呂娜，沈連剛，李廣志，王鈞篪，斯建勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎(chǔ)研究·

康復(fù)新液化學(xué)成分研究△

呂娜，沈連剛，李廣志，王鈞篪，斯建勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究康復(fù)新液的化學(xué)成分。方法：采用硅膠、Sephadex LH-20柱色譜及半制備液相色譜分離，MS、NMR等波譜學(xué)技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果：共得到并鑒定了13個(gè)化合物，分別為尿嘧啶(1)、次黃嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原兒茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、異亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、纈氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)。結(jié)論：化合物3、4為首次從美洲大蠊提取物中分離得到。

美洲大蠊；康復(fù)新液；核苷；氨基酸；環(huán)肽

美洲大蠊，俗稱蟑螂，偷油婆等，是有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，見于除兩極之外的世界各地。雖為世界性衛(wèi)生害蟲，但在我國西南民間有將其外敷治療傷口的習(xí)俗，據(jù)此大理學(xué)院的李樹楠教授開發(fā)研制出對各種外傷、潰瘍、瘺管、褥瘡的創(chuàng)面有良好效果的美洲大蠊單方制劑——“康復(fù)新液”，臨床應(yīng)用廣泛，不良反應(yīng)小。但因其藥效成分尚不明確，對于康復(fù)新液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化、制劑本身的推廣應(yīng)用和市場國際化都形成了較多的阻礙。為此本實(shí)驗(yàn)對康復(fù)新液的化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，得到了13個(gè)化合物，分別是尿嘧啶(1)、次黃嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原兒茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、異亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、纈氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)；其中化合物3、4為首次從康復(fù)新液中分離得到。

1 儀器與試劑

2435型分析液相色譜儀系統(tǒng)(美國WATERS公司)；梅特勒電子天平MS105DU(瑞士METTLER TOLEDO公司)；2535型半制備液相色譜儀系統(tǒng)(美國WATERS公司)；AVANCE Ⅲ 600MHz核磁共振儀(德國BRUKER公司)；LTQ-Obitrap XL液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermofisher)；四孔電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；JR-360D超聲清洗器(北京精銳澤祥實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；薄層色譜硅膠板HSGF254(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所)。

康復(fù)新液(四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán))；次黃嘌呤對照品(批號：140661-200903)、肌苷對照品(批號：140669-201305)、尿嘧啶對照品(批號：100469-201302)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其余試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的分離

將康復(fù)新液濃縮液329.4 g用適量水混懸后，用三氯甲烷萃取，合并萃取液減壓濃縮得三氯甲烷溶性部位和水部位浸膏。將三氯甲烷溶性部位浸膏經(jīng)甲醇溶解后與等量的硅膠(300～400目)拌勻裝柱，依次用三氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶100，V/V)梯度洗脫，經(jīng)TLC分析后合并得到10個(gè)主流分(Fr.A-Fr.J)。Fr.A，F(xiàn)r.C，F(xiàn)r.F，F(xiàn)r.G，F(xiàn)r.I，F(xiàn)r.J各有不溶物析出，過濾后，將沉淀反復(fù)重結(jié)晶，經(jīng)Sephadex LH20(甲醇-水)、制備型薄層硅膠板分離純化，從Fr.A中得到白色晶體1(14.7 mg)，從Fr.C中得到淺黃色晶體2(106.8mg)，從Fr.F中得到白色粉末7和8(7.3 mg)，從Fr.G制得白色粉末10(58.7 mg)和11(213.7 mg)，從Fr.I中得到白色粉末12(250.9 mg)，從Fr.J獲得黃色粉末13(1.6 mg)。

其次，F(xiàn)r.C、Fr.D、Fr.E經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯)、制備型HPLC(甲醇-水)等色譜技術(shù)分離純化，又從Fr.C中得到白色針晶3(4.6 mg)，從Fr.D中得到褐色粉末4(14.3 mg)，白色晶體5(37.7 mg)，從Fr.E中得到淺黃色油狀物6(113.0 mg)，白色粉末9(24.6 mg)。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色晶體，用HPLC分析液相測得tR=6.698，與尿嘧啶對照品保留時(shí)間一致(tR=6.111)；與對照品混合點(diǎn)樣，經(jīng)TLC分析后，確定該化合物為尿嘧啶。

