何慧玲,馬成杰,王 琨,胡中澤,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

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高產(chǎn)酸及耐酸性干酪乳桿菌的誘變篩選

何慧玲1,馬成杰2,王 琨2,胡中澤1,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

為篩選高產(chǎn)酸及耐酸的干酪乳桿菌菌株,以干酪乳桿菌LC2W為出發(fā)菌株,分別對其進(jìn)行紫外(Ultraviolet,UV)、亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)和硫酸二乙酯(Diethyl sulfate,DES)誘變以及人工胃液處理。結(jié)果顯示,通過0.3 g/L的亞硝基胍處理30 min和紫外線照射30 s后得到的誘變菌株LC2W-NTG-12,LC2W-UV-11表現(xiàn)出高產(chǎn)酸及耐酸性能。相同條件下,出發(fā)菌株LC2W和突變菌株LC2W-NTG-12,LC2W-UV-11經(jīng)24 h發(fā)酵后的滴定酸度分別為76.6 °T和112.7 °T,98.2 °T,突變菌株產(chǎn)酸能力分別提高了47.13%、28.20%。當(dāng)用pH為1.5的酸液處理2 h后,出發(fā)菌株和誘變菌株LC2W-NTG-12,LC2W-UV-11的致死率分別為76.44%、52.06%、56.36%,誘變菌株耐酸能力分別提高了24.38%、20.08%。而用0.16% DES處理30 min得到的誘變菌株LC2W-DES-33發(fā)酵后的酸度僅比出發(fā)菌株提高了14.10%,誘變效果并不明顯。說明亞硝基胍誘變可有效提高干酪乳桿菌的產(chǎn)酸及耐酸性能。

干酪乳桿菌,產(chǎn)酸,耐酸,誘變,篩選

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是我國衛(wèi)生部公布的可用于保健食品與普通食品的益生菌菌種之一,它能夠較好耐受人體的消化系統(tǒng),包括口腔中的酶、低pH的胃液以及小腸的膽汁酸等,進(jìn)入人體后,干酪乳桿菌可以在腸道內(nèi)大量存活,發(fā)揮調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收等作用[1]。同時(shí),干酪乳桿菌還具有降膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、血壓,促進(jìn)細(xì)胞分裂,增強(qiáng)人體免疫及預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長等益生保健功能[2]。當(dāng)前,干酪乳桿菌已廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪等發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中。然而,隨著干酪乳桿菌發(fā)酵的進(jìn)行,產(chǎn)生、積累的游離乳酸會使發(fā)酵乳制品pH逐漸降低,菌株耐受能力達(dá)到極限進(jìn)而衰亡,導(dǎo)致發(fā)酵乳制品營養(yǎng)價(jià)值和益生功能大大降低。因此篩選能在低pH下生長代謝的乳酸菌,提高其耐酸性是改良乳酸生產(chǎn)菌種的一個(gè)重要發(fā)展方向[3-6]。

優(yōu)化改良菌種特性常用的選育方法有誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程育種等,其中應(yīng)用最為廣泛的為誘變育種[7-8],誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群,促使其突變率大幅度提高,然后采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株。

Khattab等人[9]通過UV對米曲霉菌株Fs-3誘變篩選得到一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的突變株,該突變株比出發(fā)菌株產(chǎn)葡萄糖氧化酶提高了332.1%。Leslie等人[10]通過NTG誘變得到生產(chǎn)瑞士干酪的低溫敏感型突變株的丙酸桿菌,該突變菌株在32 ℃下生長與出發(fā)菌株一樣,但是在14 ℃下生長明顯緩慢。趙士豪等人[11]用紫外線和亞硝基胍對乳酸菌進(jìn)行兩輪復(fù)合誘變,最終得到一株產(chǎn)酸能力較出發(fā)菌株提高了30.64%的誘變株。王玉華等人[12]采用對干酪乳桿菌進(jìn)行紫外和亞硝基胍誘變之后再對其進(jìn)行基因組改組篩選到4株可以在pH3.8平板上旺盛生長且產(chǎn)酸量較高的改組菌株。

