陳 磊，許 晶，韓紅娟，邱 瑾，孫百慧，彭日荷，姚泉洪

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106）

畢赤酵母表達(dá)羅氏耶爾森氏菌（Yersinia rohdei）植酸酶和酶學(xué)特性研究

陳 磊1，2，許 晶2，韓紅娟2，邱 瑾1，2，孫百慧1，2，彭日荷2，姚泉洪2

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106）

按畢赤酵母偏愛密碼子，將來自Yersinia rohdei的植酸酶基因（YrAPPA）進(jìn)行了化學(xué)合成，并成功在畢赤酵母GS-115中異源分泌表達(dá)，重組植酸酶分泌量能達(dá)到72 μg/mL。酶學(xué)特性研究結(jié)果表明：酶比活達(dá)到1 500 U/mg，重組植酸酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和4.5；純化的重組植酸酶能耐受60℃高溫，且pH 3—7.5范圍內(nèi)重組植酸酶有良好的穩(wěn)定性；Cu2+、Zn2+、Fe3+對(duì)植酸酶活性有抑制作用；重組植酸酶有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解特性。

植酸酶；酶學(xué)特性；畢赤酵母；電擊轉(zhuǎn)化；異源表達(dá)

植酸即肌醇六磷酸及其鹽類，廣泛存在于植物組織和相應(yīng)的糧食產(chǎn)品中，占其總量的1%—3%，其中磷含量占植物總磷的60%—90%，是磷和肌醇的主要儲(chǔ)存形式［1-2］。植酸鹽也可與蛋白質(zhì)形成難溶的配合物，植酸形式的磷不但不能被單胃動(dòng)物所消化利用，而且還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，會(huì)抑制多種營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用［3-6］。

植酸酶（E.C.3.1.3.8.肌醇六磷酸水解酶）是催化植酸（六磷酸環(huán)己六醇）及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱，屬于磷酸單酯水解酶，是組氨酸酸性磷酸酶家族的重要成員，它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中［7］。植酸酶可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷排出量減少40%，在飼料中添加植酸酶不僅可提高植物性飼料中磷的利用并減少糞便中磷的排放［8-10］，而且能夠通過降低植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，增加動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)和一些礦物質(zhì)元素的吸收能力［11-12］。因此對(duì)提高畜牧生產(chǎn)效率及降低磷對(duì)環(huán)境的污染有重要意義。

近年來，植酸酶在飼料工業(yè)中應(yīng)用更加廣泛，但各種不同的商業(yè)化植酸酶均存在一定缺陷，仍然有一些難題需要攻關(guān)。有必要開展新的植酸酶基因資源挖掘和功能研究，并最終利用畢赤酵母作為生物反應(yīng)器，進(jìn)行大規(guī)模低成本生產(chǎn)［13-16］。本研究設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了來自羅氏耶爾森氏菌的植酸酶基因，通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母（GS-115）細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)異源高水平分泌表達(dá)［17］，并對(duì)表達(dá)的植酸酶進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性研究。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體

畢赤酵母GS-115（His－Mut+）菌株，大腸桿菌（DH5α），pPIC9K酵母表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司；畢赤酵母GS-115細(xì)胞感受態(tài)，重組表達(dá)載體pYPX88（GenBank登錄號(hào)：AY178045）均為本實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備。

1.1.2 生化酶和試劑

Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自日本Takara公司；內(nèi)切糖苷酶購(gòu)于New England Biolab公司；其他所用藥品均為分析純，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器

電擊儀購(gòu)自Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN infinite M200瑞士帝肯公司。

1．2 方法

1.2.1 YrAPPA基因合成及表達(dá)載體的構(gòu)建

源自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的YrAPPA植酸酶基因序列（GenBank登錄號(hào)：ABU98779），在不改變植酸酶氨基酸序列的前提下，按照畢赤酵母密碼子偏愛優(yōu)化：選擇在畢赤酵母表達(dá)概率高的密碼子替換表達(dá)概率低的密碼子。YrAPPA基因序列優(yōu)化后，根據(jù)PTDS法［18］（PCR-based two-step DNA synthesis method，PTDS）進(jìn)行化學(xué)合成，設(shè)計(jì)大量帶有重疊序列的引物（表1），每個(gè)引物由60個(gè)寡核苷酸組成，相鄰引物之間存在20 bp的互補(bǔ)序列，第一步通過連續(xù)重疊延伸PCR法合成500 bp左右的中間片段；第二步將第一步合成的全部中間片段等比例混合并用作模板，使用基因最外側(cè)的一對(duì)引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)基因（圖1）。

