張淑琴， 胡赤丁， 陳 茜， 肖天雄， 楊廣笑， 何光源， 陳明潔△

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科 2腫瘤科，武漢 4300153華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，武漢 4300304華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074

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4種天然藥物對人肝癌細胞HepG2增殖抑制作用的比較*

張淑琴1， 胡赤丁2， 陳 茜3， 肖天雄4， 楊廣笑4， 何光源4， 陳明潔4△

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科2腫瘤科，武漢 430015
3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，武漢 4300304華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074

目的 比較吉馬酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯等4種天然藥物對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制效果，并探討其作用機制。方法 通過MTT法比較4種藥物對HepG2細胞增殖的影響，流式細胞儀分析其對細胞凋亡的影響。Western blot法檢測藥物處理前后細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果 4種藥物均呈濃度依賴性地抑制HepG2細胞的增殖，其中淫羊藿素對HepG2的抑制效果最為明顯，作用48 h半抑制濃度IC50為30 μmol/L；4種藥物均誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，淫羊藿素誘導(dǎo)細胞凋亡的效果最顯著，30 μmol/L淫羊藿素處理48 h后，細胞凋亡率達到51.1%；4種藥物均不同程度抑制周期相關(guān)蛋白Cyclin A、Cyclin B1、CDK1、CDK2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高促凋亡蛋白Bax的表達。結(jié)論 4種天然藥物在體外能明顯抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，淫羊藿素效果最為顯著；其分子機制與調(diào)節(jié)抑制細胞增殖和促凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

吉馬酮； 芝麻素； 淫羊藿素； 褐藻多糖硫酸酯； 人肝癌細胞HepG2； 增殖； 凋亡

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差，成為我國第2位的腫瘤死亡原因，嚴重危害人群的健康[1-2]。目前臨床常用抗腫瘤化療藥物、放射性療法對人體的副作用很大，治療過程中嚴重損害機體的自身免疫力，因此，亟待開發(fā)毒性低、藥效高的新型抗腫瘤藥物。天然藥物是開發(fā)抗腫瘤藥物的重要資源，多種天然藥物已被用于肝癌治療的研究[3-4]，其中莪術(shù)油中的吉馬酮、芝麻籽中的芝麻素、淫羊藿中的淫羊藿素和海藻提取物褐藻多糖硫酸酯均呈現(xiàn)較為明顯的抑制肝癌細胞增殖的效果[5-8]。本研究通過比較4種天然藥物吉馬酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯處理人肝癌細胞HepG2的結(jié)果，探討4種天然藥物發(fā)揮作用的分子機制，比較其各自的優(yōu)勢，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

芝麻素和淫羊藿素購自上海融禾醫(yī)藥有限公司，吉馬酮購自四川成都曼斯特生物有限公司，褐藻多糖硫酸酯、胰蛋白酶(Typsin)、MTT以及DMSO均購自Sigma公司。無支原體胎牛血清購自杭州四季青公司，青霉素-鏈霉素溶液購自安特捷生物技術(shù)有限公司。AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，GAPDH、CDK2、Cyclin A、Cyclin B1、CDK1、Bax、Bcl-2等多克隆抗體購于Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購于武漢博士德生物工程公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CTCC)，細胞培養(yǎng)采用含10%無支原體胎牛血清和1%雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖測定

采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)，接種至96孔板2×104個/孔，待細胞貼壁后，更換分別含有不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，37℃暗培養(yǎng)15 min后，于490 nm測定吸光度值，以完全培養(yǎng)液為空白對照。細胞增殖率=處理組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.4 細胞周期分析

采用PI染色法和流式細胞術(shù)分析細胞周期。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)，接種至96孔板，2×105個/孔，細胞貼壁后，更換含有各種藥物的新鮮培養(yǎng)液，以完全培養(yǎng)液為空白對照。處理48 h后，收集細胞并用PBS洗滌2次，去上清，每個樣品加入500 μL緩沖液重懸細胞，加入100 μL PI，混勻后室溫避光孵育30 min。通過流式細胞儀檢測，結(jié)果用細胞周期擬合軟件ModFit分析。

