章曉英 宋水江 遲淑梅 王超

血清AQP4水平與腦出血周圍水腫體積相關(guān)性的研究

章曉英 宋水江 遲淑梅 王超

目的探討急性腦出血患者發(fā)病第3、7天的血清水通道蛋白4（AQP4）水平與腦組織水腫體積的相關(guān)性。方法對(duì)50例自發(fā)性腦出血患者采用ELISA法檢測(cè)出血第3、7天血清AQP4水平，通過頭顱CT計(jì)算腦出血和腦水腫體積，計(jì)算相對(duì)水腫體積并分析其與AQP4水平的關(guān)系。結(jié)果腦出血后第7天AQP4水平與相對(duì)水腫體積均較第3天升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；第3天與第7天AQP4水平的改變與相對(duì)水腫體積差值呈正相關(guān)（r=0.555，P＜0.01）。結(jié)論腦出血后血腫周圍水腫的形成及發(fā)展與血清AQP4的異常表達(dá)密切相關(guān)，減少AQP4的過度表達(dá)有可能成為腦出血后腦水腫治療新途徑。

水通道蛋白4腦出血腦水腫

腦出血是一種常見的急性腦血管疾病，年發(fā)病率為60～80/10萬人口，占急性腦血管病的20%～30%，致殘率及病死率均較高。究其原因，除了出血灶對(duì)腦組織的壓迫外，更為重要的是腦出血后繼發(fā)性腦水腫的形成以及有害物質(zhì)對(duì)腦細(xì)胞的損害。水通道蛋白（AQP）家族是新近發(fā)現(xiàn)的首個(gè)涉及特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的細(xì)胞膜蛋白家族，其中以APQ4對(duì)于腦水腫的形成最為重要[1]，故對(duì)AQP4的研究成了尋找治療腦水腫的新途徑。目前有關(guān)AQP4對(duì)出血性腦水腫的作用機(jī)制研究大多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床研究偶見報(bào)道[2]。本研究觀察急性腦出血患者在發(fā)病第3、7天的血清AQP4水平，探討其與腦水腫體積之間的相互關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象收集2013年1月至9月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的50例腦出血患者，均符合我國(guó)2010年頒布的《成人自發(fā)性腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)》。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為自發(fā)性腦出血；（2）年齡為18～80周歲；（3）起病3d之內(nèi)；（4）無全身嚴(yán)重并發(fā)癥；（5）顱腦CT檢查排除梗死性出血；（6）患者和（或）家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性腦出血、原發(fā)或繼發(fā)腦室內(nèi)或幕下出血；（2）潛在動(dòng)脈瘤、血管畸形；（3）治療中使用抗凝劑；（4）合并有肺炎或嚴(yán)重全身感染；（5）伴心功能不全、慢性肝?。ˋST、ALT＞正常上限2倍），腎功能障礙[肌酐（Cr）＞135mmol/L]、血液系統(tǒng)疾病；（6）腫瘤；（7）嚴(yán)重精神病及癡呆；（8）過敏體質(zhì)，對(duì)多種藥物有過敏史；（8）經(jīng)治療血壓≤90/60mmHg或≥200/ 110mmHg者；（9）處于妊娠期。終止標(biāo)準(zhǔn)：病情加重不能承受檢查者或不能配合導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中斷。觀察過程中所有受試者治療方案保持不變。

1.2方法

1.2.1 血清AQP4標(biāo)本的采集和檢測(cè)采用武漢優(yōu)兒生科技股份有限公司的檢測(cè)試劑盒，患者發(fā)病后第3、7天抽取其空腹肘靜脈血2～3ml，室溫下血液自動(dòng)凝固10～20min，離心20min（2 500r/min），仔細(xì)收集上清液，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心，獲取的血清置于-70℃低溫冰箱保存,采用ELISA法集中檢測(cè)AQP4水平。

1.2.2 影像學(xué)檢查采用AW4.2GE Adwentage工作站運(yùn)行的圖像處理軟件對(duì)患者發(fā)病第3、7天的頭顱CT片進(jìn)行離線處理，通過半自動(dòng)方法計(jì)算血腫和水腫體積。手工畫出每層病變的高-低-交界區(qū)域的適當(dāng)周界并圈出感興趣區(qū)域，采用基于Hounsfield unit測(cè)量的自動(dòng)閾值區(qū)分血腫和頭骨、腦實(shí)質(zhì)和血腫周圍的水腫帶。通過閾值區(qū)分血腫和水腫，自動(dòng)加入臨近的體積算出血腫和絕對(duì)水腫體積，計(jì)算相對(duì)水腫體積[（水腫體積-血腫體積）/血腫體積]。為了保證測(cè)量值的準(zhǔn)確及腦室內(nèi)出血的干擾，排除伴有腦室內(nèi)出血的患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，不同時(shí)點(diǎn)間比較采用t檢驗(yàn)。通過Pearson來判定兩者之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