表1 YrAPPA基因合成的引物Table 1 Primers of YrAPPA gene synthesis

（續(xù)表1）

圖1 YrAPPA基因的PCR擴(kuò)增合成策略Fig．1 Strategy of PCR amplification and synthesis of YrAPPA gene

使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，DNA膠回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上進(jìn)行DNA測(cè)序，獲得正確的帶有植酸酶合成基因YrAPPA的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Sac I雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的pPIC9K載體連接，得到重組表達(dá)載體pYPX88-YrAPPA。

1.2.2 表達(dá)載體pYPX88-YrAPPA電擊轉(zhuǎn)化

挑取畢赤酵母單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基（酵母提取物10 g/L，胰化蛋白胨20 g/L，pH 5.5，用前加入2%的葡萄糖）30℃過夜搖培活化畢赤酵母菌。取1 mL過夜菌接種于50 mL YPD，30℃，200 g/min揺菌至OD600＝1.6—1.8，然后根據(jù)Invitrogen手冊(cè)的方法制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。取2 μL Bgl II酶切后的pYPX88-YrAPPA載體和80 μL畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，混勻后冰浴5 min，在電壓1.75 kV，電阻400 Ω條件下電擊轉(zhuǎn)化，點(diǎn)擊后立即加入800 μL預(yù)冷的0.6 mol/L山梨醇溶液。將混合液離心棄上清，用100 μL無菌水懸浮菌體，并涂布于SD-山梨醇平板（補(bǔ)充材料），置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.3 陽(yáng)性畢赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性菌落接種于100 mL BMGY培養(yǎng)基（500 mL/L 2SD，10 g/L酵母提取物，20 g/L胰化蛋白胨，5 μL/L 4×106倍生物素，pH 5.8，用前添加1%甘油），30℃搖床連續(xù)培養(yǎng)約2 d，達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為5.0）時(shí)，離心收集菌體，加入適量無菌水清洗沉淀，清除殘留的甘油。加入20 mL BMMY培養(yǎng)基（2SD培養(yǎng)基和蒸餾水1∶1混合，pH 5.8，用前添加1%甲醇）重新懸浮菌體，30℃連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，每隔24 h添加1%甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)植酸酶。培養(yǎng)至第3天，將菌液加入50 mL離心管中，置于4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清液即粗酶液，4℃冰箱保存。

1.2.4 植酸酶分離純化和SDS-PAGE分析

取1 mL粗酶液加入已經(jīng)用平衡緩沖液（pH 7.4；20 mmol/L HEPES，10 mmol/L咪唑，100 mmol/L NaCl）清洗的Ni2+-NTA瓊脂糖親和柱中，粗酶液完全流經(jīng)鎳柱后，加入兩次1 mL洗滌緩沖液（pH 7.4；20 mmol/L HEPES，30 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl）清洗掛柱的雜蛋白，最后加入3次500 μL洗脫緩沖液（pH 7.4；20 mmol/L HEPES，250 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl），洗脫掛柱的重組植酸酶蛋白。

通過去糖基化酶（Endo H）處理粗酶液：16 μL粗酶液和1.6 μL糖蛋白變性液混合后100℃變性10 min，再加入2 μL G5緩沖液和1 μL內(nèi)切糖苷酶H混勻，在37℃溫育2 h；將純化后的粗酶液和去糖基化后的酶液采用SDS-PAGE（12%分離膠和5%積層膠）進(jìn)行鑒定，并使用Bradford法測(cè)定酶液蛋白含量。

1．3 酶活分析

根據(jù)釩-鉬黃分光光度法［19］，5 μL的粗酶液和100 μL的5 mmol/L植酸鈉（溶于0.25 mol/L的乙酸緩沖液）混合后，在37℃反應(yīng)30 min后加入100 μL的顯色液（100 g/L的鉬酸銨溶液和2.35 g/L的偏釩酸銨溶液按1∶1混合使用）和200 μL硝酸溶液（硝酸和水1∶2）終止反應(yīng)。在415 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每個(gè)數(shù)據(jù)有3個(gè)重復(fù)。每分鐘內(nèi)從濃度為5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位（1 U）。

配置50 mmol/L的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀（稱取0.6804 g磷酸二氫鉀，用pH 5.5的乙酸緩沖液定容到100 mL），再分別用蒸餾水將其稀釋為1.5625 μmol/mL、3.1250 μmol/mL、6.2500 μmol/mL、12.500 μmol/mL、25.000 μmol/mL五個(gè)濃度梯度。每個(gè)濃度梯度分別做1個(gè)空白對(duì)照（用蒸餾水代替磷酸二氫鉀）和3組重復(fù)試驗(yàn)，在標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)取平均值表示。