國內(nèi)外均有利用誘變技術(shù)提高乳酸菌產(chǎn)酸能力以及用基因組改組技術(shù)提高干酪乳桿菌耐酸性能的報(bào)道,但未見用誘變技術(shù)結(jié)合模擬人工胃液處理篩選高產(chǎn)酸及耐酸性干酪乳桿菌的研究。本研究采用實(shí)驗(yàn)室保存的干酪乳桿菌為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外、亞硝基胍和硫酸二乙酯誘變之后再經(jīng)人工胃液處理,篩選高產(chǎn)酸及耐酸性菌株。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LC2W(CGMCC No.0828) 由光明乳業(yè)研究院實(shí)驗(yàn)室保存;亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG) 日本TCL公司;硫酸二乙酯(Diethyl sulfate,DES) 美國Sigma公司;中性蛋白酶(編號4861492261,酶活≥1600 AZO/g) 丹麥丹尼斯克公司;氯化鈉、碳酸鈣、濃鹽酸、氫氧化鈉、酚酞指示劑、無水乙醇 均為國產(chǎn)分析純,購自上海國藥集團(tuán)。

Logic-A2生物安全柜 美國Labconco公司;MIR-253培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;Bugbox厭氧培養(yǎng)箱 英國Ruskinn公司;SA-300VF高壓蒸汽滅菌鍋 荷蘭Sturdy Industrial公司;GFL1002水浴鍋 德國GFL公司;Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司;868型pH計(jì) 美國Thermo Orion公司;Cinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀 法國AMS集團(tuán)。

1.2 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉粉10 g,酵母提取物5 g,葡萄糖20 g,乙酸鈉5 g,檸檬酸氫二胺2 g,磷酸氫二鉀2 g,硫酸鎂 0.2 g,硫酸錳 0.04 g,吐溫80 1 g,蒸餾水定容至1L,調(diào)節(jié)pH為6.2～6.4;MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基:于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加3‰固體CaCO3及2%的固體瓊脂;脫脂乳培養(yǎng)基:配制12%(w/w)的脫脂乳于115 ℃高溫滅菌5 min后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 將干酪乳桿菌LC2W接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h,7000 r/min離心5 min收集菌體,用0.85%(w/w)滅菌生理鹽水洗滌2次,將適量菌體懸浮于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水中制成細(xì)胞懸浮液。

1.3.2 紫外誘變 分別取適量上述菌懸液置于7個(gè)培養(yǎng)皿中,菌液厚度約為2 mm。于功率為20 W紫外燈下,距離45 cm,在攪拌狀態(tài)下分別照射10、20、30、40、50、60 s(開啟培養(yǎng)皿蓋開始計(jì)時(shí),達(dá)到要求時(shí)間后立即蓋上平皿蓋)。取經(jīng)紫外線照射的菌株和未經(jīng)照射的菌株,梯度稀釋至合適梯度,取適量涂布于MRS平板上,迅速用牛皮紙包好,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱(CO2:10%,N2:90%)中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算紫外致死率。

1.3.3 亞硝基胍誘變

1.3.3.1 誘變時(shí)間 將10 mg NTG溶于1 mL丙酮[13]配制10 mg/mL的亞硝基胍母液,將母液分別加入到5支10 mL上述菌懸液中使得亞硝基胍終濃度為0.3 g/L[14],于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)溫育20、30、40、50 min,7000 r/min,離心5min收集菌體,無菌生理鹽水重懸洗滌菌體兩次,梯度稀釋后涂布置MRS平板于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算NTG致死率。

1.3.3.2 誘變濃度 在確定了NTG處理時(shí)間后,再取10 mL菌懸液于6支15 mL離心管中,加入適量NTG溶液使其終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L,并于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)溫育一定時(shí)間后,同樣方法離心洗滌,計(jì)數(shù)方法同上,計(jì)算NTG致死率。

1.3.4 硫酸二乙酯誘變

1.3.4.1 誘變體積分?jǐn)?shù) 按1 mL DES:9 mL乙醇配制硫酸二乙酯溶液,分別取10 mL菌懸液于6支15 mL離心管中,根據(jù)諸葛健[15]推薦的DES誘變條件20～30 min,本實(shí)驗(yàn)選擇30 min為初始時(shí)間研究濃度影響。加入DES體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%,按照2.5倍DES溶液體積加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)[16],計(jì)算DES致死率。