化合物2：淺黃色晶體，用HPLC分析液相測得tR=9.635，與次黃嘌呤對照品保留時(shí)間一致(tR=9.883)，與次黃嘌呤對照品混合點(diǎn)樣，經(jīng)TLC分析，確定該化合物為次黃嘌呤。

化合物3：白色針晶，環(huán)肽反應(yīng)呈陽性，1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：9.29(1H，s，OH)，8.08(1H，s，NH)，7.84(1H，s，NH)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-7′)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′，H-6′)，3.96(1H，d，J=3.0 Hz，Ha-4)，3.29(1H，s，J=3.0 Hz，Hb-4)，2.97(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)，2.74(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：167.3(C-1)，165.7(C-3)，156.3(C-5′)，131.0(C-3′，C-7′)，125.7(C-2′)，114.9(C-4′，C-6′)，55.7(C-2)，43.6(C-4)，38.2(C-1′)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[1]，故鑒定該化合物為cyclo-(Tyr-Gly)，為首次分離得到。

化合物4：褐色粉末，1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH：7.40(1H，s，H-6)，7.39(1H，s，H-2)，6.78(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC：170.3(C-7)，151.5(C-4)，146.1(C-3)，123.9(C-6)，123.3(C-1)，117.7(C-2)，115.8(C-5)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[2]，故鑒定該化合物為原兒茶酸，為首次分離得到。

化合物5：白色晶體，用HPLC分析液相測得tR=19.503，與肌苷對照品保留時(shí)間一致(tR=19.884)，與肌苷對照品混合點(diǎn)樣，經(jīng)TLC分析，確定該化合物為肌苷。

化合物6：淺黃色油狀物，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.68(1H，m，H-2)，3.55(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-1，Hb-1)，3.47(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-3，Hb-3)，13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：72.1(C-2)，62.7(C-1，C-3)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[3]，故鑒定該化合物為丙三醇。

化合物7：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.71(1H，t，H-2)，1.71(1H，m，H-4)，1.66(2H，m，H-3)，1.00(3H，t，H-5)，1.00(3H，t，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：175.5(C-1)，53.4(C-2)，39.8(C-3)，24.1(C-4)，22.0(C-5)，20.8(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為L-亮氨酸。

化合物8：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.60(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.71(2H，m，H-4)，1.25(3H，m，H-5)，1.46(3H，m，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.1(C-1)，59.5(C-2)，35.8(C-3)，24.1(C-4)，11.1(C-5)，14.5(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為異亮氨酸。

化合物9：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，ESI-MS：m/z166.053 1 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：7.50(2H，t，H-6，H-8)，7.45(1H，t，H-7)，7.40(2H，d，J=12.0 Hz，H-5，H-9)，4.06(1H，m，H-2)，3.36(1H，dd，J=6.0，18.0 Hz，Ha-3)，3.19(1H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Hb-3)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.0(C-1)，135.3(C-4)，129.5(C-6，C-8)，129.2(C-5，C-9)，127.8(C-7)，56.2(C-2)，36.5(C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[5]，故鑒定該化合物為苯丙氨酸。

化合物10：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：7.17(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，3.92(1H，q，H-2)，3.18(1H，dd，J=15 Hz，5.4 Hz，Ha-3)，3.03(1H，dd，J=15 Hz，7.8 Hz，Hb-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：174.2(C-1)，154.8(C-4′)，130.7(C-2′，C-6′)，126.8(C-1′)，115.8(C-3′，C-7′)，56.0(C-2)，35.8(C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為酪氨酸。

化合物11：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.59(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.02(3H，d，J=7.2 Hz，H-4)，0.97(3H，d，J=7.2 Hz，H-5)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.5(C-1)，60.3(C-2)，29.0(C-3)，17.9(C-4)，16.6(C-5)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為纈氨酸。

