陳穎璐,石亞偉

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030006)

?

亞麻種子中胰蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究

陳穎璐,石亞偉*

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030006)

將亞麻種子去殼粉碎,經(jīng)丙酮脫脂和Tris-HCl緩沖液提取后,Q-SepharoseTMFast flow離子交換層析一步純化,獲得電泳純的亞麻胰蛋白酶抑制劑(LUTI),純化倍數(shù)可達(dá)9.62,活力回收率為6.25%,比活力為55.35 U/mg,SDS-PAGE電泳顯示LUTI分子量大小約為8 ku。質(zhì)譜鑒定屬于Potato型胰蛋白酶抑制劑,其抑制活性在pH2.0～6.0以及70 ℃以下有較好的穩(wěn)定性,最適pH為6.0,最適溫度為40 ℃,屬于一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,Ki值為9.18×10-4mol/L。DTNB法檢測(cè)LUTI含有一對(duì)二硫鍵,二硫鍵存在有助于提高LUTI的穩(wěn)定性和活性。

亞麻種子,胰蛋白酶抑制劑,分離純化,酶活測(cè)定

亞麻(LinumusitatissimumL.)是一種亞麻科亞麻屬的一年生草本植物[1],在我國(guó)西北,華北地區(qū)種植廣泛。亞麻籽中含有多種生物活性物質(zhì):亞麻蛋白、亞麻酸、木酚素以及亞麻膠等[2]。亞麻籽中粗蛋白含量可達(dá)到23%～33%,主要為球蛋白和白蛋白,是植物中優(yōu)質(zhì)蛋白,具有很高的食用和醫(yī)藥價(jià)值[3]。

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor,TI)是一類(lèi)可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽,屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族,廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[4]。胰蛋白酶抑制劑的傳統(tǒng)來(lái)源為豆科植物和動(dòng)物肝臟[5],在植物貯藏器官中,其含量通常高達(dá)總蛋白的10%左右[6]。Bowman-Birk于1944年首次從大豆中提取出大豆胰蛋白酶抑制劑(BBI)[7],近年來(lái)也陸續(xù)從其他豆類(lèi)作物如豇豆、菜豆以及黑豆種子[8-10]和谷類(lèi)作物蕎麥、莜麥[11-12]種子中分離出不同類(lèi)型的胰蛋白酶抑制劑。它們的生理功能和臨床應(yīng)用受到研究者的廣泛關(guān)注,在臨床上用來(lái)治療急性胰腺炎、防治腦水腫、腦缺血、腦血管痙攣等[13],目前還發(fā)現(xiàn)具有抗病毒、抗腫瘤、抗真菌和抗蟲(chóng)等重要作用[14-17]。

天然提取的胰蛋白酶抑制劑環(huán)境兼容性好、安全、開(kāi)發(fā)成本低,具有比較好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景[18]。植物中的胰蛋白酶抑制劑,大多通過(guò)離心、鹽析后再利用純化效率比較高的層析法進(jìn)行純化,多為兩種以上的層析方法[6]。Lingaraju等[19]通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、胰蛋白酶-瓊脂糖凝膠親和層析、DEAE-纖維素離子交換層析從刀豆中分離出一種分子量為19.7 ku的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(ESTI),純化倍數(shù)為2.3。王競(jìng)等[20]采用熱沉淀、硫酸銨分步鹽析法制備了油菜種子胰蛋白酶抑制劑粗提物,進(jìn)一步使用DEAE陰離子交換層析,Sephadex G50分子篩凝膠過(guò)濾,純化得到電泳純度的抑制劑,制備得率為2.3%。Kowalska等[21]以紫茉莉花種子和菠菜種子為原料,采用固定化胰凝乳蛋白酶親和層析,離子交換層析或制備電泳,反相HPLC,分離、純化得到4種胰蛋白酶抑制劑。劉同祥等[22]研究了綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化,采用酸抽提、加熱變性、硫酸銨分步沉淀法,制備了抑制劑的粗提物,然后通過(guò)Pellicon 5000超濾膜超濾,Sephorase 4B.胰蛋白酶親和純化得到純品。亞麻種子亞麻籽中也含有豐富的胰蛋白酶抑制劑,本實(shí)驗(yàn)以去殼亞麻種子為材料,從中分離得到一種天然的胰蛋白酶抑制劑(LUTI),并首次研究了其酶學(xué)性質(zhì),如最適溫度、最適pH及抑制劑類(lèi)型等,豐富了胰蛋白酶抑制劑的種類(lèi),拓寬了亞麻籽的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去殼亞麻種子 市售;N-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯酰胺鹽酸鹽(BAPNA)、對(duì)硝基苯胺(PNA) Sigma公司;牛胰蛋白酶(Trpysin) 250 U/mg,索萊寶公司;Q-SepharoseTMFast flow陰離子柱 GE公司;二硫蘇糖醇(DTT) 上海勵(lì)瑞生物科技有限公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

