盧曉平,許艷蕊,范秋蘋，郝魯江

(齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250353)

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不同環(huán)境因子對(duì)海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響

盧曉平,許艷蕊,范秋蘋，郝魯江*

(齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250353)

為了研究海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ所產(chǎn)多糖的生物合成基因簇,首先需要克隆到在多糖合成中起關(guān)鍵作用的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。通過設(shè)計(jì)引物,采用PCR技術(shù)從海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ成功克隆到該基因,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了溫度、pH及海鹽濃度對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明:低溫有利于引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),隨著溫度的上升,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量先增后減,在20 h時(shí),引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量急劇上升,15 ℃和35 ℃引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量分別是20 ℃表達(dá)量的5.2倍、5.8倍;海鹽濃度為4.5%時(shí)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量為海鹽濃度3.5%的2.5倍,海鹽濃度為5.5%時(shí)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量為海鹽濃度3.5%的2.0倍;10 h時(shí)pH為8、9的培養(yǎng)基中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量分別為pH為7的1.64和1.67倍。該結(jié)果為探究菌體環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)。

海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶,實(shí)時(shí)熒光定量PCR

海洋環(huán)境的特殊性,賦予海洋細(xì)菌所產(chǎn)多糖結(jié)構(gòu)的多樣性以及功能的特殊性。盡管已有大量文獻(xiàn)報(bào)道海洋細(xì)菌多糖的特殊功能,但人們對(duì)于研究生產(chǎn)胞外多糖的海洋細(xì)菌的興趣方興未艾[1]。近幾年,隨著對(duì)微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖的產(chǎn)量和增長(zhǎng)量均在10%以上,而一些新興多糖年增長(zhǎng)量在30%以上,到目前為止已經(jīng)大量投產(chǎn)的微生物多糖有黃原膠、結(jié)冷膠、小核菌葡聚糖、短梗霉多糖等[2]。海洋微生物處于低溫、高鹽、高壓、寡營(yíng)養(yǎng)、高溫度梯度及高毒性濃度的特殊環(huán)境,具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的新型活性多糖的潛力[3],是開發(fā)多糖類海洋新藥的重要資源,一些假交替單胞菌能夠分泌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS),EPS可以增加產(chǎn)生菌及某些其它海洋生物在特定環(huán)境中的存活機(jī)會(huì)。一株假交替單胞菌S9無(wú)論是在液體還是固體培養(yǎng)狀態(tài)下穩(wěn)定期都能夠產(chǎn)生EPS,促進(jìn)產(chǎn)生菌定居在無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲的表面[4]。Corsaro等報(bào)道P.haloplanktisTAC125能夠分泌EPS,并且不同的培養(yǎng)溫度對(duì)EPS的成分也有影響[5]。近年來(lái),已有很多關(guān)于海洋微生物代謝產(chǎn)物的研究文獻(xiàn),但有關(guān)環(huán)境因子調(diào)控海洋細(xì)菌多糖的合成及相關(guān)基因的研究鮮見報(bào)道。

目前多種細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定[6],雖然這些多糖的結(jié)構(gòu)或者活性有所不同,但是多糖的生物合成途徑基本相同,甚至于LPS的O抗原和合成途徑相似,即通過引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖從糖核苷酸順序性轉(zhuǎn)移而裝配到脂類載體上形成重復(fù)單元,隨后是這些重復(fù)單元的聚合和輸出,形成細(xì)胞表面多糖[7-8]。有些基因簇涉及特殊糖核苷酸合成的基因,但所有的基因簇都具有編碼特異引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、參與聚合和輸出過程的基因[9]。在多糖合成過程中,催化糖基轉(zhuǎn)移到脂載體上的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶在G+和G-均有較高的同源性,其也是胞外多糖合成的限速酶之一。因此,根據(jù)以上特性,從同源菌中設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,從海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ基因組中擴(kuò)增出引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

本研究所用菌株為皺紋盤鮑采苗板上分離得到的高產(chǎn)胞外多糖菌株P(guān)esudoalteromonasissachenkoniiHZ,其胞外多糖的合成與環(huán)境因子之間是否存在聯(lián)系以及兩者之間的相應(yīng)關(guān)系還不清楚,而對(duì)該問題的研究可為闡明胞外多糖在環(huán)境適應(yīng)性中的機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ產(chǎn)多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,將以此為基礎(chǔ)研究在發(fā)酵過程中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