1.3.4.2 誘變時(shí)間 在確定了DES誘變體積分?jǐn)?shù)后,再取10 mL菌懸液于6支15 mL離心管中,加入一定體積分?jǐn)?shù)的DES溶液,于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)分別溫育20、25、30、35 min,同樣方法離心洗滌,計(jì)數(shù),計(jì)算DES致死率。

1.3.5 人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 人工胃液的配制 先將濃度為36.46%的濃鹽酸稀釋成1 mol/L的稀鹽酸,加水稀釋調(diào)節(jié)pH分別為1.5、2.0、2.5、3.0,每100 mL液體中加入1 g中性蛋白酶,混勻,用0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾待用[17]。

1.3.5.2 接種人工胃液 將誘變后的菌體于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后,離心洗滌用生理鹽水稀釋后分別接入上述不同pH的人工胃液中,于37 ℃恒溫水浴鍋中溫育30 min。

1.3.6 篩選方法

1.3.6.1 初篩 將人工胃液處理的菌液離心洗滌兩次后分別稀釋至合適梯度后涂布于MRS-CaCO3平板中,每個(gè)梯度涂兩個(gè)平板,并設(shè)對照組,于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,挑選出其中溶鈣圈較大的菌落,于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

1.3.6.2 復(fù)篩 將MRS液體培養(yǎng)基中的菌體離心洗滌2次,懸于10 mL生理鹽水中,應(yīng)用紫外分光光度法在OD600 nm條件下測其OD值調(diào)整菌體濃度一致,以2%(w/w)的接種量分別接種于100 mL 12%的脫脂乳中,24 h后測定其pH和滴定酸度值,篩選出高產(chǎn)酸菌株。

1.3.6.3 耐酸性實(shí)驗(yàn) 將篩選出的高產(chǎn)酸菌株在pH分別為1.5、2.0、2.5、3.0以及時(shí)間分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 h條件下利用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算菌株的存活率,并作對照實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 指標(biāo)測定

1.3.7.1 致死率測定 采用平板活菌計(jì)數(shù)法測定菌數(shù),按下式計(jì)算致死率[18]:

致死率(%)=(未經(jīng)誘變菌落數(shù)-經(jīng)誘變菌落數(shù))/未經(jīng)誘變菌落數(shù)×100

根據(jù)致死率結(jié)果制作致死率曲線。利用SPSS進(jìn)行單因素方差分析,將分析結(jié)果用小寫字母進(jìn)行顯著性標(biāo)記。

1.3.7.2 酸度測定 酸度測定采用吉爾涅爾度表示[19],利用SPSS進(jìn)行差異性分析,同樣用小寫字母進(jìn)行顯著性標(biāo)記。

1.3.7.3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性測定 將篩選到的高產(chǎn)菌株分別傳代1、3、5、7次后精確測定其酸度值和pH1.5處理2 h后的存活率,觀察其產(chǎn)酸和耐酸的穩(wěn)定性。用SPSS進(jìn)行穩(wěn)定性差異分析,并用小寫字母標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變條件

圖1 紫外誘變時(shí)間對致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on lethality注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.1.1 紫外誘變時(shí)間的確定 干酪乳桿菌LC2W在紫外照射不同時(shí)間的致死率曲線如圖1所示,由圖1可以看出,紫外照射對菌株致死率影響較大,照射10 s致死率為51.9%,照射30 s致死率為85.4%,照射50 s致死率達(dá)到98.1%。有文獻(xiàn)報(bào)道,一般誘變致死率在80%～90%,易于篩選到變異幅度大的突變菌株[20-22],因此選擇紫外照射時(shí)間30 s為干酪乳桿菌LC2W的最佳誘變時(shí)間。

2.1.2 NTG誘變時(shí)間和劑量的確定 用濃度為0.3 g/L的NTG溶液處理菌株20～50 min,其致死率如圖2所示,隨誘變時(shí)間的延長,致死率逐漸升高,在處理時(shí)間達(dá)30 min時(shí),致死率達(dá)已到90.2%,因此以30 min為NTG的最佳誘變時(shí)間。

