涂 浩,吳利春,段 麗,尹 夢,侯夢瑩,張長城,袁 丁,劉朝奇,*

(1.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002;2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌443002)

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木瓜發(fā)酵液對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟脂質(zhì)代謝及AMPK/SIRT1通路的影響

涂 浩1,吳利春1,段 麗1,尹 夢1,侯夢瑩1,張長城2,袁 丁2,劉朝奇1,*

(1.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002;2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌443002)

目的:觀察木瓜發(fā)酵液對高糖高脂飼料誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠脂質(zhì)代謝及AMP激活蛋白酶(AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)通路的調(diào)控機制。方法:取雄性昆明小鼠32只,隨機分為4組,即正常組、模型組、木瓜發(fā)酵液高(10 mL/kg)和低劑量組(5 mL/kg),每組8只。三周后,收集小鼠血液及組織樣本。用試劑盒檢測血清ALT、肝組織甘油三酯(TG)含量,分別用RT-PCR和Western Bloting檢測p-AMPK和SIRT1基因的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果:與正常組比較,模型組小鼠病理證實肝組織脂質(zhì)蓄積嚴(yán)重,血清ALT和肝臟TG水平明顯升高(p<0.05),肝組織SIRT1、FoxO1和p-AMPK mRNA及蛋白表達均顯著降低(p<0.05)。與模型組比較,木瓜發(fā)酵液明顯改善肝組織脂質(zhì)蓄積,肝組織TG含量明顯下降(p<0.05),肝組織 SIRT1、FoxO1 mRNA和SIRT1、p-AMPK蛋白表達均顯著上調(diào)(p<0.05),其中木瓜發(fā)酵液高劑量組較低劑量組效果好,但二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:木瓜發(fā)酵液能夠改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠脂肪代謝紊亂,減輕肝臟脂質(zhì)蓄積,其作用機制可能與肝細胞內(nèi)AMPK/SIRT1通路的激活有關(guān)。

木瓜發(fā)酵液,非酒精性脂肪性肝病,AMPK/SIRT1通路,脂質(zhì)代謝

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)為排除過量酒精因素的影響,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征疾病。流行病學(xué)研究顯示,NAFLD在成年人中的發(fā)病率高達20%～33%,而在肥胖人群中的發(fā)病率高達到75%[1]。NAFLD與生活習(xí)慣,環(huán)境因素等多方面因素有關(guān)[2]。有研究顯示AMPK/SIRT1通路是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要通路[3],AMP激活蛋白酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)能夠感知機體內(nèi)能量代謝的變化,并可以通過影響物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié),維持肝臟糖脂代謝的平衡。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)具有多種功能,與基因轉(zhuǎn)錄沉默、糖異生、脂質(zhì)積累、胰島素分泌等密切相關(guān)。

表1 PCR引物序列

木瓜(Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai)為薔薇科木瓜屬植物貼梗木瓜的果實,具有食用、入藥、觀賞等多種用途?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)資木瓜對消化系統(tǒng)有較強的藥理活性。前期本課題組研究發(fā)現(xiàn)木瓜發(fā)酵液對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷有一定的防護作用[4]。

本研究采用高糖高脂飼料建立NAFLD小鼠模型,觀察木瓜發(fā)酵液對NAFLD小鼠糖脂代謝及AMPK/SIRT1通路的影響并探討其可能機制,為木瓜發(fā)酵液的開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明雄性小鼠 4～6周齡,體重18～22 g,三峽大學(xué)實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號(SCXK(鄂)2008-0005);膽固醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;高糖高脂飼料 按照普通飼料(56.5%)、膽固醇(3%)、膽酸鈉(0.5%)、豬油(10%)、果糖(30%)重量比制備而成;總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 大連寶生物科技有限公司;PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;兔單抗β- actin(sc-4778),兔多抗p-AMPKα1/2(sc-33524) 美國Santa Cruz公司;兔多抗SIRT1(#07-131) Millipore公司;羊抗兔二抗 武漢科瑞有限公司提供;顯影化學(xué)發(fā)光劑ECL 碧云天生物技術(shù)研究所。