50例腦出血患者發(fā)病后第3、7天比較，血腫體積縮小[（24.310±20.189）、（20.810±19.297）ml]，水腫體積增大[（30.332±26.331）、（56.143±40.090）ml]。相對(duì)水腫體積增大（0.248±0.493、1.698±1.060），AQP4水平升高[（2.572±1.449）、（3.959±2.116）ng/ml]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。腦出血后第7天與第3天AQP4水平的差值為（1.416±1.228）ng/ml，相對(duì)水腫體積差值為（1.45±0.18），兩者呈正相關(guān)（r=0.555，P＜0.01）。

3 討論

腦出血后水腫的形成涉及諸多機(jī)制，AQP4對(duì)水腫的形成和發(fā)展起到了非常重要的作用[3]。腦出血后腦組織缺血、缺氧、凝血酶、滲透壓改變等各種變化作為胞外刺激因素，激活位于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上的AQP4，使其自身發(fā)生蛋白磷酸化[4]，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加膜對(duì)水的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水腫。AQP4不僅參與了腦出血中期水腫的形成，還參與腦出血后期（發(fā)病后第3天后）水腫的形成。

既往已有多項(xiàng)研究證實(shí)AQP4與腦水腫的形成和發(fā)展密切相關(guān)，但大多限于動(dòng)物模型[5-7]，且樣本均來源于腦組織，血清AQP4水平和腦出血后周圍水腫的相關(guān)性研究臨床鮮有報(bào)道。本研究對(duì)50例原發(fā)性腦出血患者不同時(shí)間段血清AQP4動(dòng)態(tài)表達(dá)和CT上水腫體積變化進(jìn)行分析，納入患者的腦出血部位多位于基底核區(qū)，解剖位置鄰近腦室，此處有較高水平的AQP4表達(dá)。結(jié)果顯示：腦出血患者血腫體積第7天較第3天縮小，而水腫體積增大，AQP4值對(duì)應(yīng)升高，前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明AQP4在水腫的形成方面起到了促進(jìn)作用。出血后第7天血清AQP4水平及CT相對(duì)水腫體積均顯著高于第3天，AQP4的增加和相對(duì)水腫體積的增加呈正相關(guān)，說明AQP4表達(dá)增加進(jìn)一步促進(jìn)了水腫的發(fā)展。這種動(dòng)態(tài)改變與既往動(dòng)物模型研究結(jié)果一致，但血清AQP4水平及水腫的高峰未出現(xiàn)在出血第3天，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異。高峰推遲原因考慮：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象一般為健康成年大鼠，人工注射自體血入尾狀核造模[8]，注入量約5μl，量少且出血形態(tài)基本規(guī)則，剔除了影響結(jié)果的夾雜因素（如高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等），符合腦出血水腫觀察的理想條件。而人自發(fā)性腦出血后水腫形成受更多因素影響，除上述因素外，血腫形態(tài)及脫水劑的應(yīng)用是部分病人水腫高峰延長(zhǎng)的重要原因，符合臨床腦出血后水腫發(fā)生在24～72h，3～7d達(dá)到水腫高峰，然后逐漸消退，2周左右腦水腫得到充分吸收的自然過程。

本實(shí)驗(yàn)中血清AQP4水平差值和相對(duì)水腫體積差值之間的相關(guān)系數(shù)為0.555，相關(guān)性欠高的可能原因有：（1）入組病例數(shù)太少，缺乏大樣本的臨床研究資料；（2）既往研究大多以動(dòng)物為模型，選取腦出血水腫區(qū)新鮮腦組織行免疫組化和免疫電鏡檢查，干擾因素小，結(jié)果較為可靠。本研究AQP4從血清中獲取，除來源于血腫周圍水腫區(qū)外，還有少部分可能來源于肺、腎臟等組織[9]。故測(cè)得的血清AQP4值可能偏高，不能完全反映血腫周圍水腫區(qū)AQP4水平；（3）本研究血腫及水腫體積是通過GE半自動(dòng)軟件進(jìn)行測(cè)量，新鮮血腫的CT值一般為60～90Hu，正常腦組織的CT值范圍在25～40Hu，水腫帶CT值一般＜20Hu，鄰近出血灶的腦水腫區(qū)含水量多，CT值更低[10]。在手工勾畫感興趣區(qū)域時(shí)，腦組織、水腫帶與血腫區(qū)不同閾值可能存在技術(shù)誤差。同時(shí)水腫帶中的水分可能向正常腦組織及血腫區(qū)滲透，但強(qiáng)度并未引起CT值的明顯改變。這樣計(jì)算得出的水腫體積較實(shí)際水腫體積可能偏小。（4）研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血腫體積大小和相對(duì)水腫體積相關(guān)，故再次出血或血腫擴(kuò)大對(duì)結(jié)果均有不同程度的影響?；颊咴诔鲅?天至第3天再次出血或血腫擴(kuò)大的可能性較大，而此次研究選擇點(diǎn)在出血第3天和第7天，雖然“再出血”或血腫擴(kuò)大發(fā)生率降低，但仍存在，故對(duì)結(jié)果仍有一定的影響。

