胡洪濤++朱志剛++閔勇++楊自文++黃大野++姚經(jīng)武++楊妮娜++龍同++程賢亮

摘 要：通過(guò)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，銅陵白姜姜瘟病在銅陵當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)出木質(zhì)部黃心和黑心2種癥狀，通過(guò)TTC平板分離、致病性測(cè)定、16S rDNA以及青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測(cè)表明，導(dǎo)致2種不同姜瘟病癥狀的病原菌均為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），但二者致病性存在明顯差異。

關(guān)鍵詞：銅陵；白姜；姜瘟??；青枯雷爾氏菌；病原鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S632.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2016）24-0075-04

由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌）侵染造成的細(xì)菌性青枯病是世界性重要病害之一，該菌可侵染54個(gè)科的450多種植物[1]，但以茄科作物，如番茄、馬鈴薯等，受害最為嚴(yán)重。生姜青枯病，因其發(fā)病快、死亡率高、無(wú)有效防治手段，所以俗稱(chēng)姜瘟病[2]。安徽銅陵白姜種植歷史悠久，姜塊色白鮮嫩汁多、香味純正、品質(zhì)優(yōu)良，并具藥用價(jià)值，宋朝時(shí)被列為朝廷貢品，被譽(yù)為銅陵“八寶”之一。銅陵白姜種植面積約為400 hm2，年產(chǎn)量約為4 000 t，年產(chǎn)值近億元，是當(dāng)?shù)刂匾奶厣r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)[3]。銅陵市義安區(qū)是銅陵白姜主產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)該區(qū)姜瘟病的發(fā)生日益嚴(yán)重，連作田發(fā)病率50%以上，重病田甚至絕收，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)厣a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。盡管對(duì)姜瘟病的研究進(jìn)行多年，然而對(duì)銅陵姜瘟病病原的研究甚少。為此，開(kāi)展了銅陵白姜姜瘟病病原檢測(cè)的研究，以期為進(jìn)一步有效防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2016年5～8月，在銅陵市義安區(qū)興化村等主要白姜產(chǎn)區(qū)分別挖取葉部呈現(xiàn)萎蔫狀的生姜姜塊，用清水將其表面泥土沖洗干凈，吸水紙吸干，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 病原菌分離

病原菌分離均于采樣后48 h內(nèi)在超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)A2）上完成。樣品先用無(wú)菌水沖洗3遍，晾干至表面無(wú)明顯水滴，在75%的酒精中浸泡2～3 min，再用無(wú)菌水沖洗3遍，晾干至表面無(wú)明顯水滴，用消毒刀片在姜塊中部表面切一道長(zhǎng)2～4 cm、深約2 mm的切口，用消毒鑷子將其掰開(kāi)，并用消毒牙簽蘸取姜塊中間部位汁液，在TTC平板上劃線分離[4]。將分離平板置

于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，所得單菌落超低溫

（-80℃）保存于25%甘油管中。

1.3 致病性測(cè)定

病原菌制備：將病原分離物，接種于SPA液體培養(yǎng)基[5]，搖床（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)DLHR-Q200）發(fā)酵48 h（28℃，150 r/min）后，將分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器721型）OD560值調(diào)至1.0，測(cè)定菌液濃度約為1×108 CFU/mL，備用。

將溫室生長(zhǎng)至5～8葉的銅陵白姜植株從營(yíng)養(yǎng)缽中取出，用清水將根部沖洗干凈，用消毒針在莖基部刺3個(gè)深度和間隔均約為1 cm的針孔，而后將根系置入病原菌發(fā)酵液中浸泡20 min。無(wú)菌水處理作為對(duì)照。每處理5株，重復(fù)2次。處理后的植株立即種植于營(yíng)養(yǎng)缽中，置于人工氣候箱（光周期

12 h/8 h，溫度30℃，濕度85%）內(nèi)培養(yǎng)7～10 d。

1.4 16S rDNA檢測(cè)

純化后的病原分離物直接用PCR擴(kuò)增，采用16S rDNA通用引物對(duì)（F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×ES Taq Mix 25μL，正反引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.5 青枯菌鞭毛基因（fliC）基因檢測(cè)

根據(jù)NCBI中青枯菌鞭毛基因（fliC）序列設(shè)計(jì)引物對(duì)（F：5'-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3'，R：5'-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3'）。反應(yīng)體系和條件同1.4。

1.6 進(jìn)化樹(shù)分析

進(jìn)化樹(shù)分析在MEGA 7.0中完成。首先，采用Clustalw進(jìn)行DNA序列比對(duì)（DNA Weight Matrix：IUB，其他采用默認(rèn)參數(shù)）。進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用Maxium Likehood方法、Tamura-Nei模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜瘟病田間癥狀