梯度PCR儀 德國Applied Biosysterms公司;Powerpas Basic蛋白電泳儀器 美國Bio-Rad公司;Gene Genius凝膠分析系統(tǒng) 英國SYNGNE公司;Gellogic 200凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Kodak公司;DU730核酸蛋白分析儀 美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木瓜發(fā)酵液的制備 按課題組已有的方法進行制備?；具^程包括:酵母菌液的活化、木瓜發(fā)酵及木瓜發(fā)酵液的處理等過程[5]。

1.2.2 非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立 取雄性昆明小鼠32只,4～6周齡,隨機分成4組,每組8只,即正常對照組、模型組、木瓜發(fā)酵液低(5 mL/kg)和高劑量組(10 mL/kg)。除正常對照組給予普通飼料外,其余各組均給予高糖高脂飼料造模,同時用木瓜發(fā)酵液低、高劑量給小鼠灌胃,持續(xù)3周;觀察記錄各組小鼠造模前后體質(zhì)量變化、行為和狀態(tài)變化。

1.2.3 小鼠生化指標(biāo)檢測 3周后，摘小鼠眼球取血，取小鼠肝臟，附睪脂肪，腹部脂肪，并稱重，肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量/體重×100，附睪指數(shù)(%)=附睪脂肪重量/體重×100，按照試劑盒操作說明檢測血清ALT、肝組織甘油三酯(TG)含量。

1.2.4 肝臟組織HE染色 動物處死后,快速取10 mm×3 mm新鮮肝臟大葉組織塊放入包埋盒中,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,常規(guī)脫水后用石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡觀察肝組織病理變化。

1.2.5 肝臟組織油紅染色 取新鮮肝臟組織3塊,組織塊大小約為 1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm,用OTC固定液固定肝臟組織塊15 min后,在冰凍切片機上切片,切片厚度約10～15μm,進行常規(guī)油紅O染色,光鏡下觀察肝臟脂滴分布情況。

1.2.6 RT-PCR檢測小鼠肝組織SIRT1、Foxo1 和SREBP-1c mRNA的表達 按照試劑盒提供的方法提取肝臟組織總RNA,檢測RNA完整性,測定其濃度,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,PCR擴增,PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL∶11 μL DEPC水,12.5 μL PCR Master mix(2×),分別加入0.5 μL SIRT1和FoxO1上下游引物,最后加入1 μL cDNA模板。

表2 小鼠NAFLD相關(guān)指標(biāo)

注:與正常組比較,*:差異顯著(p<0.05);與模型組比較,#:差異顯著(p<0.05),##:差異極其顯著(p<0.01)。使用GAPDH作為內(nèi)參,引物序列見表1。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,照膠,測定條帶吸光度值,計算SIRT1、Foxo1和SREBP-1c與GAPDH吸光度比值。

1.2.7 Western Blot 檢測肝組織p-AMPK、SIRT1蛋白的表達 稱取50～80 mg 肝臟組織,按RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例(體積比)配好裂解液,用PBS洗滌剪碎的肝臟組織后,分別加入800 μL配好的裂解液,置冰盒里充分裂解,經(jīng)4 ℃、12000 r/min離心10 min后取上清,采用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度,將定量后的蛋白樣品于100 ℃水浴10 min變性后,將蛋白樣品進行電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜,將PVDF膜放置于5%脫脂牛奶封閉液中室溫封閉1 h。分別加一抗后,置于4 ℃冰箱搖床孵育過夜,TBST洗膜,加二抗室溫孵育1 h,ECL顯色,用Image J軟件分析條帶。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法 實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0軟件分析,使用Image J軟件分析RT-PCR與Western Blot實驗數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠生化指標(biāo)檢測

由表2可知,高脂飲食模型組小鼠的肝指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)、血清ALT和肝臟甘油三酯含量均顯著高于正常對照組(p<0.05),表明NAFLD模型誘導(dǎo)成功。與模型組比較,木瓜發(fā)酵液干預(yù)后可顯著改善高脂飲食誘發(fā)的肝指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)、血清ALT和肝臟甘油三酯水平的升高(p<0.05),表明木瓜發(fā)酵液可有效改善肝臟脂質(zhì)代謝。