1.3.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性

用0.2 mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH 4.0）稀釋好的粗酶液，與植酸鈉混合（反應(yīng)體系如1.3）后在不同溫度下（10—85℃，每間隔5℃）反應(yīng)30 min，根據(jù)釩-鉬黃分光光度法后測(cè)OD415計(jì)算酶的相對(duì)酶活，以酶最高相對(duì)活性所對(duì)應(yīng)的溫度為最適溫度。

分別在3個(gè)不同溫度（60℃，65℃和70℃）下溫育粗酶液，測(cè)定重組植酸酶的熱穩(wěn)定性。每隔5 min（0—30 min）取出酶液，在最適條件下（55℃，pH 4.5）反應(yīng)30 min后根據(jù)釩-鉬黃分光光度法測(cè)得OD415計(jì)算酶的相對(duì)酶活。以上均利用變性失活的粗酶液作為空白對(duì)照，每組數(shù)據(jù)均有3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性

將植酸鈉分別溶解在不同pH值緩沖液中：0.2 mol/L Gly-HCl（pH 1.0—3.5），0.2 mol/L NaAc-HAc（pH 4.0—6.5），0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.0—8.5）和Gly-NaOH（pH 9.0—10.0），在55℃下反應(yīng)30 min后，根據(jù)釩-鉬黃分光光度法測(cè)OD415計(jì)算酶的相對(duì)酶活，以酶最高相對(duì)活性所對(duì)應(yīng)的pH值為最適pH。

pH穩(wěn)定性研究是將粗酶液加入不同緩沖液（同上）中，37℃處理30 h后，在最適條件下（55℃，pH 4.5）反應(yīng)30 min，根據(jù)釩-鉬黃分光光度法測(cè)得OD415，并計(jì)算酶的相對(duì)酶活。以變性失活的粗酶液作為空白對(duì)照，每組數(shù)據(jù)均有3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活力的影響

0.2 mol/L NaAc-HAc（pH 4.5）緩沖液分別溶解不同金屬離子溶液［KNO3、NaCl、Ca（NO3）2、（NH4）2SO4、MgSO4、ZnSO4、AlCl3、NiCl2、CoCl2、FeCl3、LiCl、MnCl2、CrCl3、CuSO4、BaCl2］，離子最終濃度為2 mmol/L。在37℃溫育30 min后在最適條件下（55℃，pH 4.5）反應(yīng)30 min，根據(jù)釩-鉬黃分光光度法測(cè)得重組植酸酶的剩余酶活性，以未加入金屬離子處理的重組植酸酶活為空白對(duì)照。

1.3.4 蛋白酶對(duì)重組植酸酶酶活的影響

用0.2 mol/L Gly-HCl（pH 2.0）和0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液分別稀釋好胃蛋白酶和胰蛋白酶，將稀釋好的消化蛋白酶液與植酸酶按一定重量比例［蛋白酶/植酸酶（w/w）：500/1、400/1、200/1、100/1、50/1、1/1、1/50、1/100、1/200、1/400、1/500］混合。在37℃處理5 h后，最適條件下（55℃，pH 4.5）反應(yīng)30 min，根據(jù)釩-鉬黃分光光度法測(cè)得不同質(zhì)量比消化酶液處理下重組植酸酶的剩余酶活，以未經(jīng)過消化酶液處理的重組植酸酶酶活作空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2．1 YrAPPA基因合成

為了實(shí)現(xiàn)YrAPPA基因在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)，本研究根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子對(duì)基因進(jìn)行了化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，在基因3’端引入了編碼6×His的核苷酸序列，便于表達(dá)后蛋白的分離純化；消除了野生型基因中編碼N端23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽基因序列（如圖2所示下劃線序列）；分別在基因5’和3’末端添加BamH I和Sac I限制性酶切位點(diǎn)（如圖2中方框序列所示）；合成基因與野生型基因的核苷酸序列同源性為71.17%（圖2）。

圖2 YrAPPA合成基因（YrAPPA-OP）和野生型基因（YrAPPA-WT）序列比對(duì)Fig．2 Sequence alignment of synthetic gene（YrAPPA-OP）and wild gene（YrAPPA-WT）

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)植酸酶Fig．3 Detection of phytase from P．pastoris by SDS-PAGE

