楊傳輝，鄧鎮(zhèn)濤

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041）

甜葉菊繁殖方式研究進(jìn)展

楊傳輝，鄧鎮(zhèn)濤*

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041）

綜述了甜葉菊在種子繁殖、扦插技術(shù)、組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及人工種子技術(shù)等方面的研究進(jìn)展，以期為更好地利用這種優(yōu)良的高糖植物提供參考。

甜葉菊；植物繁殖方式；高糖植物

甜葉菊為一種富含甜菊糖苷的菊科甜葉菊屬植物，其甜度是蔗糖的300倍[1]，而熱量僅為蔗糖的1/300[2]。作為天然甜味劑的甜菊糖苷因味美安全、甜度高熱量低且可降低糖尿病[3]、高血脂[4]和高血壓[5]等的發(fā)病率[6]，有著顯著的藥理作用等特點，逐漸成為一種深受飲料、食品、醫(yī)藥和日用化工等用糖行業(yè)歡迎的新糖源[7]。因其擁有巨大經(jīng)濟(jì)效益和藥用潛力價值，甜葉菊日益受到人們的關(guān)注。僅依賴種子繁殖甜葉菊不能很好地為世界甜葉菊市場提供充足的原料，近年來通過不斷發(fā)展扦插技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)及人工種子技術(shù)等，從多方面彌補(bǔ)甜葉菊種子繁殖的不足。

1 種子繁殖

用種子繁殖為有性繁殖。甜葉菊為雌雄同株異花授粉的兩性花植物，栽培當(dāng)年即能開花結(jié)實，用種子進(jìn)行有性繁殖是甜葉菊育苗的一種重要方法。甜葉菊種子包括胚、種皮、子實皮、冠毛4部分，是一種長3～4mm，寬0.5～0.8mm的紡錘形瘦果，帶有白褐色縱紋的黑（棕）色果皮上不僅有縱溝且刺毛密生[8]。

體積較小的甜葉菊種子多是采用播種育苗后移栽的方法繁殖。種子呈深褐色且冠毛張開時便已成熟、開始采收，將經(jīng)過充分干燥的種子放在厚布袋中，于陰涼干燥通風(fēng)處貯藏[9]。因無休眠期的甜葉菊種子發(fā)芽率會隨著貯藏期增長而下降，因而不宜長期貯藏，最好當(dāng)年播種。挑選黑褐色成熟飽滿種子經(jīng)曬干、搓去冠毛、消毒殺菌、濕潤后開始催苗，待兩三天后種子出芽萌發(fā)后即可播種。以150g/畝（667m2）的播種量將種子與泥沙均勻混合后均勻撒種，覆細(xì)肥土，種子與土層輕觸，并保持土壤濕潤。待萌發(fā)后50d左右種子長出幾對真葉后開始移栽。移植后的大田栽植密度約為8000株/畝[10]。

甜葉菊種子發(fā)芽率主要受到濕度、溫度、土壤肥料、種源的影響。近年來通過一些對甜葉菊種子萌發(fā)率影響的試驗研究得出低劑量的氮離子束輻照[11]、種子去冠毛處理[12]、低濃度的鹽脅迫[13]均可促進(jìn)種子萌發(fā)。但目前種子萌發(fā)率低導(dǎo)致成本高的問題仍存在，因此如何選育優(yōu)良品種和進(jìn)一步提高萌發(fā)率顯得尤為重要。

2 扦插繁殖

扦插育苗是甜葉菊繁殖的重要手段，經(jīng)濟(jì)、簡單易行，且能保持母本優(yōu)良性狀。甜葉菊春季插條從越冬老根的幼苗獲得，秋冬季插條可從秋繁苗上截取，由于插條不易存放，應(yīng)隨剪隨插。扦插取材部位以帶有3～5對葉片的粗壯嫩枝為佳，扦插基質(zhì)用河沙最好，搭棚遮陰，保溫保濕。扦插時間一般在春季3—5月和秋季8—10月為宜。扦插苗的株行距為2cm×3cm，扦插深度以1.5～2cm為宜，一般提供85%左右的空氣相對濕度和25℃左右的苗床溫度為宜[10]。一般甜葉菊插條需12d左右生根，用低濃度的萘乙酸蘸根浸泡插條6～8h有利于生根，且成活率提高[14]。此外，甜葉菊為宿根性作物，越冬保溫保存萌發(fā)新莖的老根亦可在翌春時將新莖分株移栽[13]。