2.2 肝臟病理檢測

從圖1和圖2可以看出,正常對照組小鼠肝組織HE和油紅染色顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常,可見中央靜脈周圍肝細胞形成的肝索呈放射狀排列,結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞無脂肪變性以及炎癥細胞浸潤;高脂飼料模型組有一定程度的肝細胞腫脹、胞漿淡染、脂肪空泡形成及肝索結(jié)構(gòu)紊亂;結(jié)果木瓜發(fā)酵液干預(yù)后肝細胞形態(tài)趨于正常,脂肪空泡明顯減少,油紅染色明顯減少,肝組織結(jié)構(gòu)基本正常。

圖1 小鼠肝組織HE染色(100×)Fig.1 HE staining of liver tissue of mice(100×)注:a:正常對照;b:高糖高脂模型組;c:木瓜發(fā)酵液低劑量組;d:木瓜發(fā)酵液高劑量組;圖2同。

圖2 小鼠肝組織油紅染色(200×)Fig.2 Oil red staining of liver tissue of mice(200×)

2.3 mRNA水平檢測代謝相關(guān)基因的表達

由圖3可以看出,與正常組相比,模型組Foxo1和SIRT1 mRNA表達相比均顯著降低(p<0.05),而SREBP-1c mRNA表達水平顯著增高(p<0.05)。木瓜發(fā)酵液干預(yù)后Foxo1和SIRT1的mRNA表達水平與模型組比較顯著增高,而SREBP-1c基因表達與模型組比較顯著降低,表明木瓜發(fā)酵液處理顯著改善高糖高脂膳食誘導(dǎo)的Foxo1、SIRT1和SREBP-1c基因表達異常。

圖3 肝組織中Foxo1、SIRT1和SREBP-1c基因mRNA的表達Fig.3 The mRNA expression levels of FoxO1,SIRT1and SREBP-1c mRNA in liver tissue of mice注:與正常組比較,#:差異顯著(p<0.05),與模型組比較,*:差異顯著(p<0.05);圖4同。

2.4 Western Bloting檢測能量代謝相關(guān)蛋白的表達

由圖4可知,模型組SIRT1和p-AMPKα1/2的蛋白表達水平顯著低于正常組(p<0.05),通過木瓜發(fā)酵液干預(yù)后可顯著增加SIRT1和P-AMPKα1/2的表達。

圖4 肝組織p-AMPK和SIRT1蛋白的表達Fig.4 The protein expression levels of p-AMPK and SIRT1 in liver tissue

3 討論

隨著NAFLD在全球范圍內(nèi)發(fā)病率的逐年增高以及由此導(dǎo)致的肝硬化和肝癌引起的死亡率的上升,合理膳食作為預(yù)防NAFLD的新思路將受到人們的廣泛關(guān)注。NAFLD屬于代謝性疾病,與心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性[6-7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)多種抗氧化劑具有調(diào)節(jié)糖脂代謝活性,這可能成為今后預(yù)防治療NAFLD新的潛在物質(zhì)[8]。本實驗?zāi)７氯藗內(nèi)粘８咛歉咧娘嬍沉?xí)慣,應(yīng)用高糖高脂誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)木瓜發(fā)酵液也可以有效干預(yù)NAFLD的脂代謝紊亂,降低TG水平,改善肝臟脂質(zhì)沉積。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sir2)相關(guān)酶類SIRTI是一種NAD+依賴的蛋白去乙?；?不僅使組蛋白去乙酰化以介導(dǎo)基因沉默,還可與Foxo家族等多種靶基因或蛋白相互作用,對細胞生存、衰老、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等起到十分重要的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可激活SIRT1,通過SIRT1-Foxo誘導(dǎo)細胞自噬的信號通路,改善ob/ob小鼠肝臟脂質(zhì)沉積[9]。在本研究也發(fā)現(xiàn),在NAFLD小鼠中SIRT1和Foxo1的表達降低,木瓜發(fā)酵液干預(yù)后可有效逆轉(zhuǎn)SIRT1和Foxo1的表達,從而降低肝臟GT的水平。木瓜素有“百益果王”的美稱,具有和肝和胃,降血壓等功效。木瓜果實營養(yǎng)全面,含有糖類、蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)多種營養(yǎng)成分,木瓜中所含的齊墩果酸成分具有降低轉(zhuǎn)氨酶活性、促進肝細胞再生、防止肝硬化等功效。木瓜中的黃酮類物質(zhì)具有穩(wěn)定血管、降低血壓、抗各種潰瘍等作用[10]。木瓜發(fā)酵液中也富含這些物質(zhì),具有改善肝臟脂質(zhì)代謝的功效。

