焦月華，張?zhí)m威，劉飛，張爽

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱150090；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

有氧呼吸條件下糞腸球菌LD33高密度增殖的研究

焦月華1,2，張?zhí)m威1，劉飛3，張爽3

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱150090；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

為獲得高活菌數(shù)的糞腸球菌LD 33的發(fā)酵液，首先通過優(yōu)化糞腸球菌LD 33的有氧呼吸代謝培養(yǎng)條件，隨后利用單因素和正交實驗對糞腸球菌LD 33的高密度增殖培養(yǎng)基組分進行研究。結(jié)果表明，糞腸球菌LD33的最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為乳清60 g/L，葡萄糖30 g/L，蛋白胨20 g/L和酵母粉10 g/L（均為質(zhì)量濃度）；當接種量為1%，初始pH值為6.4且轉(zhuǎn)速為220 r/min時，在37℃下培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液中糞腸球菌LD33的活菌數(shù)可以達到6.37×109mL-1。

糞腸球菌；高密度培養(yǎng)；有氧呼吸

0 引 言

糞腸球菌是主要定植于人類和動物腸道以及部分來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌。它們產(chǎn)生多種腸球菌素，能夠抑制革蘭氏陽性致病菌和其他食源性致病菌的生長[1]。本實驗室在篩選用于制作的發(fā)酵劑菌株過程中，發(fā)現(xiàn)1株糞腸球菌LD 33對志賀氏痢疾桿菌有很強的抑制能力，經(jīng)過過氧化氫和有機酸干擾排除試驗以及蛋白酶作用試驗后，證明發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)為抗菌肽。此外，該菌株在進行有氧呼吸代謝時能夠顯著提高生物量和存活率[2]。本研究以糞腸球菌LD 33為研究對象，在優(yōu)化其有氧呼吸代謝條件的同時采用單因素和正交試驗對其高密度增殖培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，確定高密度培養(yǎng)工藝，以期為后期大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株來源

糞腸球菌LD 33（Enterococcus faecalis），本實驗室保存。分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油制品，能夠抑制食源性致病菌，經(jīng)前期實驗已初步確定能夠產(chǎn)生抗菌肽。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

脫脂乳粉（進口），酵母粉，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，血紅素，大豆蛋白胨，胰蛋白胨，M 17培養(yǎng)基，葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基：按照文獻[3]中方法進行配制并進行部分修改，其中乳清粉60 g，KH2PO4和Na2HPO4均為7.5 g，加蒸餾水至1 L，110℃高壓滅菌10min。

血紅素溶液[4]：配置100 mL濃度為0.05 m o l/L的NaOH水溶液，稱取0.05 g血紅素，將其溶于NaOH水溶液中，即為質(zhì)量濃度為0.5 g/L的血紅素溶液，隨后倒入棕色廣口瓶中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器和設(shè)備

恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-240），生化培養(yǎng)箱（DHP-P272），超凈工作臺（VD-1320），高壓滅菌鍋（HVE-50），紫外/可見光分光光度計（DU 800），pH計（Delta 320）。

1.2 方法

1.2.1 菌體的活化

將本實驗室保存的糞腸球菌LD 33按照體積分數(shù)為1%的接種量接入到M 17液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)，每24 h傳代一次，活化兩次。

1.2.2 有氧呼吸代謝條件優(yōu)化

將活化后的糞腸球菌LD33以體積分數(shù)為1%的接種量，接種到滅菌后的M 17液體培養(yǎng)基中（三角瓶中M 17液體培養(yǎng)基的含量為瓶體容積的1/10，在滅菌之前以2%的體積比向培養(yǎng)基中添加血紅素溶液），振蕩培養(yǎng)8 h（穩(wěn)定期初期）。通過測定OD 600nm的吸光度值來比較不同溫度（30，37，42℃）、不同轉(zhuǎn)速（200，220，250 r/min）及初始pH值（6.0，6.4，6.8）對其增殖效果的影響。