U-2010紫外分光光度計(jì) 日本日立公司;HS-800D恒溫水浴鍋 太倉(cāng)市科教器材廠;精密數(shù)顯酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器廠;LTQ VELO飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、高速冷凍離心機(jī)、蛋白垂直電泳槽、電泳儀 Thermo公司;-80 ℃冰箱 Eppendorf中國(guó)有限公司;冷凍干燥儀 GOLD-SIM公司;3 ku離心式濃縮管 Millipore公司;凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司;Bio-Kine圓二色譜儀 Bio Logic;AKTA Prime蛋白純化系統(tǒng) GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻種子中胰蛋白酶抑制劑的分離純化 去殼亞麻種子粉碎后,加入6倍體積量的丙酮,于4 ℃浸泡脫脂8 h,用短頸漏斗過(guò)濾后,濾渣在通風(fēng)櫥中自然干燥,待丙酮自然揮發(fā)后得到亞麻粉末。將脫脂亞麻粉末溶于6倍體積量的0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中,4 ℃攪拌過(guò)夜,12000 r/min離心30 min,收集上清,上清4 ℃自然靜置過(guò)夜,待不溶物自然沉淀,12000 r/min離心30 min,收集上清,得到澄清的亞麻蛋白粗提液[11],在AKTA Prime蛋白純化系統(tǒng)上,取5 mL粗提液樣品上樣至用相同緩沖液平衡好的Q-SepharoseTMFast flow陰離子柱,流速為2 mL/min,在收集盤(pán)上收集穿透樣品,用3 ku離心式濃縮管在高速冷凍離心機(jī)上,3000 r/min進(jìn)行離心濃縮,濃縮后樣品經(jīng)透析除鹽,再經(jīng)冷凍干燥儀抽真空冷凍干燥成蛋白粉,蛋白樣品保存于-80 ℃冰箱中。將純化過(guò)程中每個(gè)樣品進(jìn)行活性測(cè)定及SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 亞麻胰蛋白酶抑制劑的質(zhì)譜分析 考馬斯亮藍(lán)染后的LUTI樣品經(jīng)DTT還原,烷基化處理,乙腈脫色后,37 ℃下胰酶過(guò)夜膠內(nèi)酶解[23],轉(zhuǎn)移酶解原液至新的1.5 mL離心管中,加入100 μL 抽提液(60%乙腈/0.1%三氯乙酸),超聲15 min,功率80 W,超聲10 s,間歇15 s,工作次數(shù)10次,超聲后將提取液與酶解原液合并,凍干后取出。加入0.1%乙酸溶液60 μL復(fù)溶進(jìn)行LC-ESI-MS分析,分析條件:349 nm氮分子激光,反射模式;加速電壓:15 kV,grid1電壓7.264 kV;激光強(qiáng)度:3200;掃描范圍:800～4000,掃描累加次數(shù)1000,延遲時(shí)間600 ns;質(zhì)譜圖肽段質(zhì)量范圍選擇在10～180 ku[24]。質(zhì)譜分析結(jié)果用BioworksBrowser 3.3軟件檢索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定蛋白質(zhì)。

