷探針濃度逐漸升高，M8探針與核蛋白結合條帶濃度逐漸減弱(③④⑤)圖3 標記/未標記(冷)RNA探針(M8)與核蛋白的反應Fig.3 The reaction between Biotin labeled/unlabeled(cold)RNA(M8)and nuclear extract

2.3.3 標記RNA探針(M8)/抗體與核蛋白的反應(抗體競爭實驗) Biotin標記M8探針50 ng，核內蛋白抽提物濃度選取4 μg，可見清晰結合條帶，抗體anti-SFRS3濃度為2 μg時超級遷移帶(super shift)明顯，此為抗體與核蛋白結合后電泳移動速度下降所致；抗體為1 μg和2 μg時，結合帶中下方條帶均消失，說明減弱消失的條帶中的結合蛋白為SRp20，顯示由于抗體結合SRp20蛋白，引起探針無法和SRp20特異性結合，故被競爭消失的條帶為探針M8與SRp20的特異性結合帶(specific shift)(圖4)。

抗體濃度為1 μg和2 μg時，探針M8與核蛋白結合條帶中下方條帶消失(③④)，同時產生超級遷移帶(super shift)(④)圖4 標記RNA探針(M8)/抗體與核蛋白的反應Fig.4 The reaction between Biotin labeled RNA(M8)/antibody and nuclear extract

2.3.4 標記突變RNA探針(G4)/未標記(冷)RNA探針(M8)與核蛋白的反應(突變探針競爭實驗) 標記的突變探針G4(10、20 μg)與未標記冷探針M8(10、20、40 μg)對比，未標記冷探針M8使得所有結合帶減弱消失，而隨著突變探針G4濃度逐漸增高，只有特異性結合帶減弱消失(圖5)，顯示突變探針G4不能與SRp20蛋白相結合，說明被突變掉的特異性序列“CAUC”確實為SRp20蛋白的結合位點。

與未標記冷探針M8使所有結合帶減弱消失(③④⑤)相比，隨著突變探針G4濃度逐漸增高，只有特異性結合帶(specific shift)減弱消失(⑦⑧)圖5 標記突變RNA探針(G4)/未標記(冷)RNA探針(M8)與核蛋白的反應Fig.5 The reaction between Biotin labeled mutant RNA(G4)/unlabeled (cold) RNA (M8) and nuclear extract

3 討論

SR蛋白家族(Ser-Arg rich protein family)作為一個在哺乳動物細胞中參與組成和調節(jié)pre-mRNA剪切過程的RNA結合蛋白家族而被廣泛研究[2]。它們的氨基酸序列特征為包含一個富含精氨酸和絲氨酸重復序列的RS蛋白結構域。SR蛋白的所有9個成員SF2/ASF、SC35、SRp20、SRp40、SRp55、SRp75、SRp30c、9G8以及SRp54都有共同的結構，包含1個或者2個氨基(N)端RNA結合結構域和羧基(C)端長度可變的RS結構域[3-5]。RNA結合結構域是SR蛋白特異性識別并結合pre-mRNA上的RNA序列的功能單位，又稱為RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)[4-6]。含有2個RRM的SR蛋白需要2個RRM相配合以完成剪切任務。

可變剪切的經典例子已經顯示，pre-mRNA上的順式作用元件如剪切增強子能通過提供剪切位點來募集如U1、U2 snRNP等剪切因子構成的剪切小體以及一些關聯(lián)蛋白如U2輔助因子(U2AF)，從而使外顯子拼接并釋放內含子[7]。目前研究較多、較深入的是外顯子剪切增強子(ESE)，剪切增強子通常識別至少1個SR蛋白將剪切小體募集至內含子毗連區(qū)[8-10]。在參與的幾步剪切過程中[11-12]，SR蛋白需要磷酸化以保證有效的剪切位點識別，同時需要去磷酸化催化剪切反應[13-14]。增強子結合的SR蛋白的RS結構域直接和其他具有RS結構域的剪切因子互相作用以利于剪切小體各因子募集到達功能剪切位點，如使U1 snRNP到達5′端剪切位點或者使U2 AF65到達3′端剪切位點。在功能性剪切小體中可觀察到RS結構域同pre-mRNA相接觸，提示剪切小體募集的可變模式。除了RS結構域對剪切的活化作用，動力學分析亦顯示增強子結合的SR蛋白的相對活性決定了剪切被促進的程度；這個活性取決于SR蛋白組裝在增強子上的量以及內含子和外顯子之間的距離。有研究已經表明，剪切的活化與結合的SR蛋白的RS結構域上的精氨酸和絲氨酸重復序列的量呈正比，所以精氨酸和絲氨酸重復序列的量說明SR蛋白的活化能力[15]。

SRp20被證實在剪切過程中起著促進作用[16-18]，關于內含子區(qū)SR蛋白的研究較少，通常認為這些供SR蛋白的內含子區(qū)結合位點功能性不強，也有報道證實確有SR蛋白的結合位點[19]。Hargous等[20]于2006年構建了9GB和SRp20的RNA識別基序(RRM)的自由液態(tài)結構，發(fā)現(xiàn)SRp20可以特異性識別“CAUC”序列，但其識別方式是部分的，序列的所有4個核苷酸都與RRM接觸，但是只有5′端的C是主要的特異性識別，顯示一種不同尋常的RNA結合模式。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)，SP-B基因內含子4區(qū)第8號模體保守區(qū)RNA序列上的“CAUC”序列確實可以和剪切調節(jié)因子SR家族的SRp20蛋白特異性結合，顯示其可能作為一個SRp20剪切蛋白的結合位點而發(fā)揮對剪切的影響作用。我們之前研究發(fā)現(xiàn)第8號模體對SP-B mRNA剪切的增強作用可能與此結合位點相關，具體機制有待進一步證實。

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(2016-09-28 收稿)

A Preliminary Study of Binding Site of SRp20 in the (CA)nMotif of Intron 4 of Surfactant Protein B Gene

Ni Lan1，Wang Guirong2，Yang Jiong1△

1DepartmentofRespiratoryMedicine，ZhongnanHospital，WuhanUniversity，Wuhan430071，China2DepartmentofSurgery，SUNYUpstateMedicalUniversity，SyracuseNY13210，USA

Objective To investigate the potential protein binding site in the motif 8 of intron 4 of surfactant protein B (SP-B)gene and provide a basis for further investigation on mechanism by which motif 8 affects SP-B mRNA splicing.Methods Specific (CA)nmotifs that potentially bind RNA-binding proteins were analyzed by online software.RNA probes that contained potential binding site of specific protein as well as mutated-sequence probe were synthesized.RNA mobility shift assay was used to study the correlation and interactions between specific (CA)nmotif and potential binding protein.Results The Prediction by software analysis showed potential binding site of SRp20 in the motif 8.The RNA：protein shift was lost upon antibody of SRp20 and mutation of “CAUC” in motif 8 in EMSA，which revealed the specific binding resulted from a Motif 8 sequence that contains a CAUCcis-element and SRp20.Conclusion A specific RNA-binding site of SRp20 exists in the conserved sequence of the motif 8，which may have a role in RNA splicing.

surfactant protein B gene； RNA binding protein； SRp20

*美國國立衛(wèi)生研究院基金資助項目(No.NIH/R37HL-34788)

R341

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.007

倪 嵐，女，1978年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：lanni_1020@aliyun.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jiongyangj@163.com