張成

·專論·

關于臨床判斷致病性突變和無害突變的思考

張成

神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?遺傳性疾病，先天性； 基因； 突變； 綜述

近年來，二代基因測序（NGS）技術的普及使諸多既往難以確定的、遺傳異質性較強的疾病，如肌萎縮側索硬化癥（ALS）、腓骨肌萎縮癥（CMT）、遺傳性痙攣性截癱（HSP）、脊髓小腦共濟失調（SCA）、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥（LGMD）等的致病性突變位點得以明確，為臨床診斷與遺傳咨詢提供重要信息。然而，臨床上常可以看到這樣一種現(xiàn)象，臨床醫(yī)師在面對二代基因測序技術提供的遺傳學信息時仍十分困惑，這是由于有些基因檢測結果與臨床表型不符，例如，臨床表現(xiàn)為肌肉病態(tài)疲勞，但檢測出的基因雜合突變信息卻是Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良癥（UCMD）；有些基因檢測結果不精確，1種疾病檢測出5～8種基因突變信息，難以準確定位致病性突變位點，例如肌萎縮側索硬化癥；有些基因檢測結果僅羅列出幾種不相關疾病的錯義突變，而讓臨床醫(yī)師分析和判斷；有些基因檢測結果包含2種及以上有害突變，如移碼突變、無義突變、可能改變蛋白質結構和功能的突變，讓臨床醫(yī)師選擇和判斷。上述情況不僅對臨床工作無實質性幫助，還可能引起臨床醫(yī)師對基因檢測的抵觸；同時亦反映出我國基因檢測設計與臨床實踐的脫節(jié)、對臨床醫(yī)師和患者需求和實用性考慮不周、基因檢測報告不規(guī)范、部分臨床醫(yī)師亟待補充遺傳學專業(yè)知識和對檢測報告解讀不熟悉等劣勢?；驒z測報告主要反映所檢測的突變是致病性突變還是無害突變，從而用于遺傳咨詢和指導臨床治療，本文是筆者對臨床判斷致病性突變或無害突變的幾點思考。

一、我國基因檢測及結果分析現(xiàn)狀與問題

1.我國基因檢測及結果分析的現(xiàn)狀 我國的基因檢測研究最早開始于醫(yī)學院?；蚩蒲袡C構實驗室，主要用于遺傳性疾病診斷、突變基因攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷；此后涌現(xiàn)出第3方商業(yè)性基因檢測機構，如中山大學達安基因有限公司、深圳華大基因科技有限公司、廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司等，進行基因檢測并對檢測結果進行解讀。隨著基因檢測技術的發(fā)展、檢測成本的降低和檢測知識的普及，該方法逐漸被臨床醫(yī)師和患者接受。特別是近年來二代基因測序技術的廣泛應用，極大地提高遺傳異質性較強的遺傳性疾病亞型的明確診斷率，如LGMD2A、2B和2D型，家族性肌萎縮側索硬化癥（FALS）1、6和10型，這些均是產(chǎn)前診斷的前提。二代基因測序技術還可以檢出可治性遺傳性疾病，如多巴反應性肌張力障礙（DRD）［1］、Pompe?。?］、結節(jié)性硬化癥（TSC）［3］、核黃素反應性脂質沉積病［4］、肝豆狀核變性［HLD，亦稱Wilson?。╓D）］、甲基丙二酸血癥（MMA）、苯丙酮尿癥，并經(jīng)特異性治療明顯改善臨床癥狀、改變疾病結局?；驒z測還可以指導臨床醫(yī)師對某種特殊臨床表型的觀察，例如，SCA34型是一種罕見亞型，主要表現(xiàn)為共濟失調，應進行共濟失調基因包檢測，檢測結果提示可能是SCA34型；進而查閱相關資料發(fā)現(xiàn)該病除共濟失調外，還有皮膚損害，且隨年齡增長皮膚損害癥狀逐漸減輕；再次檢查患者皮膚，可見背部和頸部皮膚損害，但不太明顯，無疼痛和瘙癢；追問病史，10歲前皮膚損害明顯，現(xiàn)26歲皮膚損害明顯減輕，符合SCA34型臨床特點；進一步分析其家系，發(fā)現(xiàn)該基因突變存在共分離現(xiàn)象，最終明確診斷。此外，基因檢測提示發(fā)作性共濟失調6型（EA6型）時亦提醒臨床醫(yī)師在詢問病史時應注意共濟失調的規(guī)律性。ATP結合盒轉運體D1（ABCD1）基因突變的確定對明確診斷腎上腺脊髓神經(jīng)?。ˋMN）至關重要，可以排除其他遺傳性痙攣性截癱。近3年國內(nèi)成立數(shù)十家基因檢測機構，為全國各地患者提供服務，各有特色，但在檢測程序、服務質量、檢測結果解讀和與臨床醫(yī)師溝通方面仍存有問題。