圖2 亞硝基胍處理時(shí)間對致死率的影響Fig.2 Effect of NTG treatment time on lethality

干酪乳桿菌LC2W在NTG不同濃度條件下,誘變處理30 min的致死率如圖3所示,由圖3可看出,隨NTG濃度的增大,致死率不斷增加,呈正相關(guān)。在誘變劑濃度為0.3 g/L時(shí),致死率達(dá)88.1%,此濃度為NTG最佳誘變濃度。古麗娜孜[23]等人誘變篩選高產(chǎn)低溫淀粉酶的淀粉芽孢桿菌、馬春麗[14]等人通過復(fù)合誘變處理得到高產(chǎn)酸保加利亞乳桿菌突變株,均在0.3 g/L的NTG濃度下得到最佳結(jié)果,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 亞硝基胍濃度對致死率的影響Fig.3 Effect of NTG concentration on lethality

2.1.3 DES誘變劑量和時(shí)間的確定 DES的體積分?jǐn)?shù)及誘變時(shí)間直接影響誘變效果,而其中DES體積分?jǐn)?shù)更是占主導(dǎo)作用[24]。干酪乳桿菌LC2W在DES不同濃度條件下,誘變處理后的致死率如圖4所示,由圖4可看出,隨DES濃度的增大,致死率不斷增加,在處理體積分?jǐn)?shù)為0.16%時(shí),致死率達(dá)89.7%,因此以此條件下的處理濃度為DES最佳誘變濃度。

圖4 硫酸二乙酯體積分?jǐn)?shù)對致死率的影響Fig.4 Effect of DES concentration on lethality

用體積分?jǐn)?shù)為0.16%的DES溶液處理不同時(shí)間,其致死率如圖5所示,由圖5可看出,隨誘變時(shí)間的延長,致死率逐漸增大,在處理時(shí)間達(dá)30 min時(shí),致死率達(dá)到91.2%,因此以30 min為DES的最佳誘變時(shí)間。

圖5 硫酸二乙酯處理時(shí)間對致死率的影響Fig.5 Effect of DES treatment time on lethality

2.2 菌落初篩結(jié)果

將UV誘變30 s,0.3 g/L NTG處理30 min以及0.16% DES處理30 min并經(jīng)人工胃液處理后的干酪乳桿菌LC2W涂布在MRS-CaCO3平板上,各處理組菌落形態(tài)如圖6所示,由圖6可看出,菌落形態(tài)一致,均呈乳白色的圓形菌落,表面光滑,但溶鈣圈有一定差異,挑取溶鈣圈較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

圖6 加碳酸鈣的MRS平板上的菌落形態(tài)Fig.6 Colonies of the mutant strain on the MRS tablet with CaCO3

從圖7誘變前后菌株顯微圖中可看出,菌株形態(tài)為桿狀,但NTG誘變后的菌株形態(tài)呈長桿狀,其他三株形態(tài)無較大差異,均為短桿狀,說明NTG誘變對菌株影響較為顯著。

圖7 誘變前后菌株顯微圖片(100×)Fig.7 Micrograph of the stains before and after mutation(100×)

2.3 菌落復(fù)篩結(jié)果

菌落復(fù)篩結(jié)果如表1所示,LC2W-UV-11、LC2W-NTG-12兩株菌在發(fā)酵18 h后即呈凝乳狀態(tài),有微量乳清析出,說明其產(chǎn)酸較快,12株正突變菌株發(fā)酵24 h后的pH和酸度如表3所示。通過3種誘變方法,最終篩選出1株產(chǎn)酸能力達(dá)112.7 °T的誘變株,較出發(fā)菌株提高了47.13%。

表1 誘變菌株產(chǎn)酸能力比較

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 產(chǎn)酸能力比較

突變株LC2W-NTG-12與出發(fā)菌株LC2W的發(fā)酵曲線如圖8所示,發(fā)酵初始時(shí),誘變菌株pH下降速度較原始出發(fā)菌株略快;12 h以后,誘變菌株pH下降速度明顯高于出發(fā)菌株;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到18 h時(shí),誘變菌株pH已達(dá)到4.34,而出發(fā)菌株僅為4.75,差異顯著(p<0.05)。由此說明,篩選出的菌株產(chǎn)酸能力較出發(fā)菌株具有明顯優(yōu)勢。

表2 兩株突變菌株與出發(fā)菌株LC2W的耐酸能力比較(×108 CFU/mL)