1.2.3 亞麻胰蛋白酶抑制劑的酶學(xué)分析

1.2.3.1 牛胰蛋白酶產(chǎn)物(PNA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 精確稱(chēng)取一定量的PNA,將其溶于0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液中,配制濃度為5×10-6、1×10-5、1.5×10-5、2×10-5、2.5×10-5mol/L的PNA溶液,測(cè)量410 nm處吸光值。以PNA濃度為橫坐標(biāo),OD410吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 胰蛋白酶抑制劑的活性測(cè)定 測(cè)定方法參照Erlanger[25]的方法,以BAPNA為底物,LUTI 0.4 mL(50 μg/mL)與0.4 mL牛胰蛋白酶(0.2 mg/mL,用0.001 mol/L HCl溶液配制)于37 ℃恒溫水浴保溫10 min后,再加入2 mL BAPNA溶液(0.5 mg/mL,用少量DMSO溶液溶解后,加入0.05 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L CaCl2·2H2O,pH8.0的緩沖液補(bǔ)足2 mL),在37 ℃反應(yīng)10 min后,加入0.5 mL 33%醋酸溶液終止反應(yīng),在410 nm處測(cè)其吸光值,以不加LUTI試樣為空白對(duì)照。胰蛋白酶活力單位定義為:37 ℃下,pH為8.0的緩沖體系中,每分鐘水解BAPNA生成1 μmol/L PNA所需要的酶量為一個(gè)活力單位。胰蛋白酶抑制劑活力單位定義為:在相同條件下,降低一個(gè)酶活性單位所需的抑制劑量。

本文中蛋白測(cè)定均采用UV紫外吸收法[26]在280 nm下進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式如下：

蛋白濃度(μmol/L)=A280/ε×D×106

其中:A280為280 nm處的吸光度值,ε為L(zhǎng)UTI的消光系數(shù),D為稀釋倍數(shù),106為mol與μmol之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。

1.2.3.3 pH對(duì)抑制活性的影響 稱(chēng)取2 mg LUTI加入以下體系:pH2.0～5.0,0.05 mol/L的HAc-NaAc緩沖溶液;pH6.0～8.0,0.05 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液;pH9.0～10.0,0.05 mol/L的H3BO3-Na2B4O7緩沖溶液,測(cè)定不同pH條件下抑制胰蛋白酶的活性,最終確定其最適pH。pH穩(wěn)定性的測(cè)定,則采取將樣品在上述緩沖液中室溫放置30 min,取相同量的LUTI按1.2.3.2方法測(cè)定其抑制胰蛋白酶的活性。

1.2.3.4 溫度對(duì)抑制活性的影響 稱(chēng)取2 mg LUTI純品溶于0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中,按照前述方法分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃體系中測(cè)定不同溫度條件下抑制胰蛋白的活性,最終確定其最適溫度。溫度穩(wěn)定性的測(cè)定,則采取上述不同溫度處理30 min,然后快速冰浴冷卻,取相同量的LUTI按1.2.3.2方法測(cè)定其抑制胰蛋白酶的活性。

1.2.3.5 抑制劑動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 以BAPNA為底物,反應(yīng)終濃度分別為0.25、0.5、1、2、2.5 mmol/L;胰蛋白酶量為120 μg(酶活力為1.91 U);LUTI終濃度分別為0.612、1.424 mg/mL,反應(yīng)時(shí)間為5 min,測(cè)定反應(yīng)速度。采用雙倒數(shù)(Lineweaver-Burk)作圖法,確定LUTI抑制類(lèi)型和抑制常數(shù)。