2.我國基因檢測及結果分析存在的問題 基因檢測機構方面，基因檢測報告設計不合理、不規(guī)范；羅列出數(shù)十個基因突變位點，讓臨床醫(yī)師自己分析和判斷；相關信息未經(jīng)歸類整理，重點不突出；陽性檢出率低，例如，一家檢測1萬余例血液標本的基因檢測機構陽性檢出率僅約20%?；驍?shù)據(jù)分析方面，人為漏掉有價值的基因信息。臨床醫(yī)師方面，由于臨床工作十分繁忙，門診沒有時間對基因檢測結果認真分析；對遺傳學專業(yè)知識掌握不全面；對基因檢測報告列出的基因名稱、相應臨床表現(xiàn)不熟悉，難以與患者相對應；面對花費高額基因檢測費用的患者和家屬，其檢測結果為臨床意義未明，即使有很多原因，臨床醫(yī)師仍難以向患者解釋；未有效動員核心家系成員對臨床意義不明的突變位點進行驗證；對各種基因包內(nèi)容不熟悉，如對有明確臨床表型的Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者未進行相應基因包檢測?；颊叻矫?，對于基因檢測的各種變異，僅希望知道是否為致病性突變，希望獲得明確答復；基因檢測結果提示是否能夠對治療有幫助，能否預防疾病發(fā)生，以阻斷疾病在該家系中傳遞。

二、導致上述問題的原因

臨床醫(yī)師方面，未提供較為詳細和重要的臨床信息，包括病史，臨床特點，生物化學、電生理學和病理學資料，家族史；送檢的血液標本不系統(tǒng)，只有先證者而無家系中其他成員血液標本；線粒體腦肌?。∕E）患者只有血液標本而無肌肉標本等?；驒z測方面，對所檢測疾病癥狀與體征、診斷要點不熟悉；從未見過所檢測的患者；漏掉對疾病診斷有價值的信息；未識別出已檢測到的致病性突變信息，如純合突變，而其他基因檢測機構再次測序時結果相同并識別出致病性突變?；颊叻矫妫刺峁┰敿?、準確的家族史；重要家族成員未進行檢測而無法分析該基因在家系中是否存在共分離現(xiàn)象，而不能明確診斷。

三、解決上述問題的建議

1.熟悉判斷致病性突變和無害突變的原則和方法 基因突變可以分為致病性突變和無害突變。因此，臨床醫(yī)師應了解致病性突變類型，包括無義突變、移碼突變、剪接位點突變、起始密碼突變、缺失突變、重復突變、動態(tài)突變，這些突變破壞基因所編碼的蛋白功能而致病。關于錯義突變，重點分析其是否破壞所在基因功能且在家系中存在共分離現(xiàn)象［5］。通常致病性突變僅有1種，如DMD基因缺失突變、重復突變或點突變，而2種或以上突變少見，如DMD基因雙段缺失或重復突變［6］。亦有少數(shù)患者同時患2種遺傳性疾病，例如，同時患Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥和葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥（G?6?PD）［7］，此類患者既有DMD基因致病性突變，亦有G6PD基因致病性突變；也有同時患Duchenne 型 肌 營 養(yǎng) 不 良 癥 和 腓 骨 肌 萎 縮 癥［8?9］、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥和先天性免疫缺陷綜合征［10］的病例報告。因此，如果基因檢測報告提示存在2種基因致病性突變或2個致病性突變位點，應判斷是否同時罹患2種遺傳性疾病。無害突變包括同義突變；大樣本普通人群中等位基因頻率＞5%的突變；同一家系中患者和正常對照者的基因型是混合的，正常對照者出現(xiàn)這種變異而患者未出現(xiàn)這種變異；同一例患者如果已發(fā)現(xiàn)明確的致病性突變且與臨床表型相符，則新發(fā)現(xiàn)的錯義突變可能是無害突變［11］。