2．2 SDS-PAGE分析

在經(jīng)過72 h誘導(dǎo)培養(yǎng)后，重組植酸酶分泌表達(dá)量達(dá)到了72 μg/mL，根據(jù)酶比活定義計(jì)算得到重組植酸酶的比活為1 500 U/mg。經(jīng)SDS-PAGE分析，圖3中粗酶液泳道中蛋白條帶單一且沒有雜蛋白條帶的出現(xiàn)，重組植酸酶經(jīng)過內(nèi)切糖苷酶H去糖基化后與未去糖基化的分子量均為47 kDa，而且與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的分子量理論值相當(dāng)，這些結(jié)果都表明重組植酸酶并沒有被糖基化修飾。

2．3 最適溫度和熱穩(wěn)定性

如圖4所示：重組植酸酶的最適溫度在55℃，而且在25—60℃范圍內(nèi)酶活比較穩(wěn)定，相對(duì)酶活均在50%以上；圖5所示酶的熱穩(wěn)定性研究，設(shè)定酶液在55℃下的相對(duì)酶活為100%。結(jié)果顯示，置于60℃溫育10—30 min，植酸酶的相對(duì)酶活都比較穩(wěn)定，均在40%左右，而在65℃和70℃下，相對(duì)酶活僅20%左右；因此60℃條件下植酸酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于65℃和70℃。

圖4 植酸酶的最適溫度Fig．4 Optimum temperature for phytase

圖5 植酸酶的熱穩(wěn)定性Fig．5 Thermal stability of phytase

2．4 最適pH和pH穩(wěn)定性

通過在不同的pH條件下測(cè)定酶的相對(duì)酶活，圖6結(jié)果顯示，植酸酶的最適pH為4.5，在pH為2—6的范圍內(nèi)，植酸酶相對(duì)酶活均在50%以上，說明酶在酸性條件下有很好的活性；在pH 3—7.5范圍內(nèi)相對(duì)酶活均在60%以上。以上結(jié)果說明植酸酶的pH適宜范圍比較寬，在偏酸和弱堿性區(qū)域有很好的適應(yīng)性。

2．5 金屬離子對(duì)重組植酸酶活性的影響

通過2 mmol/L的不同金屬離子處理，0.5 h后分析對(duì)植酸酶酶活的影響。圖7結(jié)果顯示，Cu2+、Fe3+和Zn2+對(duì)重組植酸酶有很強(qiáng)的抑制作用，剩余相對(duì)酶活分別為14.77%、35.59%和38.04%，對(duì)重組植酸酶的抑制均超過50%，尤其是Cu2+的抑制作用最大。其他的如Ni2+、Mg2+、Cr3+、Co2+等其他離子對(duì)酶的抑制僅有百分之十幾，對(duì)酶活影響較小。

圖6 植酸酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性Fig．6 Optimum pH and pH stability of phytase

圖7 金屬離子對(duì)植酸酶的影響Fig．7 Effects of metal ions on phytase activity

2．6 蛋白酶對(duì)YrAPPA植酸酶活性的影響

圖8顯示，胃蛋白酶液處理重組植酸酶5 h后，在w/w為1/500—400/1，重組植酸酶的剩余酶活大于65%，即使在抑制作用最強(qiáng)（w/w：500/1）的情況下，重組植酸酶酶活還剩余53.72%。但是胰蛋白酶液處理重組植酸酶5 h后，胰酶/植酸酶（w/w）在1/400—1/1間植酸酶的剩余活性均在100%以上，在質(zhì)量比為50/1時(shí)植酸酶的剩余酶活降為100%以下；這說明了重組植酸酶對(duì)于胰蛋白酶和胃蛋白酶均具有有良好的抗水解的能力。

2．7 重組植酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

通過雙倒數(shù)作圖法：以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，如圖9所示，根據(jù)回歸方程計(jì)算得到米氏常數(shù)Km＝0.37 μmol/mL，最大反應(yīng)速率Vm＝0.89 μmol/（mL·min）。

圖8 胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)植酸酶的影響Fig．8 Effects of pepsin and trypsin on phytase activity

圖9 雙倒數(shù)圖Fig．9 The Lineweaver-Burk plot

3 討論

本研究對(duì)源自羅氏耶爾森氏菌的植酸酶YrAPPA基因進(jìn)行了優(yōu)化，包括：在不改變氨基酸序列的前提下，按宿主細(xì)胞的偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，提高基因翻譯效率；消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，便于載體構(gòu)建；消除逆向重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性；優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能，以提高基因表達(dá)效率。在完成基因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，用本實(shí)驗(yàn)室建立的PTDS法對(duì)YrAPPA基因進(jìn)行了化學(xué)合成，并且成功在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高水平的異源表達(dá)。PTDS法操作簡(jiǎn)便，不需要DNA模板，引物也不需要磷酸化，通過一系列帶有互補(bǔ)序列的引物合成外源基因。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有較少外分泌蛋白干擾、高水平表達(dá)和蛋白翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)。本研究中，優(yōu)化后的YrAPPA基因在畢赤酵母中獲得高水平分泌表達(dá)，且重組植酸酶具有很高的比活力（1 500 U/mg）。如果將該重組植酸酶應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，有望大幅度降低生產(chǎn)成本。