1.2.3 碳氮源對菌體密度的影響

根據(jù)文獻[5]，在基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為20 g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖作為碳源，或者在基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為25 g/L的大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨作為氮源，以活菌數(shù)來反映不同碳氮源對糞腸球菌LD 33增殖效果的影響。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗優(yōu)化增殖培養(yǎng)基，其中碳氮源的因素水平設(shè)計除了根據(jù)1.2.3的實驗結(jié)果之外，還根據(jù)單因素的變化趨勢，綜合考慮效果和成本因素而定。另外，考慮到有氧呼吸條件下糞腸球菌增殖速率顯著增加，在生長過程中隨著菌體生物量的不斷增加，其對礦物質(zhì)元素和維生素的需求量也會相應(yīng)的增加，因此根據(jù)文獻[3,6]選擇酵母粉作為第三個因素。通過測定培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)來確定最佳增殖培養(yǎng)基。具體的因素水平如表1所示。

表1 因素水平編碼 g/L

1.2.5 菌體活菌計數(shù)方法

取1 mL發(fā)酵液，利用梯度稀釋平板活菌計數(shù)法[20]，選擇適宜稀釋度涂布M 17平板，隨后將平板37℃下培養(yǎng)48 h后計活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan's法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標準誤差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對增殖效果的影響

溫度對糞腸球菌LD 33增殖的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，糞腸球菌LD 33在30，37和42℃下生長時均有4 h左右的生長遲緩期，其中當30℃下培養(yǎng)時，糞腸球菌LD 33的生物量顯著低于在37℃下培養(yǎng)的生物量，隨后菌體的生物量都隨著時間的推移而不斷增加，到8 h為止，在30℃和42℃下培養(yǎng)的菌體的生物量差異不顯著，菌體在37℃培養(yǎng)時生物量增加的最大。細菌的生長繁殖是同化作用超過異化作用，細胞原生質(zhì)的量不斷增加，體積增大，隨后細胞分裂導(dǎo)致個體數(shù)目增加，這是一個緊密聯(lián)系又很難劃分的過程，它取決于個體菌株的生長速率，也即胞內(nèi)酶的代謝活性，而這又與培養(yǎng)溫度具有密切關(guān)系，最適增殖溫度隨菌株不同而異。糞腸球菌一般來源于哺乳動物腸道，屬于嗜溫菌，因此，結(jié)合圖1的結(jié)果選擇37℃作為糞腸球菌LD 33高密度培養(yǎng)的溫度。

圖1 溫度對糞腸球菌LD 33增殖的影響

圖2 為不同初始pH對糞腸球菌LD 33增殖的影響。由圖2可以看出，糞腸球菌LD 33在不同初始pH值培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，在前4 h內(nèi)均處于生長遲緩期，此后其生物量開始迅速增長。6 h時，在初始pH 6.4和pH 6.8下培養(yǎng)時的生物量顯著高于其在初始pH 6.0培養(yǎng)時的生物量，然而，當培養(yǎng)基初始酸度高于pH 6.4，當進入穩(wěn)定期初期后，生物量的增長并沒有顯著的差異。由于糞腸球菌LD 33具有作為益生菌制劑應(yīng)用的潛力，為了讓其更適應(yīng)胃腸道的酸性環(huán)境。因此，增殖培養(yǎng)基的初始pH值為6.4比較適宜。

圖2 初始pH值對糞腸球菌LD 33增殖的影響

圖3為不同轉(zhuǎn)速對糞腸球菌LD 33增殖的影響。由圖3可以看出，當搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，糞腸球菌LD 33的生物量最低，在轉(zhuǎn)速為220 r/min和250 r/min時，菌株的吸光度值一樣，也即生物量一樣。這是由于雖然糞腸球菌LD 33能夠在血紅素存在的情況下進行有氧呼吸代謝，但是當通氣過多，未被利用的氧氣分子仍然會對其菌體細胞造成損傷。因此，搖床的轉(zhuǎn)速不宜過高，確定搖床的最適轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對糞腸球菌LD 33增殖的影響