1.2.4 胰蛋白酶抑制劑中半胱氨酸殘基及二硫鍵數(shù)目的測(cè)定

1.2.4.1 游離巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Ellman[27]的方法,準(zhǔn)確量取1.0 mL LUTI蛋白樣品,向其中加入2 mL Tris-Gly(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L Gly,pH8.0)溶液和50 μL DTNB(0.01 mol/L DTNB,0.2 mol/L Tris-HCl,pH8.0)溶液,迅速混勻后于37 ℃保溫5 min后在412 nm處測(cè)其吸光值,并以0.5 mol/L Tris-HCl溶液代替樣品作空白對(duì)照。LUTI樣品作3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取其平均值,利用如下公式進(jìn)行計(jì)算[28]:

游離巰基含量(μmol/g)=73.53×A412×D/C,其中A412是412 nm處的吸光值,D為稀釋因子,C為蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.4.2 總的巰基數(shù)的測(cè)定 向經(jīng)8 mol/L尿素37 ℃處理4 h的0.5 mL LUTI蛋白樣品中加入2 mL Tris-Gly(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L Gly,pH8.0)溶液和50 μLβ-巰基乙醇溶液,37 ℃溫浴1 h后加入10 mL 12%三氯乙酸溶液,繼續(xù)在37 ℃溫浴1 h,11000 r/min離心30 min,用5 mL 12%三氯乙酸溶液重懸沉淀兩次,最后用2 mL Tris-Gly(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L Gly,pH8.0)重新溶解沉淀,加入50 μL DTNB溶液,迅速混勻后于37 ℃保溫5 min后在412 nm處測(cè)其吸光值,并以0.5 mol/L Tris-HCl溶液代替樣品作空白對(duì)照。LUTI樣品作3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取其平均值,利用如下公式進(jìn)行計(jì)算[28]:

總巰基含量(μmol/g)=游離巰基含量+還原二硫鍵后的巰基含量=73.53×A412×D/C,其中A412是412 nm處的吸光值,D為稀釋因子,C為蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.4.3 二硫鍵含量測(cè)定 二硫鍵含量按以下公式計(jì)算[28]:

二巰鍵含量(μmol/g)=(總巰基含量-游離巰基含量)/2

1.2.5 胰蛋白酶抑制劑二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 LUTI的圓二色譜分析在Bio-Kine儀上進(jìn)行,反應(yīng)測(cè)定溫度為室溫,具體設(shè)置參數(shù)如下:光譜掃射范圍為190～300 nm,譜帶寬帶為1.0 nm,掃描速度為100 nm/min,掃描模式為Average(掃描次數(shù)三次,累加求平均值),記錄CD光譜。

1.2.6 二硫蘇糖醇對(duì)亞麻胰蛋白酶抑制劑活性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響 稱(chēng)取2 mg LUTI純品溶于0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中,加入終濃度為5×10-3mol/L的二硫蘇糖醇(DTT),室溫下保溫60 min后,在20、40、60、80、100 ℃恒溫水浴保溫30 min,以在相同溫度下未加入DTT的LUTI樣品作為對(duì)照,比較DTT對(duì)LUTI活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理均采用Origin 9.0、Photoshop cs4軟件進(jìn)行處理和作圖。質(zhì)譜分析結(jié)果采用BioworksBrowser 3.3進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻胰蛋白酶抑制劑的分離與鑒定

脫脂后的亞麻蛋白粗提液,上樣于用0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液平衡好的Q-SepharoseTMFast flow柱,使粗提液中雜蛋白結(jié)合在Q-SepharoseTMFast flow柱上,目標(biāo)蛋白不結(jié)合,以穿透液形式從柱上流出,一步得到了LUTI純品,純化倍數(shù)達(dá)到9.62,與其他多步提取胰蛋白酶抑制劑的方法[19-21]相比,簡(jiǎn)單快捷,可操作性強(qiáng),大大降低純化過(guò)程的繁瑣。經(jīng)SDS-PAGE確定LUTI的分子量大小約為8 ku,如圖1所示。