海洋細(xì)菌Pseudoalteromonasissachenkonii502A 為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;固體培養(yǎng)基Zobell 2216E培養(yǎng)基 蛋白胨5 g/L,酵母膏1 g/L,海鹽35 g/L,瓊脂20 g/L,調(diào)pH7.6～7.8;種子培養(yǎng)基Zobell 2216E培養(yǎng)基 蛋白胨5 g/L,酵母膏1 g/L,海鹽35 g/L,調(diào)pH7.6～7.8;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖45 g/L,硫酸銨2.5 g/L,海鹽45 g/L,調(diào)pH7.8～8.0;細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、柱式細(xì)菌總RNA抽提純化試劑盒、Low MW DNA Marker-A、DNA maker-G、Taq酶、引物 上海生工生物工程有限公司;λ-Hind Ⅲ digest、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) 寶生物工程(大連)有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

PCR儀基因擴(kuò)增儀 Bio-RAD;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 Rotor-Gene Q;ZF-1B型三用紫外分析儀 上海播顯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 取出甘油管中保藏的海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ,劃線接種于Zobell 2216E固體培養(yǎng)基平板上,25 ℃靜置培養(yǎng)24 h長(zhǎng)出單菌落后,取單菌落再次劃線培養(yǎng),保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的提取 將活化好的細(xì)菌接種于Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中,25 ℃、100 r/min培養(yǎng)8 h。利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于-20 ℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 利用Primer Primer 5.0,根據(jù)GenBank中PseudoalteromonashaloplanktisTAC125(NC_007482.1)的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶設(shè)計(jì)一對(duì)引物GF(5′-ATGAAAAAAGTGCTGGTAATTGG-3′)和GR(5′-TTAATCTAATTTTTTATTTTTTTCAGCTATCC),由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系與程序 PCR擴(kuò)增體系為25 μL,具體組成見表1。

表1 PCR擴(kuò)增體系

擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,44～51 ℃、30 s,72 ℃、2 min,35 cycle;72 ℃、10 min。其中使用溫度梯度PCR擴(kuò)增引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因,退火溫度的選擇參考引物上下游引物退火溫度,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液點(diǎn)樣,70 V、40 min,利用ZF-1B型三用紫外分析儀進(jìn)行觀察。挑取單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物送往上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序,得到序列后,將序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.gov)進(jìn)行序列比對(duì),比較引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶序列的同源性。

1.2.5 溫度變化對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響 將海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ接種到種子培養(yǎng)基中,25 ℃、100 r/min培養(yǎng)8 h。按照8%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別在15、20、25、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng),并在10、20、34、44 h分別取樣,備用。

1.2.6 海鹽濃度對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響 將海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ種子液接種到海鹽濃度分別為3.5%、4.5%、5.5%的發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng),并在10、20、34 h分別取樣,備用。

1.2.7 pH對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響 pH對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響 將海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ種子液接種到pH分別為7、8、9的發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng),并在10、20、34 h分別取樣,備用。

1.2.8 RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 使用柱式細(xì)菌總RNA提取純化試劑盒提取細(xì)菌的RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)合成cDNA第一鏈,具體操作參照使用說明書。

1.2.9 熒光定量PCR體系的建立 以測(cè)得的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶序列為靶序列,運(yùn)用primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量PCR引物SGF(5′-TTTGGCTGGC GTGTAGATAA-3′)和SGR(5′-GCGTTTTGCTATGT CTGAATG-3′)。以16S rDNA為內(nèi)參基因,引物序列為16S rDNA-F(5′-TGTAGCGGTGAAATGCGTA-3′)和16S rDNA-R(5′-AGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC-3′)[11]。并進(jìn)行引物特異性檢測(cè)。PCR體系為25 μL,見表2。

表2 熒光定量PCR體系

擴(kuò)增程序:95 ℃、30 s;95 ℃、5 s,54 ℃、30 s,72 ℃、30 s,50次循環(huán);溶解曲線70～99 ℃。反應(yīng)在QIAGEN Rotor-GeneQ熒光定量PCR儀上進(jìn)行,以上反應(yīng)條件均經(jīng)過了一系列溫度梯度PCR優(yōu)化[12],每個(gè)濃度梯度同時(shí)做三個(gè)平行重復(fù),以不加模板的反應(yīng)液為空白對(duì)照。

1.2.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 使用熒光定量PCR儀附帶軟件采用2-ΔΔCT算法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理[13],并導(dǎo)出內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增曲線、溶解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ基因組DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示:位于23 kb處有一明亮條帶,可用于后續(xù)PCR反應(yīng)等。