在銅陵義安村田間調(diào)查表明，感染植株在患病初期，葉片褪綠，葉尖和葉緣先黃化，逐漸萎縮反卷下垂（圖1A、B），病葉逐步從基部向上發(fā)展，至全株枯死。病株莖基部逐漸變軟，維管束變色褐化、呈水漬狀，擠壓時(shí)，有污白色菌膿流出?；疾〗獕K變軟、維管束變色，根據(jù)維管束顏色，可分為黃色和黑色2種，俗稱(chēng)為黃心（圖1C-a）和黑心（圖1C-b）。黑心和黃心患病植株的姜塊木質(zhì)部分別呈現(xiàn)黃色、黑色，而地上部癥狀無(wú)明顯差異，但相對(duì)于黃心癥狀，黑心癥狀病株萎蔫更快，病程更短。

2.2 致病性測(cè)試

致病性測(cè)試結(jié)果顯示，在接種后12 d后，植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀、卷縮，葉尖和葉緣失綠黃化，與田間病株癥狀完全一致（圖2），表明所分離的病原物為姜瘟病病原。然而，接種黑心癥狀病原的植株萎蔫程度更甚、失綠更為嚴(yán)重，提示黑心癥狀病原的致病性可能更強(qiáng)。

2.3 病原形態(tài)鑒定

導(dǎo)致白姜黑心和黃心癥狀的病原分離物在TTC培養(yǎng)基菌落均為近圓形或梭形，中間略微凸起、中間粉紅色至紅色、周?chē)鸀榘咨?。病原菌均為單胞、桿狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.0）μm，革蘭氏染色陰性，而結(jié)晶紫染色顯示兩極著色深，與前人報(bào)道一致[6，7]。

2.4 16S rDNA測(cè)序

采用16S rDNA通用引物對(duì)擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果表明，2種癥狀病原分離物的16S rDNA產(chǎn)物長(zhǎng)度均為1 439 bp（NCBI序列號(hào)：KX785159.1和KX785160.1）。黃心和黑心癥狀病原的16S rDNA序列與NCBI里保存的青枯雷爾氏菌有高度相似性（>99%）（圖3），而與其他菌如Bukholderia、Bacillus等，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，表明無(wú)論是黃心還是黑心癥狀病原菌均為青枯雷爾氏菌。

2.4 青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測(cè)

為進(jìn)一步確定銅陵白姜姜瘟病病原，根據(jù)前人研究結(jié)果[8]，針對(duì)青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）在NCBI上設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，用于青枯菌特檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。測(cè)序結(jié)果顯示，黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為368、370 bp。由于5'端20～30 bp和3'端10 bp測(cè)序質(zhì)量較低，因此，將兩端低質(zhì)量的堿基去掉，所得序列與NCBI中所保存的青枯菌fliC基因序列進(jìn)行比對(duì)。如圖5所示，導(dǎo)致白姜黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因序列與NCBI保存的青枯菌完全一致。綜上所述，可以確定導(dǎo)致銅陵白姜黃心和黑心癥狀姜瘟病的病原均為青枯菌。

3 討論與結(jié)論

銅陵白姜為我國(guó)具有地方特色的名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，而近年來(lái)，日益嚴(yán)重的姜瘟病已經(jīng)給當(dāng)?shù)匕捉a(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，制約了白姜產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。然而長(zhǎng)期以來(lái)，缺乏對(duì)其病原菌的科學(xué)鑒定。本研究通過(guò)實(shí)地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)姜瘟病病株表現(xiàn)為黃心和黑心2種不同癥狀，而通過(guò)TTC平板分離、形態(tài)學(xué)、致病性測(cè)定和分子生物學(xué)等手段，對(duì)銅陵白姜姜瘟病病株進(jìn)行分離和鑒定，明確其病原均為青枯菌，但二者的致病性存在明顯差異。

16S rDNA序列分析是植物病原細(xì)菌鑒定和分類(lèi)的重要手段和依據(jù) [9]。經(jīng)序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析證明銅陵白姜姜瘟病2種癥狀的病原與已知青枯菌在同一分支。然而，盡管2種癥狀病原遺傳距離相當(dāng)近，但仍然存在微小差距。盡管青枯菌特異性鞭毛基因擴(kuò)增結(jié)果表明，黃心和黑心癥狀病原的序列與已知青枯菌完全一致，但由于致病性和16S rDNA序列存在差異，提示導(dǎo)致黃心和黑心癥狀青枯菌可能為不同的株系或者分化型[8]。前人研究表明，不同地區(qū)或寄主的青枯菌表現(xiàn)出明顯生理分化或菌系多樣性[10]，而在地理位置和寄主相同的情況下，發(fā)現(xiàn)毒力差異性的青枯菌的相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。青枯菌的致病性受多種基因調(diào)控[11]，如果能從基因組學(xué)角度，深入研究其在DNA和轉(zhuǎn)錄組水平方面的差異，將有助于揭示青枯菌致病性的調(diào)控機(jī)制[12]。

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