3 組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)具有繁殖種苗周期短、繁殖速度快和繁殖系數(shù)高等優(yōu)點，可在短期內(nèi)獲得大量種苗，且能保持種苗的遺傳穩(wěn)定性，是科學(xué)研究和生產(chǎn)栽培中的重要手段[15]。甜葉菊組織培養(yǎng)的程序主要包括“外植體選擇—消毒—接種—愈傷組織及芽的誘導(dǎo)—葉繼代培養(yǎng)及叢生芽的增殖—生根誘導(dǎo)—煉苗—移栽”等步驟。甜葉菊組織培養(yǎng)通常是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加上適量的6-BA、NAA、IAA等激素作為芽誘導(dǎo)、繼代和生根培養(yǎng)基[16]。試管苗通過煉苗后移栽極易成活。郝再彬等人研究了不同外植體、不同激素種類和配比對愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根的影響。數(shù)據(jù)表明：以莖尖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽效果最佳；帶腋芽莖段的效果稍差；葉片誘導(dǎo)效果最差[17]。

莖尖的組織培養(yǎng)是取甜葉菊莖尖，接種于含有不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，以MS+6-BA 1.0mg/L的培養(yǎng)基為宜。培養(yǎng)約20 d后莖尖長成叢生芽，當(dāng)外植體莖尖長出多個1～2cm的不定芽時，分割芽苗接種于MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上；當(dāng)芽苗伸長到2 cm左右時，可分離出無根芽苗培養(yǎng)到1/4MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA+1g/L活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根[18]，約10d左右形成根。

莖段的組織培養(yǎng)是取甜葉菊的有節(jié)莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。其適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L，增值系數(shù)4～6，增值周期15～20 d，生根培養(yǎng)基以1/4 MS+NAA 0.2mg/L為宜。在此條件下，甜葉菊的誘導(dǎo)增殖、繼代培養(yǎng)、生根及移植成活率都較高[18]。

通過濃度為0.1%的升汞 （HgCl2）和75%左右的酒精滅菌消毒的甜葉菊外植體基本上即可達(dá)到無菌效果。郝再彬等人采用將莖尖葉片等外植體先用蒸餾水洗凈后用70%的酒精消毒l0s，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡4min達(dá)到了較好的滅菌效果[17]。劉學(xué)敏等人采用75%酒精4s+0.1%HgCl24min的滅菌方法，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)86.7%[19]。Hemant等人采用體積比為15%的漂白劑+0.1%的TWEEN20消毒20min或經(jīng)過0.5%的次氯酸鈉溶液滅菌亦可達(dá)到較好滅菌效果[20]。

4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

通過對甜葉菊的細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植物。細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞來源于甜葉菊葉或幼莖組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的愈傷組織，舒英杰等人已經(jīng)從甜葉菊葉片獲得原生質(zhì)體[21]。C.M.Ferreira等人也已經(jīng)從甜葉菊葉得到松散的愈傷組織，并完成了細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及離體保存等技術(shù)過程[22]。原生質(zhì)體經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上，最后培養(yǎng)分化成完整的植株[23]。由于甜葉菊細(xì)胞培養(yǎng)所需的成本較高且技術(shù)過程復(fù)雜，在生產(chǎn)上難以形成規(guī)模化應(yīng)用。

5 人工種子技術(shù)

人工種子不但可保持優(yōu)良品種的遺傳特性，還能夠保存及快速繁殖脫毒苗，還能提供更好的營養(yǎng)物質(zhì)影響其生長抗性。以甜葉菊莖尖和叢生芽節(jié)段為體細(xì)胞胚，采用3%的海藻酸鈉作為凝膠基質(zhì)在100mmol/L的氯化鈣溶液中凝固15min，得到硬度、濕度合適的甜葉菊人工種子，未萌發(fā)的種子經(jīng)200mmol/L KNO3溶液（含有1mg/L的BAP）浸泡5min有助于萌發(fā)，且Aamir Ali等研究表明甜葉菊人工種子萌發(fā)率會隨著儲藏時間的增長而降低，甜葉菊人工種子保存15d以內(nèi)為宜[24]。芽從外植體腋芽增殖再生，莖段叢生芽在MS+1 mg/ L 6-BA培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率最高，在MS+0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基中，可得最大數(shù)量的根[25]。

6 問題與展望

作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，甜葉菊近年來備受關(guān)注。國內(nèi)外甜葉菊繁殖方式研究已開展多年，扦插、組織培養(yǎng)等無性繁殖技術(shù)與理論非常成熟；原生質(zhì)體培養(yǎng)、人工種子繁殖等技術(shù)過程復(fù)雜成本高，仍處于研究階段，未形成規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用，但前景廣闊。倘若能夠?qū)⒃|(zhì)體培養(yǎng)與組織培養(yǎng)等技術(shù)相結(jié)合研究出新的快繁技術(shù)，有望為甜葉菊的快繁開辟新的方向。

[1]Chalapathi，M.V.，and S.Thimmegowda.Natural non-calorie sweetener stevia(Stevia rebaudiana Bertoni):A future crop of India Crop[J].Research Hisar,1997,14(2):347-350

[2]Midmore，D.J.，A.H.Rank.A new rural industry—Stevia—to replace imported chemical sweeteners[Z].Borton，MA:Report for the Rural Industries R&D Corporation,2002