應(yīng)用雄性C57BL/6J小鼠高脂飲食制備的NAFLD模型中,給予α-硫辛酸(alpha-lipoic acid)進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸增強Sirtuin 1去乙?；富钚?激活A(yù)MPK的蛋白激酶[11]。通過激活Sirtuin 1/LKB1/AMPK通路,阻止SREBP-1c的入核和Foxo1進入細胞質(zhì),增加脂肪甘油三酯脂肪酶的表達和減少脂肪酸合酶的豐度。本實驗的RT-PCR和Western Blot結(jié)果也顯示木瓜發(fā)酵液增強Sirtuin 1去乙?；富钚?激活A(yù)MPK的蛋白激酶,降低SREBP-1c的表達,從而改善肝臟脂質(zhì)代謝。

4 結(jié)論

通過高糖高脂飲食建立了肝細胞脂肪變性體內(nèi)模型,實驗結(jié)果表明木瓜發(fā)酵液可有效改善肝細胞脂肪變性,在分子水平通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT 1信號通路改善肝臟脂質(zhì)代謝。此研究可為合理開發(fā)木瓜發(fā)酵液防治NAFLD提供新的思路。

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Effects of fermentedChaenomelesspeciosajuice on lipid metabolism and AMPK/SIRT1 pathway in mouse with non-alcoholic fatty liver disease

TU Hao1,WU Li-chun1,DUAN Li1,YIN Meng1,HOU Meng-ying1, ZHANG Chang-cheng2,YUAN Ding2,LIU Chao-qi1,*

(1.Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,Yichang 443002,China 2. Medical College,Three Gorges University,Yichang 443002,China)

Objective:To observe the effects of fermentedChaenomelesspeciosaJuice(FCJ)on the lipid metabolism and AMPK/SIRT1 pathway of non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)mice induced by high sugar and fat diet. Methods:Thirty-two SPF male Kunming mice were divided randomly into four groups:the control group,the model group,the high-dose FCJ-treated group(10 mL/kg),and the low-dose FCJ-treated group(5 mL/kg). After the treatment of three weeks,the blood and liver samples were collected. The activity of ALT in serum and triglyceride(TG)in liver tissues were detected with detection kits. The histology of liver tissues was observed with HE and red oil O staining. The mRNA and protein expression levels of p-AMPK and SIRT1 in liver tissues were measured with RT-PCR and Western Bloting. Results:Compared with the normal group,hepatic lipid accumulation of model group was severe showed by histopathological examination,the serum levels of ALT and TG in the liver tissue were increased significantly(p<0.05),the expression levels of SIRT1,FoxO1 mRNA and SIRT1,P-AMPK protein of liver tissues were significantly decreased(p<0.05). Compared with the model group,the hepatic lipid accumulation in FCJ-treated groups was obviously ameliorated,the serum ALT and TG levels of FCJ-treated groups were significantly decreased(p<0.05),the expression levels of hepatic SIRT1,FoxO1 mRNA and p-AMPK,SIRT1 protein in FCJ-treated groups were significantly up-regulated(p<0.05). The effect of high dose group was better than the low dose group,but the two were not statistically significant. Conclusion:FCJ can ameliorate the disorder of lipid metabolism in the NAFLD mice induced by feeding high sugar and fat diet,and the mechanism may be related to the activation of AMPK/SIRT1 pathway in hepatocytes.

fermentedChaenomelesspeciosaJuice;non-alcoholic fatty liver disease;AMPK/SIRT1 pathway;lipid metabolism

2016-05-24

涂浩(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:tuhaofirst@163.com。

*通訊作者:劉朝奇(1962-)，男，博士，教授，研究方向：分子生物學(xué)和免疫藥理學(xué)，E-mail:ctgulcq@163.com。

國家自然科學(xué)基金項目﹙81473461﹚；三峽大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金(SDYC2016092)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0340-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.058