圖1 經(jīng)純化的LUTI的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of LUTI by SDS-PAGE注:Mr:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì);1:亞麻胰蛋白酶抑制劑粗提液;2:Q-Sepharose穿透樣品。

將純化得到的LUTI進(jìn)行LC-ESI-MS分析。所得到三個(gè)肽片段NAWPELVGK(m/z=1973.264),SGNMAAATVER(m/z=1107.224)和VWVIVNDH GVVTSVPHIT(m/z=1014.16),經(jīng)BioworksBrowser 3.3軟件檢索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù),表明該蛋白肽段與亞麻科植物亞麻中胰蛋白酶抑制劑相似度為100%。證明從亞麻種子中分離得到的大小為8 ku的蛋白為亞麻胰蛋白酶抑制劑(LUTI),根據(jù)氨基酸序列同源性分析LUTI屬于PotatoⅠ型胰蛋白酶抑制劑家族(圖2、表1)。Potato型抑制劑,是一類(lèi)誘導(dǎo)型抑制劑,主要分為PotatoⅠ型和PotatoⅡ型,前者主要抑制胰蛋白酶,后者對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶均有一定程度的抑制作用[29]。

表1 LUTI肽片段氨基酸序列比對(duì)

圖2 LUTI的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.2 LC-ESI mass spectrum analyse LUTI from naked flax seeds注:A:NAWPELVGK肽段的指紋圖譜;B:SGNMAAATVER肽段的指紋圖譜;C:VWVIVNDHGVVTSVPHIT肽段的指紋圖譜。

2.2 亞麻胰蛋白酶抑制劑的酶學(xué)分析

2.2.1 牛胰蛋白酶底物(PNA)標(biāo)準(zhǔn)曲線 見(jiàn)圖3。

圖3 PNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of PNA

2.2.2 胰蛋白酶抑制劑的活性測(cè)定 對(duì)亞麻蛋白粗提液和Q-SepharoseTMFast flow柱穿透樣品分別進(jìn)行胰蛋白酶抑制劑的活性檢測(cè),穿透樣品中得到的LUTI純品,比活力為55.35 U/mg,與粗提液相比提升了9.62倍,同時(shí)活性回收率為6.25%,結(jié)果如表2所示。

表2 LUTI的純化過(guò)程

2.2.3 pH對(duì)胰蛋白酶抑制劑活力的影響 按1.2.3.2方法測(cè)定不同pH下LUTI對(duì)胰蛋白酶的抑制作用。圖4結(jié)果表明,LUTI的最適pH為6.0。在pH2.0～6.0的緩沖液中放置30 min后,LUTI的抑制活性逐漸上升,當(dāng)pH大于6.0時(shí),抑制活性有了明顯下降,在pH為10.0時(shí),抑制活性下降了40%,但仍保留60%的抑制活性。表明LUTI是一種對(duì)酸性條件比堿性條件相對(duì)穩(wěn)定的胰蛋白酶抑制劑。

圖4 LUTI的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 The optimum pH and pH stability of LUTI from flax

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響 按1.2.3.2方法測(cè)定不同溫度下LUTI對(duì)胰蛋白酶的抑制作用。圖5結(jié)果表明,LUTI的最適溫度為40 ℃。在20～70 ℃加熱30 min,LUTI抑制活性受溫度影響的變化幅度較小,仍保留80%以上。當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí),抑制活性顯著下降,當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí),抑制活性?xún)H剩余20%左右。表明LUTI是一種活性在20～70 ℃相對(duì)穩(wěn)定的耐熱型胰蛋白酶抑制劑。

圖5 LUTI的最適溫度及穩(wěn)定穩(wěn)定性Fig.5 The optimum temperature and temperature stability of LUTI from flax