此項(xiàng)目為自身縱向研究，缺乏實(shí)驗(yàn)對(duì)照，若能進(jìn)行健康對(duì)象組和腦出血組血清AQP4水平的對(duì)照研究，結(jié)果將更加完善。腦出血后腦水腫形成的病理機(jī)制是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，至今仍未完全闡明。AQP4和腦出血后水腫之間的這種變化關(guān)系為臨床使用選擇性AQP4抑制劑的可行性提供了理論依據(jù)。能否早期利用AQP4的抑制劑或通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制控制AQP4的表達(dá)來調(diào)節(jié)水平衡，減緩腦組織中水分子的積聚，進(jìn)而達(dá)到防治腦水腫、減輕腦損傷的目的，將成為探討的新方向。

[1]Benga O,Huber V J.Brain water channel proteins in health and disease[J].Mol Aspects Med,2012,33(5-6):562-578.doi:10. 1016/j.mam.2012.03.008.

[2]Shin J A,Choi J H,Choi YH,et al.Conserved aquaporin 4 levels associated with reduction of brain edema are mediated by estrogen in the ischemic brain after experimental stroke[J].Biochim Biophys Acta,2011,1812(9):1154-1163.doi:10.1016/j. bbadis.2011.05.004.

[3]Fukuda A M,Badaut J.Aquaporin 4:a player in cerebral edema and neuroinflammation[J].J Neuroinflammation,2012,9:279.doi: 10.1186/1742-2094-9-279.

[4]Stokum J A,Kurland D B,Gerzanich V,et al.Mechanisms of astrocyte-mediated cerebral edema[J].Neurochem Res,2015, 40(2):317-328.doi:10.1007/s11064-014-1374-3.

[5]Huang J,Sun S Q,Lu W T,et al.The internalization and lysosomal degradation of brain AQP4 after ischemic injury[J].Brain Res, 2013,1539:61-72.doi:10.1016/j.brainres.2013.09.022.

[6]Wu W,Tian R,Hao S,et al.A pre-injury high ethanolintake in rats promotes brain edema following traumatic brain injury[J].Br J Neurosurg,2014,28(6):739-745.doi:10.3109/02688697.2014. 915007.

[7]Rama Rao K V,Verkman A S,Curtis K M,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces encephalopathy and brain edema in experimental acute liver failure[J].Neurobiol Dis,2014,63:222-228.doi:10.1016/j.nbd.2013.11.018.

[8]Wu H,Wu T,Xu X,et al.Iron toxicity in mice with collagenaseinduced intracerebral hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab, 2011,31(5):1243-1250.doi:10.1038/jcbfm.2010.209.

[9]Verkman AS,Ratelade J,RossiA,et al.Aquaporin-4:orthogonal array assembly,CNS functions,and role in neuromyelitis optica [J].Acta Pharmacol Sin,2011,32(6):702-710.doi:10.1038/aps. 2011.27.

[10]郭奕浩,余永銘,黃永誼,等.高血壓腦出血血腫CT值測(cè)定價(jià)值及其對(duì)手術(shù)策略的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2006,2:22-23.

Association between serum AQP4 level and brain edema volume following intracerebral hemorrhage

ZHANG Xiaoying,SONG Shuijiang,CHI Shumie,et al.Department of Neurology,Hangzhou Seventh People's Hospital 310007,China

ObjectiveTo investigate the association betweenserum AQP4 level and brain edema volume following intracerebral hemorrhage(ICH).MethodsSerum AQP4 was measured in 50 patients with spontaneous intracerebral hemorrhage within 3-7 d after onset.Hematoma volume,peripheral edema volume and relative edema were measured at the same time by CT scan.ResultsSerum AQP4 levels and relative edema volume at 7d following ICH were significantly increased,compared to those at d3.Serum AQP4 levels were positively correlated withrelative edema volume at d3 and d7(r=0.555,P＜0.01). ConclusionAQP4 may be involved in the development of cerebral edema and cerebral injury after ICH,indicating that AQP4 might be a new therapeutic targed for brain edema after cerebral hemorrhage.

Aquaporin4Intracerebral hemorrhageBrain edema

2015-08-03）

（本文編輯：楊麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.13.2015-901

310007杭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（章曉英、遲淑梅）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（宋水江），影像科（王超）

宋水江，E-mail：shuijiangs@163.com