注:同列大寫字母不同表示差異顯著(p<0.05),大寫字母相同表示差異不顯著(p>0.05);同行小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05),小寫字母相同表示差異不顯著(p>0.05)。

表3 誘變菌株LC2W-NTG-12遺傳穩(wěn)定性

圖8 突變菌株LC2W-NTG-12與出發(fā)菌株LC2W發(fā)酵酸度曲線對照Fig.8 Comparison of the fermentation acidity curve of the mutagenesis strain LC2W-NTG-12 and parent strain LC2W

2.5 耐酸能力比較

由表2可看出,隨著體系pH的降低以及處理時(shí)間的延長,活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。誘變菌株LC2W-NTG-12、LC2W-UV-11、出發(fā)菌株在pH1.5的高酸環(huán)境下2 h致死率分別為52.06%、56.36%、76.44%。在pH2.0的環(huán)境下,原始菌株和LC2W-UV-11活菌數(shù)在0.5 h即出現(xiàn)明顯下降,而LC2W-NTG-12活菌數(shù)在1 h以后降低顯著。

2.6 誘變菌株LC2W-NTG-12遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

上述各代的產(chǎn)酸及耐酸能力基本一致,沒有顯著差異(p>0.05),說明了該誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性好,不易發(fā)生退變。

3 結(jié)論

出發(fā)菌株LC2W發(fā)酵24 h后,發(fā)酵乳滴定酸度為76.6 °T,pH1.5酸處理2 h后的致死率為76.44%。經(jīng)0.3 g/L的NTG處理30 min,再通過人工胃液處理、MRS-CaCO3平板篩選得到的LC2W-NTG-12誘變菌株,24 h的滴定酸度為112.7 °T,較出發(fā)菌株提高了47.13%,并且此菌株能耐受pH為1.5的高酸環(huán)境,2 h后的致死率僅為52.06%,顯著低于出發(fā)菌株。紫外誘變30 s后得到菌株LC2W-UV-11,其發(fā)酵乳滴定酸度為98.2 °T,產(chǎn)酸能力較出發(fā)菌株酸度提高了28.20%,耐酸性提高了20.08%,誘變效果也較為明顯。而硫酸二乙酯雖然是一種很強(qiáng)的誘變劑,但其誘變結(jié)果并不十分理想,得到的最優(yōu)菌株的發(fā)酵乳酸度較出發(fā)菌株僅提高了14.10%。誘變成功的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性好,不易發(fā)生回復(fù)突變。

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Screening high acid-producing and acid-resistantLactobacilluscaseistrains

HE Hui-ling1,MA Cheng-jie2,WANG Kun2,HU Zhong-ze1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Dairy Research Institute of Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

In order to screen a high acid-producing and acid-resistant strain,LactobacilluscaseiLC2W was subjected by Ultraviolet(UV),Nitrosoguanidine(NTG),Diethyl sulfate(DES)respectively,and then treated with simulated gastric fluid. The results showed that the mutation strain LC2W-NTG-12 and LC2W-UV-11 which were subjected by 0.3 g/L NTG for 30 min and UV treatment for 30 s exhibited high acid-producing and acid-resistant. In the same amount of inoculation,the acidity of the fermented by the parent strain and mutation strain were 76.6 °T and 112.7 °T,98.2°T after 24 h,respectively. The acid-production rate of mutation strain was improved 47.13%,28.20%. In addition,when the strains were treated with the acid(pH=1.5),the mortality rate of parent stain and mutation strain were 76.44% and 52.06%,56.36% after 2 h,respectively. The acid-resistant rate of mutation strain was improved 24.38%,20.08%. But the effect of mutation strain LC2W-DES-33 which was subjected by 0.16% DES for 30 min was not obvious. The acid-production rate of mutation strain was improved only 14.10% compared with the parent strain. This implied that NTG mutation can effectively improve the acid-producing and acid-resistant of theLactobacilluscaseiLC2W.

Lactobacilluscasei;acid-producing;acid-resistant;mutation;screening

2016-05-27

何慧玲(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工，E-mail:15902736498@163.com。

*通訊作者:胡中澤(1968-)，男，教授，碩士研究生，研究方向：食品加工，E-mail:huzz1968@126.com。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD18B01)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)22-0217-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.034