2.2 不同碳源對乳酸菌生長的影響

圖4為不同碳源對糞腸球菌LD 33增殖的影響。由圖4可以看出，葡萄糖促生長效果最明顯，乳糖次之，而麥芽糖和蔗糖的增殖效果明顯低于乳糖和葡萄糖，其中麥芽糖對糞腸球菌LD 33的生長幾乎沒有促進作用，因此選擇葡萄糖作為碳源。

圖4 不同碳源對糞腸球菌LD33增殖的影響

2.3 不同氮源對乳酸菌生長的影響

圖5為不同氮源對糞腸球菌LD 33增殖的影響。由圖4可以看出，牛肉膏促進糞腸球菌LD 33增殖的效果最明顯，而其他三種氮源的促生長效果沒有顯著差異。這是可能是由于牛肉膏中含有乳酸菌快速增殖生長所需要多肽和核苷酸等。綜合考慮氮源的促增殖效果和成本，選擇價格較便宜的蛋白胨，其增菌效果也比較明顯，糞腸球菌LD 33的活菌數(shù)達到了1.29× 109mL-1。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

糞腸球菌LD 33高密度增殖培養(yǎng)基的正交試驗的極差分析結(jié)果如表2所示。

圖5 不同氮源對糞腸球菌LD33增殖的影響

表2 優(yōu)化培養(yǎng)基的正交實驗結(jié)果

由表2可以看出，在優(yōu)化培養(yǎng)基中，優(yōu)選的三個因素，按照極差大小主次順序為B＞A＞C，即蛋白胨對糞腸球菌LD 33增殖的影響最大，葡萄糖影響次之，酵母粉最小。最佳增殖培養(yǎng)基配方為A3B3C3，然而由于A3B3C3不在設(shè)計的正交試驗組中，需要對其進行驗證實驗，驗證實驗結(jié)果表明，糞腸球菌LD 33的活菌數(shù)為6.37×109mL-1，高于試驗組中的活菌數(shù)最大的組合A3B3C2。因此得出A3B3C3為最佳增殖培養(yǎng)基成分組合，即：乳清60 g/L，葡萄糖30 g/L，蛋白胨30 g/L，酵母粉10 g/L（均為質(zhì)量濃度）。

3 討 論

乳酸菌屬于兼性厭氧菌，在進行厭氧發(fā)酵過程中容易受到環(huán)境中氧氣的脅迫作用，在細胞內(nèi)會形成超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫和臭氧等活性氧簇，它們會攻擊蛋白質(zhì)、核酸和脂類等胞內(nèi)物質(zhì)，導(dǎo)致菌體細胞受到損傷，進而引起細胞老化和衰亡[7]。然而，目前研究表明部分乳酸菌在進行有氧呼吸代謝時能夠增加菌體細胞的存活率和生物量[8]，這是由于它們能夠通過呼吸鏈將質(zhì)子傳遞給培養(yǎng)環(huán)境中的分子氧并轉(zhuǎn)化為水，不但細胞內(nèi)氧含量降低從而避免了氧分子對其菌體細胞的損傷，而且還無需再通過F0F1-ATPase利用水解ATP產(chǎn)生的能量將質(zhì)子外排，此外，研究還表明F0F1-ATP合成酶的“角色”還可能會發(fā)生反轉(zhuǎn)，通過重新收回有氧呼吸鏈外排的質(zhì)子來合成ATP[9-10]。研究結(jié)果表明[2,8]，糞腸球菌也能夠進行有氧呼吸代謝，因此本研究中通過優(yōu)化有氧呼吸培養(yǎng)條件來提高糞腸球菌LD 33的生物量和存活率。乳清粉是干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物，不但來源豐富，而且價格相對較為便宜。有研究表明[3,6]，當乳清粉是增殖培養(yǎng)基的主要成分時，在其中生長的乳酸菌菌體細胞能夠達到相對較高的濃度。然而乳清粉缺陷之處在于，其主要含有乳清蛋白和乳糖，因此，在乳清培養(yǎng)基中還需要加入多種供乳酸菌生長所需的生長因子，同時加入緩沖鹽類提高增殖培養(yǎng)基的緩沖能力，從而將發(fā)酵液的pH值控制在適宜的范圍內(nèi)。因此，本研究利用乳清磷酸鹽緩沖液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過正交優(yōu)化來確定酵母粉、葡萄糖和蛋白胨在高密度增殖培養(yǎng)基中的添加量。