YrAPPA植酸酶的活性受很多金屬離子的調(diào)節(jié)，如Cu2+、Fe3+和Zn2+金屬離子抑制植酸酶活性60%以上。而Ni2+、Mg2+、Cr3+等離子對(duì)重組植酸酶的酶活只有百分十幾的抑制作用，這與植酸可與多價(jià)的金屬離子形成難溶的螯合物［12］，降低了底物的有效濃度從而使相對(duì)酶活有些下降有關(guān)。

用胃蛋白酶（w/w：500/1）液處理5 h后，植酸酶剩余酶活為53.72%；但是經(jīng)1/400—1/1（w/w）胰蛋白酶液處理5 h后，重組植酸酶的酶活有所提升，表現(xiàn)出抗胰化蛋白酶水解的特點(diǎn)。在其他的植酸酶研究中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過胰蛋白酶處理后植酸酶的酶活會(huì)有所增加［20-22］，推測(cè)可能是被胰蛋白酶水解生成的植酸酶小片段中有活性更高的抗胰蛋白酶多肽存在，從而增加了植酸酶的活性。

在目前商業(yè)化應(yīng)用中，對(duì)于重組植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑主要存在三個(gè)關(guān)鍵性的難題，包括：胃液中酸性環(huán)境對(duì)酶活性的抑制，熱穩(wěn)定性差影響植酸酶造粒以及動(dòng)物腸胃中胃蛋白酶對(duì)于植酸酶的水解而降低活性［23-24］。而本研究所得到的重組植酸酶有明顯的優(yōu)勢(shì)：首先，重組植酸酶有比較好的耐熱性，在60℃溫育30 min后還有40%以上的剩余酶活，能夠較好地解決植酸酶在飼料生產(chǎn)過程中因高溫制粒導(dǎo)致剩余酶活偏低的問題；其次，該酶有比較穩(wěn)定和廣泛的pH范圍，在pH 3—7.5溫育30 h后重組酶還剩余60%以上酶活，說明該酶在消化道內(nèi)比較復(fù)雜的酸度環(huán)境下有比較好的耐受能力；對(duì)重組植酸酶的抗消化酶能力的研究發(fā)現(xiàn)，該酶具有良好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力，尤其是抗胃蛋白酶的能力很強(qiáng)，胃蛋白酶在1/100—400/1（w/w）之間重組植酸酶的剩余酶活比較穩(wěn)定，即使在抑制作用最強(qiáng)（w/w：500/1）時(shí)，重組植酸酶還剩余50%以上酶活。本研究所得到的YrAPPA植酸酶的相關(guān)酶學(xué)特性的數(shù)據(jù)，尤其是蛋白酶對(duì)于酶活的影響，為實(shí)際應(yīng)用和后續(xù)研究提供了重要的參考。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Expression of phytase from Yersinia rohdei in Pichia pastoris and its enzymatic characteristics

CHEN Lei1，2，XU Jing2，HAN Hong-juan2，QIU Jin1，2，SUN Bai-hui1，2，PENG Ri-he2，YAO Quan-hong2*
（1College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Yersinia rohdei phytase gene（YrAPPA）was chemically synthesized according to the codon usage of Pichia pastoris and successfully expressed in P.pastoris GS-115，with the secretion yield of recombinant phytase being up to about 72 μg/mL.The enzymatic characterization showed that the specific activity of enzyme is 1 500 U/mg，and the optimal reacting temperature and pH of recombinant phytase are respectively 55℃and 4.5；The purified recombinant phytase can tolerate high temperature at 60℃and has a good stability within pH 3—7.5；The phytase whose activity is inhibited by Cu2+，Zn2+and Fe3+has characteristics resistant to trypsin and pepsin.

Phytase；Enzymatic property；Pichia pastosis；Electroporation；Heterologous expression

Q78

A

1000-3924（2016）06-018-08

2015-12-07

上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（143919NO300）；上海市種業(yè)發(fā)展項(xiàng)目［滬農(nóng)科種字（2016）第1-2號(hào)］

陳磊（1990—），男，在讀碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。Tel：13262988682，E-mail：chenleihefei＠163.com

*通信作者：姚泉洪（1965—），男，研究員，研究方向：植物和微生物基因工程。E-mail：yao.quanhong65＠yahoo.com