1.5 細胞凋亡檢測

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法和流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)，接種至6孔板，2×105個/孔，細胞貼壁后，更換含有一定濃度藥物的新鮮培養(yǎng)液處理一定時間后，收集細胞、PBS洗滌、500 μL緩沖液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min，于l h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.6 蛋白表達分析

采用Western blot法檢測與細胞生長和凋亡相關(guān)的蛋白表達。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)，接種至6孔板，1×105個/孔，藥物處理48 h后，收集細胞、裂解細胞、提取蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，據(jù)此計算蛋白電泳上樣量。每孔上樣30 μg蛋白進行10% SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后通過電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜，洗膜后分別以1∶200和1∶500比例加入特定抗體進行一抗孵育，隨后以二抗于室溫孵育2 h，TBST洗膜后，顯影定影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種藥物對HepG2細胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果表明，4種藥物梯度濃度處理HepG2細胞24 h和48 h后，與對照組相比，細胞增殖率均下降(P<0.05，P<0.01)，如圖1所示，在實驗濃度范圍內(nèi)，4種藥物對細胞增殖的抑制作用均呈現(xiàn)濃度依賴性。處理48 h半抑制濃度IC50分別為吉馬酮120 μmol/L、芝麻素98 μmol/L、淫羊藿素30 μmol/L、褐藻多糖硫酸酯4 g/L，其中淫羊藿素對細胞增殖的抑制效果最為顯著。

2.2 4種藥物對HepG2細胞周期的影響

PI染色法和流式細胞術(shù)分析結(jié)果如表1所示，與相應(yīng)的空白對照相比，吉馬酮、芝麻素和褐藻多糖硫酸酯均顯著提高G2/M期細胞比例(均P<0.05)，表明此3種藥物誘導(dǎo)肝癌細胞G2/M期阻滯；淫羊藿素顯著提高S期細胞比例(P<0.05)，表明此藥物可誘導(dǎo)肝癌細胞S期阻滯。

2.3 4種藥物對HepG2細胞凋亡的影響

細胞凋亡檢測結(jié)果表明，4種藥物處理48 h后，HepG2細胞均出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，其中淫羊藿素誘導(dǎo)細胞凋亡效果最為顯著，30 μmol/L淫羊藿素處理后，細胞凋亡率達到51.1%，100 μmol/L芝麻素和4 g/L褐藻多糖硫酸酯處理后細胞凋亡率分別為41.8%和43.7%，呈現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)細胞凋亡作用。吉馬酮具有一定誘導(dǎo)細胞凋亡作用，120 μmol/L吉馬酮處理后細胞凋亡率為14.9%。

表1 4種藥物對HepG2細胞周期的影響
Table 1 Effect of four drugs on HepG2 cell cycle

藥物處理細胞周期(%)G0/G1SG2/M吉馬酮空白對照53.631.914.5120μmol/L吉馬酮33.533.832.7*芝麻素空白對照63.731.64.7100μmol/L芝麻素45.231.123.7*淫羊藿素空白對照50.932.716.430μmol/L淫羊藿素38.143.5*18.4褐藻多糖硫酸酯空白對照68.820.310.94g/L褐藻多糖硫酸酯43.733.822.5*

與相應(yīng)空白對照組比較，*P<0.05

2.4 蛋白表達分析

細胞周期分析結(jié)果表明吉馬酮、芝麻素和褐藻多糖硫酸酯誘導(dǎo)肝癌細胞G2/M期阻滯，淫羊藿素誘導(dǎo)肝癌細胞S期阻滯，據(jù)此結(jié)果，我們采用Western blot分析與G2/M和S期阻滯相關(guān)的細胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B1、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1和CDK2、促凋亡蛋白Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況。結(jié)果表明，4種藥物處理48 h后，均呈現(xiàn)促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下調(diào)；吉馬酮和褐藻多糖硫酸酯處理后細胞周期蛋白Cyclin B1和細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1的表達呈現(xiàn)下調(diào)，Cyclin A和CDK2的表達沒有明顯變化；淫羊藿素處理后Cyclin A和CDK2呈現(xiàn)表達下調(diào)，Cyclin B1和CDK1的表達沒有明顯變化；芝麻素處理后呈現(xiàn)Cyclin A、Cyclin B1和CDK2的表達下調(diào)，CDK1表達沒有明顯變化；而且相關(guān)蛋白的表達水平變化隨著藥物濃度的增加而加強，具體結(jié)果如圖2所示。