[3]Shukla S，Mehta A，Mehta P，et al．Evaluation of comparative antidiabetic effects of ethanolic extracts of Caesalpinia bouncucella and Stevia rebaudiana in normal and alloxan-induced experimental rats[J].Romanian Biotechnological Letters，2011，16(3):6187-6199

[4]Sharma N M R，Upadhyay B．Effect of stevia extract intervention on lipid profile[J].Stud．Ethno-Med，2009,3(2):137-140

[5]Hsu Y H，Liu J C，Kao P F，et al.Antihypertensive effect of stevioside in different strains of hypertensive rats[J].Chinese Medical Journal，2002，65(1):1-6

[6]曹芳，馮文靜，陳明，等.甜菊糖苷降血糖作用研究[J].中國藥物與臨床，2009，9（2）：127

[7]尚宏芹.甜葉菊綜合利用研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2011，36（2）：4-6

[8]譚德云，陳祥梅，譚德新，王德寶.甜菊種子特征及高效育苗技術(shù)[J].中國糖料，2003，25（1）：34-36

[9]李瑞鋒.甜葉菊種子高效生產(chǎn)技術(shù)[J].中國糖料，2009，31（3）：52-53

[10]周群喜，楊秋萍.甜葉菊繁苗技術(shù)[J].種子科技，2012，30（5）：40-42

[11]閡笛，陳達(dá)偉，蘇婷婷，湯其坤，王鈺.低能N+離子束輻照甜葉菊種子的當(dāng)代效應(yīng)研究[J].生物學(xué)雜志，2013，30（5）：41-43

[12]陳葉，郝宏杰，王治江，等.不同處理對甜葉菊種子出苗率和幼苗生長的影響研究[J].種子，2012，31（4）：102-104

[13]梁飛林，郝宏杰，田世華，陳葉，羅光宏.NaCl對甜葉菊種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].中國種業(yè)，2013（9）：65-67[14]殷學(xué)云.河西冷涼灌區(qū)甜葉菊扦插育苗及根蘗繁殖技術(shù)[J].中國糖料，2011，33（1）：52-54

[15]劉書榮，劉靜，吳曼.植物組織培養(yǎng)及其在果樹上的應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（22）：45-46

[16]M.Thiyagarajan,P.Venkatachalam.Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana(Bert)for commercial application: Pharmaceutically important and antidiabetic medicinal herb[J].Industrial Crops and Products，2012，37(1)：111-117

[17]郝再彬，董振紅，李子院.高品質(zhì)甜葉菊品系“1096”的組培快繁[J].中國糖料，2011，33（3）：9-11

[18]劉家勝，高曉慧，賴桂秀，梁益華.甜葉菊組培快繁與工廠化育苗技術(shù)[J].生物技術(shù)世界，2015（3）：21

[19]劉學(xué)敏，尚宏芹.甜葉菊葉片滅菌方法的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（3）：19-21

[20]Hemant Lata，Suman Chandra，et al.TDZ-Induced High Frequency Plant Regeneration through Direct Shoot Organogenesis in Stevia rebaudiana Benoni:An Important Medicinal Plant and a Natural Sweetener[J].American Journal of Plant Sciences，2013, 4(1):117-128

[21]安徽科技學(xué)院.一種快速制備甜葉菊葉片原生質(zhì)體的方法：中國專利，CN 105385649 A[P].2016-03-09

[22]C.M.Ferreira，Walter Handro.Production，maintenance and plant regeneration from cell suspension cultures of Stevia rebaudiana (Bert)Bertoni[J].Plant Cell Reports,1988,7(2):123-126

[23]Shaifali Mathur，Gyan Singh Shekhawat.Establishment and characterization of Stevia rebaudiana(Bertoni)cell suspension culture: an in vitro approach for production of stevioside[J].Acta Physiol Plant，2013,35(3):931-939

[24]Aamir Ali，Irum Gull,Abdul Majid,Asif Saleem,Shagufta Naz and Naima H.N.In vitro conservation and production of vigorous and desiccate tolerant synthetic seeds in Stevia rebaudiana[J].Journal of Medicinal Plants Research，2011，6(7)：1327-1333

[25]Ahmed Abbas Nower.In Vitro Propagation and Synthetic Seeds Production:An Efficient Methods for Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Sugar Tech，2014，16(1)：100-108

Research Progresses on Reproduction Modes of Stevia

YANG Chuan-hui,DENG Zhen-tao*
(Bioengineering Department of Zhuhai Campus,Zunyi Medical College,Zhuhai Guangdong 519041)

The research progresses such as seed propagation,cutting techniques,tissue culture,protoplast culture,and artificial seed technology of Stevia were reviewed in this paper,to expect to provide a reference for research and application of Stevia.

Stevia;reproduction mode of plant;high sugar plant

S566.9

B

1007－2624（2017）01－0065－02

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.020

2016-08-17

楊傳輝（1996-），男，山東省濟(jì)寧市梁山縣人，Email：1714812198@qq.com

鄧鎮(zhèn)濤，遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)教師。Email：19722057@qq.com