2.2.5 抑制劑動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 按Lineweaver Burk作圖法,以BAPNA為底物,由圖6可知,與未加抑制劑組相比較,隨著加入LUTI濃度的增加,1/v逐漸增加,而-1/Km并未改變,證明亞麻中的LUTI為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,經(jīng)計(jì)算LUTI的Km值為1.56×10-3mol/L,根據(jù)公式1/v′=1/vmax(1+[I]/Ki)計(jì)算得到,Ki值為9.18×10-4mol/L。從植物種子如大豆、黑豆、鷹嘴豆等種子[7,13,18]中所分離出的胰蛋白酶抑制劑多為競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,LUTI作為一種非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,與Ki值為8.8×10-3mol/L的黑豆胰蛋白酶抑制劑[30]和Ki值為2.1×10-3mol/L的葵花籽中的胰蛋白酶抑制劑[31]相比較,LUTI對(duì)胰蛋白酶具有更強(qiáng)的抑制作用。而LUTI的這種非競(jìng)爭(zhēng)型抑制模式,可能避免競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑造成的植物體內(nèi)其它同樣以絲氨酸為活性中心的正常蛋白酶失活而引起的不良反應(yīng)[31],但是LUTI與胰蛋白酶的具體作用位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。

圖6 LUTI抑制動(dòng)力學(xué)Fig.6 Lineweaver-Burk plots of trypsin activity

2.3 胰蛋白酶抑制劑中半胱氨酸殘基及二硫鍵數(shù)目的測(cè)定

利用DTNB法檢測(cè)LUTI中的游離巰基數(shù),測(cè)得A412為0.01,根據(jù)公式計(jì)算可知:LUTI中基本沒(méi)有游離巰基;測(cè)總巰基數(shù)時(shí),測(cè)得A412為0.24,根據(jù)公式計(jì)算可知:經(jīng)尿素處理的LUTI中游離巰基數(shù)為25.05 μmol/g,即一分子蛋白中有1.97個(gè)-SH,約為2個(gè),與一級(jí)結(jié)構(gòu)序列相符合。LUTI中2個(gè)半胱氨酸殘基參與1對(duì)二硫鍵形成。

2.4 胰蛋白酶抑制劑二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

LUTI樣品溶液在Bio-Kine儀上進(jìn)行分析,圖7結(jié)果顯示在216 nm處出現(xiàn)輕微的負(fù)峰譜帶,195～198 nm處有一個(gè)正峰譜帶;在208 nm和222 nm處出現(xiàn)特征的雙負(fù)峰譜帶,192 nm處有一個(gè)正峰譜帶[32],說(shuō)明LUTI的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊為主。經(jīng)Pole Bioinformatique Lyonnais網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示LUTI中α螺旋為20.29%,β折疊為25.43%。

圖7 圓二色譜對(duì)LUTI二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析Fig.7 Analysis the secondary structure of LUTI from flax by circular dichroism

2.5 二硫蘇糖醇對(duì)亞麻胰蛋白酶抑制劑活性和穩(wěn)定性影響

在相同溫度下,加入DTT組與未加DTT組相比較,抑制活性顯著下降,在60 ℃時(shí),兩者差別最明顯,加DTT組抑制活性下降了40%,未加DTT組僅僅下降了8%左右。隨著溫度升高,與不加DTT組相比較,其抑制活性顯著下降(圖8)。LUTI與苦蕎中胰蛋白酶抑制劑(rBTI)和苦瓜中胰蛋白酶抑制劑(BGIT)空間結(jié)構(gòu)相似[14,33],DTNB法表明LUTI中有一對(duì)二硫鍵,DTT打開(kāi)二硫鍵的LUTI抑制活性會(huì)降低。LUTI中的這對(duì)二硫鍵使得該蛋白首尾相連成環(huán)狀緊密結(jié)構(gòu),這樣的結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)LUTI的穩(wěn)定性,使得其對(duì)高溫和酸性環(huán)境具有比較強(qiáng)的耐受性。

圖8 DTT對(duì)LUTI活性的影響Fig.8 Effect of DTT on trypsin inhibitory activity and stability of LUTI