3 討論

肝癌是全世界最常見的癌癥之一，中國是肝癌的重災(zāi)區(qū)，中國肝癌人數(shù)及死亡率均居世界之首。肝癌目前主要的治療手段包括手術(shù)、化療和放療等，然而由于現(xiàn)有的治療措施對人體的副作用很大，治療過程中嚴重損害機體的自身免疫力，而且肝癌擴散速度快、術(shù)后高復(fù)發(fā)率及肝癌細胞對于傳統(tǒng)抗癌藥物的耐藥性，使得開發(fā)高效低毒的抗癌新藥迫在眉睫。

天然產(chǎn)物是指動物、植物、昆蟲、海洋生物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物以及人和動物體內(nèi)許許多多內(nèi)源性的化學(xué)成分，如生物堿、黃酮、萜類、糖類、木脂素等，其中包括大量具有生理活性的物質(zhì)。從天然產(chǎn)物中開發(fā)預(yù)防和治療癌癥的活性成分已成為研究熱點，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種有抗癌藥物潛力的天然產(chǎn)物，如紫杉醇、β-欖香烯等已經(jīng)應(yīng)用于癌癥的臨床治療[4，9]。

與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖1 HepG2細胞分別經(jīng)4種藥物處理24 h和48 h后細胞增殖率的變化Fig.1 Cell growth rate variation of HepG2 after treatment of four drugs for 24 h and 48 h

圖2 4種藥物對HepG2細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effect of four drugs on expression of proliferation- and apoptosis-related proteins in HepG2

吉馬酮是中藥莪術(shù)的揮發(fā)油中的一種，莪術(shù)有抗腫瘤、抗血栓等作用[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油中的5種揮發(fā)油對多種腫瘤細胞均有較強的抑制作用，其中吉馬酮對人肝癌細胞HepG2具有較強的抑制作用[5]。淫羊藿素是淫羊藿活性成分之一，是淫羊藿苷在體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，在一定濃度內(nèi)具有雌激素樣作用[12]。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，淫羊藿是一種補陽、強心、堅骨的藥物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素對多種腫瘤具有抗腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿素通過下調(diào)促血管生成因子、上調(diào)抑制血管生成因子，拮抗腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長[6]；通過PI3K/AKT信號通路激活、抑制非小細胞肺癌H460細胞增殖,達到抗腫瘤作用[13]。所以，淫羊藿素廣泛用于乳腺癌、肺癌、肝癌的治療研究中。芝麻素主要是存在于芝麻籽中的全天然木脂類化合物，具有抗氧化、抗菌、減低膽固醇調(diào)節(jié)血脂、護肝、抑制腫瘤等多種功效，研究認為低濃度芝麻素的飲食可以抑制肝癌的形成[14]，本研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L的芝麻素48 h可誘導(dǎo)細胞凋亡率達41.8%，與以往的研究結(jié)果相吻合。而且芝麻素與現(xiàn)代化療藥物CTX或5-FU聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的治療，具有明顯的協(xié)同增效和減毒作用[7]。褐藻多糖硫酸酯是海洋褐藻的主要生物活性物質(zhì)，早期的研究側(cè)重點主要在其抗氧化作用方面，近期對于其抗腫瘤作用機制的研究有了一定的發(fā)現(xiàn)，研究認為低濃度的褐藻多糖硫酸酯對肝癌細胞體外生長抑制不明顯，而濃度高于0.1 mg/mL時對細胞因子的分泌有促進趨勢，可提高細胞與分子免疫應(yīng)答水平，調(diào)節(jié)細胞因子分泌，發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。本研究則發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯0.2 g/L開始出現(xiàn)抑制作用，4 g/L時細胞凋亡率可達到43.7%，當然還可能與細胞中還原型GSH耗竭，ROS過度積累致線粒體損傷，從而啟動內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)[8]。