4 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化得出有氧呼吸條件下糞腸球菌LD 33的高密度增殖培養(yǎng)基的最佳成分為：乳清60 g/L，蛋白胨30 g/L，葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L（均為質(zhì)量濃度）；當接種量為1%，初始pH值為6.4且轉(zhuǎn)速為220 r/min時，在37℃下培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液中糞腸球菌LD 33的活菌數(shù)可以達到6.37×109mL-1，為益生菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]MORENO M F,SARANTINOPOULOS P,TSAKALIDOU E,et al.The role and application of Enterococci in food and health[J].International journal of food microbiology，2006，106：1-24.

[2]JIAO Y H,ZHANG L W,LIU F.Screening of lactic acid bacteria strains with respiration ability in the present of heme[J].Advanced Materials Research.Trans Tech Publications，Switzerland，2013，726-731：448-451.

[3]李艾黎，代敏，霍貴成.利用乳清培養(yǎng)基生產(chǎn)乳品發(fā)酵劑的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（4）：34-36.

[4]付良，劉飛，霍貴成.一株能夠利用血紅素進行有氧呼吸的乳酸乳球菌[J].微生物學(xué)報，2008，48（9）：1256-1269.

[5]馮慧杰，沐萬孟，張濤，等.乳酸乳球菌的高密度發(fā)酵研究[J].食品工業(yè)科技，2014，14：197-201.

[6]李艾黎，杜鵬，霍貴成.酵母粉濃度對酸奶菌株發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的影響[J].食品工業(yè)科技，2009，30（4）：166-168，170.

[7]付龍云.乳酸菌抗氧脅迫及有氧生長的研究[D].山東大學(xué),2013.

[8]PEDERSEN M B,GAUDU P,LECHARDEUR D,et al.Aerobic respiration metabolism in lactic acid bacteria and uses in biotechnology [J].Annual review of food science and technology,2012,3:37-58.

[9]KOEBMANN B,BLANK L M,SOLEM C,et al.Increased biomass yield of Lactococcus lactis during energetically limited growth and respiratory conditions[J].Biotechnology and applied biochemistry, 2008,50(1):25-33.

[10]LECHARDEUR D,CESSELIN B,FERNANDEZ A,et al.Using Heme as an Energy Boost for Lactic Acid Bacteria[J].Current opinion in biotechnology,2011,22(2):143-149.

Study of high density culture of Enterococcus faecalis LD 33 undergoing aerobic respiration

JIAO Yue-hua1,2,ZHANG Lan-wei1,LIU Fei3,ZHANG Shuang3
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China;2.Center of Drug Safety Evaluation,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.Food College, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to prepare highly concentrated Enterococcus faecalis LD33 cell culture,at first optimization of fermentation conditions was carried out,then single factor test and orthogonal test was applied to find the optimal high density proliferation medium of Enterococcus faecalis LD33.Results showed that the optimal medium for proliferation of Enterococcus faecalis LD33 cells was composed of60 g/L whey,30 g/L glucose,20 g/L peptone and 10 g/L yeast powder.And when the inoculation amount was 1%,the initial pH was6.4 and the rotational speed of shaking incubator was220 r/min,the number of viable bacteria cell of Enterococcus faecalis LD33 in the fermentation broth could reach 6.37× 109CFU/mL after cultivated at37°C for 24 h.

Enterococcus faecalis;high density culture;aerobic respiration

Q 93-335

A

1001-2230（2016）05-0012-03

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金（31401512），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12541768）。

焦月華（1981－），女，助理研究員，研究方向為食品微生物。

張?zhí)m威