圖1 提取的細(xì)菌基因組DNA Fig.1 Extracted bacterial genome DNA注:M:λ-Hind Ⅲ digest。

2.2 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增

以提取的海洋細(xì)菌PseudoalteromonasissachenkoniiHZ DNA為模板,以GF和GR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖2。

圖2 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增Fig.2 Glycosyltransferase gene amplification注:M為DNA maker-G,泳道1～8為44～51 ℃下所擴(kuò)增的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

圖2中泳道8中的PCR產(chǎn)物明亮、條帶單一,無(wú)引物二聚體,因此將泳道8中的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將翻譯得到的蛋白質(zhì)序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì),其與Pseudoalteromonassp.MW4237引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)序列相似度為89%,與Pseudoalteromonassp.P1-11相似序列為88%,與Pseudoalteromonasaqarivorans相似度為87%,推測(cè)該序列為引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶序列。

2.3 細(xì)菌總RNA的提取

使用柱式細(xì)菌總RNA提取純化試劑盒提取細(xì)菌的RNA,電泳結(jié)果如圖3。由圖3可知提取的RNA條帶完整,滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。電泳結(jié)束后參照使用說明書合成cDNA第一鏈。

圖3 細(xì)菌總RNA的提取Fig.3 Extraction of total RNA from bacteria

2.4 引物特異性分析

以合成的cDNA為模板,以SGF和SGR為引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶保守片段上下游引物,以16S rDNA-F和16S rDNA-R為內(nèi)參基因上下游引物,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,檢測(cè)引物特異性。結(jié)果見圖4,可知產(chǎn)物單一,無(wú)引物二聚體,可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 普通PCR引物特異性分析Fig.4 Normal PCR primers specific analysis注:M-Low MW DNA Marker-A;1～3泳道為引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶保守片段;4～6泳道為內(nèi)參16S rRNA片段。

由圖4可知,SGF/SGR和16S rDNA-F/16S rDNA-R均能擴(kuò)增出單一條帶且無(wú)引物二聚體,引物特異性良好,使用該兩對(duì)引物進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),溶解曲線(圖5和圖6)顯示只有單一吸收峰,表明引物特異性良好。

圖5 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶溶解曲線Fig.5 Glycosyltransferase dissolution profile注:不同形狀的曲線表示各孔中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增。

圖6 16S rRNA溶解曲線Fig.6 16S rRNA dissolution profile注:不同形狀的曲線表示各孔中16S rRNA基因的擴(kuò)增。

2.5 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)囟茸兓捻憫?yīng)

以16S rDNA為內(nèi)參基因,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶為目的基因,以10 h取樣的25 ℃作為對(duì)照組,采用2-ΔΔCT算法計(jì)算不同溫度下目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖7所示。

圖7 溫度變化對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的影響Fig.7 Temperature changes affect the glycosyltransferase

PseudoalteromonasissachenkoniiHZ在不同溫度下培養(yǎng)20 h后,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量隨溫度的上升而增加。在20 h時(shí),引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量急劇上升,15 ℃和35 ℃引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量分別是20 ℃表達(dá)量的5.2倍、5.8倍。34 h和44 h時(shí)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量差異不大。

2.6 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)海鹽濃度變化的響應(yīng)

以16S rDNA為內(nèi)參基因,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶為目的基因,以10 h取樣的海鹽濃度4.5%作為對(duì)照組,采用2-ΔΔCT算法計(jì)算不同海鹽濃度下目的基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如圖8所示。

圖8 海鹽濃度對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響Fig.8 Salt concentration changes affect the glycosyltransferase

在10 h時(shí),海鹽濃度為4.5%引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量為海鹽濃度3.5%的2.5倍,海鹽濃度為5.5%引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量為海鹽濃度3.5%的2.0倍,10 h之后引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量都減少,34 h后不同海鹽濃度中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量無(wú)明顯變化。此外引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況也與前期發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化參數(shù)相吻合,從分子角度證明了最優(yōu)培養(yǎng)基中海鹽濃度的選擇,即當(dāng)海鹽濃度為4.5%時(shí),培養(yǎng)基中多糖產(chǎn)量最大。

2.7 引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)pH變化的響應(yīng)

以16S rDNA為內(nèi)參基因,引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶為目的基因,以10 h取樣的pH8作為對(duì)照組,采用2-ΔΔCT算法計(jì)算不同pH條件下目的基因的相對(duì)表達(dá)量。pH變化對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響如圖9所示。