2.根據(jù)臨床特征選擇不同基因檢測方法 對于臨床表現(xiàn)獨特的遺傳性疾病，如Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥（SMA）、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。∟F1）、結節(jié)性硬化癥等單基因遺傳病，臨床醫(yī)師和基因檢測人員易熟悉其臨床特征和診斷要點，僅需檢測1種基因即可發(fā)現(xiàn)致病性突變；若未發(fā)現(xiàn)致病性突變，則應對檢測結果重新核查，判斷是否誤診或有特殊情況；若無，則基因檢測人員應再次仔細核查檢測程序或分析檢測過程中有無失誤。對于遺傳異質性較強的遺傳性疾病，如脊髓小腦共濟失調、肌萎縮側索硬化癥、腓骨肌萎縮癥、遺傳性痙攣性截癱、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥等，應選擇合適的基因檢測包，從而快速判斷基因型，如ALS10型、SCA34型、CMT1B型、HSP7型、LGMD2D型等。

3.對臨床意義不明的突變應積累更多的臨床資料和遺傳學信息 收集更完整的家系資料及相關重要家族成員標本，分析臨床意義不明的突變在家系中的共分離現(xiàn)象，以及在正常人群中的分布。通過臨床資料和遺傳學信息的累積、基因檢測證據(jù)的增加，原來很可能致病性突變可能轉變?yōu)榇_定致病性突變；同樣，原來很可能無害突變也可能轉變?yōu)榇_定無害突變。

4.臨床醫(yī)師應熟悉常用基因檢測方法及其局限性 臨床醫(yī)師應明確何種方法檢測何種基因突變，如外顯子缺失突變、重復突變應選擇多重連接依賴性探針擴增（MLPA），點突變應選擇二代基因測序技術。根據(jù)臨床擬診選擇相應的檢測方法和檢測范圍，例如，對于確定的遺傳性疾病如Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥可以首選MLPA法，如果呈陰性再進一步行基因測序；對于遺傳異質性較強的遺傳性疾病，如脊髓小腦共濟失調、腓骨肌萎縮癥、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥，應選擇相應的基因檢測包。

5.基因檢測機構在基因檢測設計上應與臨床緊密結合 基因檢測機構實驗室的檢測服務、軟硬件設施、人員資質、操作流程應標準化，應具備基因檢測界公認的質控和規(guī)范；檢測報告的解讀應充分、客觀、準確；應從臨床醫(yī)師角度設計基因檢測包；檢驗結果分析和發(fā)報告人員應熟悉所檢測疾病的臨床和生物化學特征、診斷要點。最近有基因檢測人員在分析遺傳性痙攣性截癱患者的檢測報告時注意到存在腎上腺脊髓神經(jīng)病的可能，臨床醫(yī)師根據(jù)檢測報告進一步補充腎上腺皮質功能試驗和血漿極長鏈脂肪酸（VLCFA）檢測，并進行相應治療，患者臨床癥狀明顯改善，支持腎上腺脊髓神經(jīng)病的診斷?；驒z測機構還應進行病例追蹤，以利于基因檢測技術更好地應用和服務于臨床，在臨床實踐中不斷改進基因檢測設計。

6.患者及其家屬應理解和配合相關基因檢測

由于遺傳性疾病的特殊性，單純進行先證者基因檢測是不夠的，還需要分析和驗證家族重要成員的基因信息，尤其是父母和兄弟姊妹，不管是否出現(xiàn)相應臨床癥狀，均對臨床醫(yī)師診斷和分析疾病有益。對于家族中陽性病史患者，即使不是近親，也應進行基因檢測。患者及其家屬應理解某些疾病的基因檢測程序較為復雜，目前的技術尚無法得出明確結論。