3 結(jié)論

本文將亞麻蛋白粗提液經(jīng)Q-SepharoseTMFast flow柱處理,使雜蛋白全部結(jié)合在柱上,目標(biāo)蛋白不結(jié)合,以穿透液形式從柱上流出,一步得到了電泳純的LUTI純品,純化倍數(shù)達(dá)到9.62。LUTI屬于PotatoⅠ型胰蛋白酶抑制劑,是一種耐酸、耐熱的小分子量蛋白質(zhì),其最適pH為6.0,最適溫度為40 ℃。Lineweaver Burk作圖法顯示LUTI屬于一種非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,其Ki為9.18×10-4mol/L。LUTI的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含20.29%的α螺旋,25.43%的β折疊。LUTI含有一對(duì)二硫鍵,其對(duì)維持LUTI的穩(wěn)定性具有重要作用。鑒于大多胰蛋白酶抑制劑具有抗病毒、抗腫瘤、抗真菌和抗蟲(chóng)等生物活性,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將對(duì)LUTI其它生物活性做進(jìn)一步的研究。

[1]王克臣,冷超,李明. 亞麻形態(tài)發(fā)生的生理生化特性[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(12):30-34.

[2]魏長(zhǎng)慶,劉文玉,許程劍. 胡麻籽活性成分研究應(yīng)用進(jìn)展[J]. 糧食與油脂,2012(4):6-8.

[3]孫中義. 亞麻籽飼用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué),2010(1):37-41.

[4]王榮春,孫建華,何述棟,等. 胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2013,34(9):364-368.

[5]張寧,王鳳山. 胰蛋白酶抑制劑研究概況[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2004,25(2):115-117.

[6]Hibbettts K,Hines B,Williams D. An overview of proteinase inhibitors[J]. Journal of Veterinary Internal Medicine,1999,13(4):302-308.

[7]Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor[J]. The Journal of General Physiology,1946,29(3):149-154.

[8]Jones G,Moore S,Stein W H. Properties of chromatographically purified trypsin inhibitors from lima beans[J]. Biochemistry,1963,2(1):66-71.

[9]Xu D,Xue Q,McElroy D,et al. Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene,CpTi,in transgenic rice plants confers resistance to two major rice insect pests[J]. Molecular Breeding,1996,2(2):167-173.

[10]邵彪,汪少蕓,饒平凡. 黑豆種子中一種耐熱型胰蛋白酶抑制劑的分離及性質(zhì)表征[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2011,27(1):90-95.

[11]Wang L,Zhao F,Li M,et al. Conformational Changes of rBTI from Buckwheat upon Binding to Trypsin:Implications for the Role of the P 8′ Residue in the Potato Inhibitor I Family[J]. PloS one,2011,6(6):e20950.

[12]閆永飛. 莜麥中α-淀粉酶抑制劑的分離純化與性質(zhì)研究[D]. 太原:山西大學(xué),2011:29-31.

[13]蔡祖花,王鳳山. 胰蛋白酶抑制劑的臨床研究概況[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2000,21(3):157-159.

[14]han Y S,Zhang Y,Sze S C W,et al. A thermostable trypsin inhibitor with antiproliferative activity from small pinto beans[J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2014,29(4):485-490.

[15]Zhu M J,Zhang G Q,Wang H X,et al. Isolation and characterization of a Kunitz-type trypsin inhibitor with antiproliferative activity from Gymnocladus chinensis(Yunnan bean)seeds[J]. The Protein Journal,2011,30(4):240-246.

[16]Bleackley M R,Hayes B M,Parisi K,et al. Bovine pancreatic trypsin inhibitor is a new antifungal peptide that inhibits cellular magnesium uptake[J]. Molecular Microbiology,2014,92(6):1188-1197.

[17]Nath A K,Kumari R,Sharma S,et al. Biological activity ofDolichosbiflorusL. trypsin inhibitor against lepidopteran insect pests[J]. Indian Journal of Experimental Biology,2015,53:594-599.