以前對于以上天然藥物的研究都是單一性的，本研究希望同時比較這4種藥物在同一條件下的抗腫瘤效應(yīng)。HepG2細胞作為最經(jīng)典的肝癌細胞系之一，廣泛用于抗肝癌藥物的研究。我們通過比較吉馬酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯對HepG2細胞的影響來集中探討并比較這4種天然藥物的各自抗腫瘤作用機制。

本研究以HepG2細胞為研究對象，從細胞和分子水平研究了吉馬酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯等4種天然藥物對HepG2細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響以及調(diào)控機制。結(jié)果表明4種藥物對人肝癌細胞HepG2均表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用，特別是淫羊藿素效果顯著，48 h半抑制濃度僅為30 μmol/L。

進一步探索其作用機制，發(fā)現(xiàn)吉馬酮和褐藻多糖硫酸酯通過下調(diào)G2/M檢查點相關(guān)的周期蛋白Cyclin B1及其激酶CDK1的表達來誘導(dǎo)G2/M期周期阻滯；芝麻素下調(diào)G2/M檢查點相關(guān)的周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1及其激酶CDK2的表達來誘導(dǎo)G2/M期周期阻滯；淫羊藿素則通過下調(diào)S期檢查點相關(guān)的周期蛋白Cyclin A及其激酶CDK2的表達來誘導(dǎo)S期周期阻滯。4種藥物均通過下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，使HepG2細胞不能通過檢查點，無法進入分裂期，從而抑制其增殖。

誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的一個重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素、淫羊藿素和褐藻多糖硫酸酯均顯著促進HepG2細胞凋亡，吉馬酮亦具有一定的誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用。4種藥物均提高促凋亡蛋白Bax的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

通過比較發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素對HepG2細胞的作用效果最為顯著，其他3種藥物亦表現(xiàn)出較為明顯的抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用。本研究從細胞和分子水平初步探討4種藥物抑制HepG2細胞的關(guān)鍵作用靶標，探索其發(fā)揮藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，為開發(fā)新的安全有效的抗腫瘤藥物提供了一定的細胞學(xué)和分子生物學(xué)依據(jù)。

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(2016-06-12 收稿)

Comparison of Inhibitory Effect of Four Natural Medicines on Proliferation of HepG2 Cell Lines

Zhang Shuqin1，Hu Chiding2，Chen Xi3etal

1NeurologyDepartment，2OncologyDepartment，JianghanUniversityAffiliatedHospital，Wuhan430015，China3InfectionManagementDepartment，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To compare the effect of germacrone，sesamin，icaritin and fucoidan on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and study the underlying mechanism during those processes.Methods MTT assay was used to test the effect of the four natural medicines on proliferation of HepG2 cells.Apoptosis of the cells was detected by flow cytometry.The expression of several key proliferation- and apoptosis-related proteins was investigated by Western blotting.Results The four medicines inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner.The highest inhibition effect was induced by icaritin，and its IC50of 48 h treatment was 30 μmol/L.All the medicines induced apoptosis of HepG2 cells.Icaritin showed the most remarkable effect in inducing cell apoptosis.After treatment with 30 μmol/L icaritin for 48 h，apoptosis rate reached 51.1%.The medicines reduced the expression of Cyclin A，CyclinB1，CDK1，CDK2 and Bcl-2，and increased the protein expression of Bax.Conclusion The four medicines inhibit proliferation of HepG2 and induce its apoptosisinvitrosignificantly.The effect of icaritin is the most significant.The mechanism may be related with the regulation of several Cyclins，Bax and Bcl-2.

germacrone； sesamin； icaritin； fucoidan； HepG2 cell； proliferation； apoptosis

*武漢市科技攻關(guān)計劃資助項目(No.201260523185)；華中科技大學(xué)教學(xué)研究基金資助項目(No.14058)

R735.7

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.018

張淑琴，女，1967生，副主任醫(yī)師，E-mail：ltp670910@163.com

△通訊作者Corresponding author，E-mail：cmj@hust.edu.cn