7.臨床醫(yī)師是基因檢測過程的中心環(huán)節(jié) 建議患者及其家屬進行基因檢測的是臨床醫(yī)師，對基因檢測結果進行解讀的是臨床醫(yī)師，回答患者及其家屬各種疑問的是臨床醫(yī)師，因此，臨床醫(yī)師處于基因檢測結果解讀最重要的位置?；驒z測是明確診斷遺傳性疾病的重要方法，若檢測結果能夠回答臨床問題、符合臨床規(guī)律，則臨床醫(yī)師予以采用；若不符合，則應與基因檢測和出報告人員及時溝通，考慮是否重新分析基因檢測結果、補充其他基因或增加家族成員的基因檢測?；驒z測和出報告人員對有疑問或臨床意義不明的基因檢測結果，應提醒臨床醫(yī)師注意事項或提出補充內(nèi)容，盡量滿足臨床需求。因此，臨床醫(yī)師應以臨床為立足點解讀基因檢測結果。對于需行產(chǎn)前診斷的家系，更要求完整的家系資料，符合遺傳規(guī)律方可行產(chǎn)前診斷。

8.有些臨床問題亟待科學技術水平的提高 對于經(jīng)過患者及其家屬、臨床醫(yī)師和基因檢測機構共同努力仍不能確定致病性突變或無害突變、臨床意義不明的基因檢測結果，應收集更多的臨床資料和遺傳學信息，等待更好的技術出現(xiàn)后再進行檢測和分析，因為目前的科學技術水平尚不能解答所有的臨床問題。

四、展望

隨著基因檢測技術的普及，臨床醫(yī)師與基因檢測和報告人員通過溝通，結合臨床表型進行基因檢測結果解讀，盡可能給患者及其家屬明確的致病性突變或無害突變的判斷，并進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，對減少我國遺傳性疾病的發(fā)生、提高人口素質具有重要作用。

［1］Li J,Hu CH,Yu CS,Cao JQ,Yang J,Li YQ,Zhan YX,Zhang C.Long?term follow up of four patients with dopa?responsive dystonia.Zhonghua Shen Jing Ke Za Zhi,2013,46:153?158［.利婧,胡朝暉,喻長順,操基清,楊娟,李亞勤,詹益鑫,張成.多巴反應性肌張力障礙長期隨訪四例.中華神經(jīng)科雜志,2013,46:153?158.］

［2］Yang J,Cao JQ,Liu ZH,Zhan YX,Liang YY,Mo GL,Li YQ,Sun YM,Li MZ,Li J,Zhang C.Clinical features and genetic analysis of 7 patients with late?onset glycogen storage disease typeⅡ.Zhongguo Xian Dai Shen Jing Ji Bing Za Zhi,2014,14:405?410［.楊娟,操基清,劉振華,詹益鑫,梁穎茵,莫桂玲,李亞勤,孫毅明,李敏子,利婧,張成.七例晚發(fā)型糖原貯積病Ⅱ型患者臨床特征及基因突變分析.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2014,14:405?410.］

［3］Li YQ,Cao JQ,Yang J,Zhang BF,Feng SW,Wang YY,Zhang Y,Chen F,Kong J,Zheng MY,Zhang X,Zhang C.Clinical features and genetic analysis of tuberous sclerosis pedigrees.Zhongguo Xian Dai Shen Jing Ji Bing Za Zhi,2012,12:300?306.［李亞勤,操基清,楊娟,張保峰,馮善偉,王艷云,張瑤,陳菲,孔杰,鄭民纓,張旭,張成.結節(jié)性硬化癥家系臨床特點與基因分析.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2012,12:300?306.］