[18]趙欣,付煊赫,張宗申,等. 鷹嘴豆種子胰蛋白酶抑制劑的分離純化與鑒定[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2011,27(3):287-292.

[19]Lingaraju M H,Gowda L R. A Kunitz trypsin inhibitor of Entada scandens seeds:another member with single disulfide bridge[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,2008,1784(5):850-855.

[20]王競(jìng),康莊,廖海,等.白菜型油菜種子胰蛋白酶抑制劑純化及部分性質(zhì)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2005,17(3):275-279.

[21]Kowalska J,Pszczota K,Wilimowska-Pelc A,et al.Trypsin inhibitors from the garden four o’clock(Mirabilisjalapa)and spinach(Spinaciaoleracea)seeds:Isolation,characterization and chemical synthesis[J].Phytochemistry,2007,68:1487-1496.

[22]劉同祥,牛建昭,許惠玉,等.綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離和純化[J].中國(guó)生化藥物雜志,2007,28(3):145-148.

[23]Mao Y,Kunapuli S P. Trypsin causes platelet activation independently of known protease-activated receptors[J]. Thrombosis and Haemostasis,2013,110(6):1241.

[24]Wisniewski J R,Zougman A,Nagaraj N,et al. Universal sample preparation method for proteome analysis[J]. Nature Methods,2009,6(5):359.

[25]Erlanger B F,Kokowsky N,Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1961,95(2):271-278.

[26]曹紅翠. 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[J]. 廣東化工,2007,34(8):93-94.

[27]Ellman G L. Tissue sulfhydryl groups[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1959,82(1):70-77.

[28]Riener C K,Kada G,Gruber H J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4′-dithiodipyridine[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2002,373(4-5):266-276.

[29]王長(zhǎng)良. Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008:2-3.

[30]趙偉偉. 黑豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化及活性鑒定[D].太原:山西大學(xué),2016:18-19.

[31]張俏. 葵花籽中非競(jìng)爭(zhēng)型胰蛋白酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)和純化[D]. 長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2008:33.

[32]王靜云,劉丹,唐乾,等. 圓二色譜研究Asp44在穩(wěn)定肌紅蛋白結(jié)構(gòu)中的作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(2):426-429.

[33]Miura S,Funatsu G. Isolation and amino acid sequences of two trypsin inhibitors from the seeds of bitter gourd(Momordicacharantia)[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1995,59(3):469-473.

Purfication and properies of the trypsin inhibitor from flax seeds

CHEN Ying-lu,SHI Ya-wei*

(Institute of Biotechnology,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

TheLinumusitatissimumtrypsin inhibitor(LUTI)had been isolated from naked flax seeds by acetone fractionation,Tris-HCl buffer extraction and Q-SepharoseTMFast flow. With the purification steps mentioned above,the overall recovery of enzymatic activity of 6.25%,the specific activity of 55.35 U/mg and the purification fold of 9.62 for LUTI from crude extraction was achieved.The LC-ESI-MS showed LUTI belonged to Potato trypsin inhibitor family and the relative molecular weight was 8 ku by SDS-PAGE. The trypsin inhibitory activity of LUTI was stable below 70 ℃,as well as pH2.0～6.0. The optimum temperature of LUTI was 40 ℃ and the optimum pH was 6.0. LUTI was a non-competitive inhibitor by kinetic assay with an inhibition constant Kiof 9.18×10-4mol/L and contained a pair of disulfide bond by DTNB assay,which was related with the stability and activity of LUTI.

Linumusitatissimumseeds;trypsin inhibitor;purification;enzyme activity assay

2016-06-17

陳穎璐(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：亞麻功能蛋白，E-mail：513916778@qq.com。

*通訊作者:石亞偉(1971-)，男，博士，教授，研究方向：蛋白質(zhì)工程，E-mail：yaweishi@sxu.edu.cn。

2016年山西農(nóng)業(yè)特色資源創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)支持。

TS210.1

A

1002-0306(2016)22-0234-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.037