化合物12：白色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，ESI-MS：m/z90.054 7 [M+H]+；1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.69(1H，dd，J=7.2，14.4 Hz，H-2)，1.39(3H，d，J=7.2 Hz，H-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.8(C-1)，50.7(C-2)，16.2(C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為丙氨酸。

化合物13：黃色粉末，茚三酮反應(yīng)呈陽性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.45(2H，s，H-2)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：172.2(C-1)，41.4(C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定該化合物為甘氨酸。

3 結(jié)果與討論

從結(jié)果來看，美洲大蠊體內(nèi)富含核苷、氨基酸類物質(zhì)，這與昆蟲藥本身的成分特點(diǎn)一致；其次本實(shí)驗(yàn)分得一個(gè)肽類物質(zhì)，之前也有學(xué)者從美洲大蠊提取物中得到幾種環(huán)肽類成分[6]，證實(shí)這類成分也是美洲大蠊的主要成分之一。有報(bào)道稱，在用美洲大蠊提取物的不同組分對造模動(dòng)物的創(chuàng)面進(jìn)行處理后，療效最好的組分經(jīng)分析富集為小分子肽[7]；創(chuàng)面愈合是多種藥理活性作用的結(jié)果，如抗菌、抗炎、促進(jìn)組織生長、提高免疫力等。目前已有大量研究表明藥用植物和海洋天然產(chǎn)物中得到的不少小分子肽具有很強(qiáng)的生物活性[8-9]，環(huán)脂肽類成分已經(jīng)開發(fā)得到多種抗菌素[10]，由此可以推斷美洲大蠊體內(nèi)的活性成分很可能也是肽類成分。因此筆者認(rèn)為，從美洲大蠊體內(nèi)獲得更多的肽類成分并進(jìn)行活性篩選以及機(jī)制探究,將是未來此類藥材研究的趨勢和熱點(diǎn)之一，相信美洲大蠊作為最古老的中藥之一將得到更有效的開發(fā)利用。

[1] 李曉君.五種共生菌化學(xué)成分與生物活性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[2] 袁紅娥，周興棟，孟令杰，等.鴨跖草的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2013，38(19)：3304-3308.

[3] 卜璟.赤芍降血糖有效部位化學(xué)成分研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2013.

[4] 中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所.化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫[DB/OL].[2016-08-10].http：//www.organchem.csdb.cn.[1978-2017]

[5] 于淼.吉林產(chǎn)瑪咖地上部分化學(xué)成分及生物活性的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2013

[6] 李旸，王芳，張普照，等.美洲大蠊化學(xué)成分研究[J].中藥材，2015，38(10)：2038-2041.

[7] 吳紅梅.上市品種“康復(fù)新液”的藥學(xué)再評價(jià)[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[8] 張曉琦，胡恬恬，葉文才，等.藥用植物活性肽類研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2005(3)：72-78.

[9] 白威，田敏卿，馬亞平，等.海洋天然產(chǎn)物中活性肽類成分研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，11(4)：346-349.

[10]劉伯寧，石磊，蔣沁.環(huán)脂肽類抗生素研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志，2007，32(9)：520-524.

StudiesonChemicalComponentsofKangfuxinLiquid

LYUNa，ShenLiangang，LiGuangzhi，WangJunchi，SiJianyong*

(ChineseAcademyofMedicinalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，Beijing100193,China)

Objective：To study the chemical constituents of Kangfuxin Liquid.Methods：The chemical constituents were isolated and purified on silica gel column chromatography，Sephadex LH20 and semi-preparing liquid chromatography，and identified by MS and NMR.Results：Thirteen compounds were obtained and identified as following：uracil(1)，hypoxanthine(2)，cyclo-(Tyr-Gly)(3)，protocatechuic acid(4)，inosine(5)，glycerol(6)，leucine(7)，isoleucine(8)，phenylalanine(9)，tyrosine(10)，valine(11)，alanine(12)，glycine(13).Conclusion：Compounds3and4are isolated fromPeriplanetaamericanafor the first time.

Periplanetaamericana；Kangfuxin Liquid；nucleosides；amino acids；cyclic peptide

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

] 斯建勇，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)；Tel：(010)57833299，E-mail：jysi@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.003

2016-10-10)

*[