［4］Cao JQ,Zhang C,Li YQ,Yang J,Liang YY,Feng SW,Zhang X,Li J,Zhang HL,Zhu YL,Geng J,Yang LQ.Clinical characteristics and gene mutation analysis of riboflavin?responsivelipid storage myopathy:reportof3 casesin 2 families and review of literature.Zhongguo Xian Dai Shen Jing Ji Bing Za Zhi,2014,14:479?484［.操基清,張成,李亞勤,楊娟,梁穎茵,馮善偉,張旭,利婧,張惠麗,朱瑜齡,耿嘉,楊麗卿.核黃素反應性脂質沉積性肌病臨床特征與基因突變分析:兩家系三例報告并文獻復習.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2014,14:479?484.］

［5］Liu ZL,Liang XL,Zhang C.Neurogenetic disease.3rd ed.Beijing:People's Medical Publishing House,2011:1?14［.劉 焯霖,梁秀齡,張成.神經(jīng)遺傳病學.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:1?14.］

［6］Yan J,Li SY,Li YQ,Cao JQ,Feng SW,Wang YY,Zhan YX,Yu CS,Chen F,Li J,Sun XF,Zhang C.MLPA?based genotype?phenotype analysis in 1053 Chinese patients with DMD/BMD.BMC Med Genet,2013,14:29.

［7］Lu XL,Zhang C,Chen SL,Huang W.A case with progressive muscular dystrophy and G6PD.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2003,20:185［.盧錫林,張成,陳松林,黃文.進行性肌營養(yǎng)不良癥伴葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥一例.中華醫(yī)學遺傳學雜志,2003,20:185.］

［8］Vondracek P,Hermanova M,Sedlackova J,Fajkusova L,Stary D,Michenkova A,Gaillyova R,Seeman P,Mazanec R.Charcot?Marie?Tooth neuropathy type 1A combined with Duchenne muscular dystrophy.Eur J Neurol,2007,14:1182?1185.

［9］Wang Z,Cui F,Chen D,Pu C,Chen Z,Yang F,Wu H,Huang X.Coexistence of peripheral myelin protein 22 and dystrophin mutations in a Chinese boy.Muscle Nerve,2013,48:979?983.

［10］Gussoni E,Bennett RR,Muskiewicz KR,Meyerrose T,Nolta JA,Gilgoff I,Stein J,Chan YM,Lidov HG,B?nnemann CG,Von Moers A,Morris GE,Den Dunnen JT,Chamberlain JS,Kunkel LM,Weinberg K.Long?term persistence of donor nuclei in a Duchenne musculardystrophy patientreceiving bone marrow transplantation.J Clin Invest,2002,110:807?814.

［11］Richards S,Aziz N,Bale S,Bick D,Das S,Gastier?Foster J,Grody WW,Hegde M,Lyon E,Spector E,Voelkerding K,Rehm HL;ACMG Laboratory Quality Assurance Committee.Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants:a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med,2015,17:405?424.

Nervous system diseases; Genetic diseases,inborn; Genes; Mutation; Review

Thought of distinguishing pathogenic gene mutation from no harm mutation in clinical practice

ZHANG Cheng

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China
(Email:zhangch6@mail.sysu.edu.cn)

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81471280,81271401),2015 Production,Study and Research Special Project of Guangzhou,Guangdong Province,China(No.1561000153),the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists(No.81601087),Non?Profit Study and Capability Building Special Fund Support Project of Guangdong Provincial Department of Science and Technology,China in the Year 2014(No.2014A020212130),and Joint Fund of National Natural Science Foundation of China and Natural Science Foundation of Guangdong Province,China(No.U1032004).

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.08.001

國家自然科學基金資助項目（項目編號：81471280）；廣東省廣州市2015年產(chǎn)學研專項項目（項目編號：1561000153）；國家自然科學基金青年科學基金資助項目（項目編號：81601087）；廣東省科學技術廳2014年度公益研究與能力建設專項資金資助項目（項目編號：2014A020212130）；國家自然科學基金資助項目（項目編號：81271401）；國家自然科學基金-廣東省聯(lián)合基金重點資助項目（項目編號：U1032004）

510080廣州，中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，Email：zhangch6@mail.sysu.edu.cn

2017?05?12）