圖9 pH變化對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響Fig.9 pH changes affect the glycosyltransferase

pH對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的影響與海鹽濃度對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的影響相似,即在10 h時(shí)pH為8和pH為9的培養(yǎng)基中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量分別為pH為7的1.64和1.67倍。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量都降低。

3 討論與結(jié)論

在海冰和海水界面存在著大量產(chǎn)生胞外多糖的細(xì)菌,高濃度的胞外多糖使得細(xì)菌在惡劣的寒冬條件和高鹽度中生存,并對(duì)冰晶對(duì)細(xì)菌的傷害起到緩沖作用[14]。Mancuso等從南極海冰和海水中分離得到兩株海洋細(xì)菌CAM025和CAM036,經(jīng)過16S rDNA鑒定為Pseudoalteromonas屬,對(duì)其胞外多糖研究發(fā)現(xiàn),其在-2、10 ℃時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量是20 ℃的30倍[15]。李江等考察了溫度對(duì)多糖合成關(guān)鍵酶基因ugd的影響,也發(fā)現(xiàn)低溫有利于胞外多糖的合成,其在2、10 ℃時(shí)基因的表達(dá)量是20 ℃的4倍[11]。這些研究結(jié)果支持了胞外多糖在低溫下對(duì)微生物區(qū)系具有重要作用。

胞外多糖在細(xì)菌極端環(huán)境適應(yīng)性中具有重要作用,并引起了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。細(xì)菌胞外多糖的生物合成的產(chǎn)量受外部因素的影響,因此通過熒光定量PCR檢測(cè)了溫度、pH、海鹽濃度對(duì)引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)低溫有利于引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),在不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)20 h時(shí),引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量急劇上升,15 ℃引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量是20 ℃表達(dá)量的5.2倍,由此可知細(xì)菌在低溫環(huán)境下會(huì)通過大量分泌胞外多糖來(lái)適應(yīng)環(huán)境,免受冰晶的傷害,鹽度和pH的改變也會(huì)影響引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),通過提高引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)細(xì)菌胞外多糖的合成量,以緩沖鹽度和pH對(duì)菌體的脅迫作用,通過控制胞外多糖的合成可能是菌體環(huán)境適應(yīng)性的策略之一。

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The impact of environmental factors on marine bacteriaPseudoalteromonasissachenkoniiHZ glycosyltransferase gene expression

LU Xiao-ping,XU Yan-rui,FAN Qiu-ping，HAO Lu-jiang*

(Qilu University of Technology,Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering,Jinan 250353,China)

To study the biosynthesis gene cluster of the polysaccharide produced by marine bacteriumPseudoalteromonasissachenkoniiHZ,and to clone the gene which plays a key role in the synthesis of polysaccharide. Glycosyltransferase gene was amplified by designing primers using PCR technology from marine bacteriaPseudoalteromonasissachenkoniiHZ,and examined the effect of temperature,pH and salt concentration of glycosyltransferase gene expression by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the low temperature was in favor of the expression of the glycosyltransferase. With the increase of the temperature,the expression of the gene of the glycosyltransferase increased first and then decreased. It was showed that glycosyltransferase gene expression level increased rapidly,and the glycosyltransferase gene expression level ofPseudoalteromonasissachenkoniiHZ grown at 15 and 35 ℃ were 5.2,5.8 times higher than grown at 20 ℃,respectively. 4.5% salt concentration could increase the expression level of glycosyltransferase gene 2.5 times compared to that of 3.5% salt concentration,while 5.5% salt concentration glycosyltransferase gene expression level was 2 times compared to 3.5% salt concentration. The glycosyltransferase gene expression level ofPseudoalteromonasissachenkoniiHZ grown at pH8 and 9 were 1.64、1.67 times higher than grown at pH7,respectively. The research on glycosyltransferase gene ofPseudoalteromonasissachenkoniiHZ laid a foundation for exploring the mechanism of adaptation to the environment.

marine bacteriaPseudoalteromonasissachenkoniiHZ;glycosyltransferase;real-time PCR

2016-04-14

盧曉平(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物酶資源的開發(fā)與利用，E-mail:15288863082@163.com。

*通訊作者:郝魯江(1972-)，男，博士，副教授，研究方向：海洋細(xì)菌活性物質(zhì)的篩選，微生物酶資源的開發(fā)，E-mail:lujiang_hao@163.com。

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012CM019)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)22-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.033