龐倩 張文文 王康 吉挺

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

蜜蜂基因功能驗(yàn)證技術(shù)研究進(jìn)展

龐倩 張文文 王康 吉挺

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

蜜蜂是研究社會(huì)性行為、生態(tài)學(xué)以及神經(jīng)生物學(xué)的模式動(dòng)物，開展相關(guān)功能基因研究具有重要的意義。然而鑒于蜜蜂的社會(huì)性及清潔行為等特征，其有關(guān)功能基因驗(yàn)證的研究進(jìn)展緩慢。本文對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、RNA干擾技術(shù)及CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)在蜜蜂功能基因驗(yàn)證方面的研究成果進(jìn)行綜述，并對(duì)蜜蜂功能基因研究的前景進(jìn)行展望，以期為蜜蜂相關(guān)研究提供依據(jù)。

蜜蜂；基因功能；驗(yàn)證技術(shù)

蜜蜂作為重要的經(jīng)濟(jì)傳粉昆蟲，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用，具有巨大的生態(tài)價(jià)值。蜜蜂以群體為單位的社會(huì)性行為，嚴(yán)格的等級(jí)制度以及學(xué)習(xí)記憶等特性，使其成為社會(huì)行為學(xué)、生態(tài)學(xué)以及神經(jīng)生物學(xué)研究的模式動(dòng)物[1]，具有重要的研究意義。蜜蜂作為模式動(dòng)物，其研究?jī)?yōu)勢(shì)主要有：（1）典型的社會(huì)性昆蟲，具有精確而復(fù)雜的社會(huì)性結(jié)構(gòu)；（2）生長(zhǎng)周期短；（3）蜂王繁殖力高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，意大利蜜蜂的蜂王一天最多可產(chǎn)2000粒卵；（4）擁有完整的基因組信息。但是，蜜蜂的社會(huì)性使其在模式動(dòng)物方面的研究受到一定的限制[2]，蜜蜂功能基因的研究也相對(duì)比較落后。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，基因組的研究已經(jīng)成為遺傳育種熱點(diǎn)研究之一[3]，加強(qiáng)并完善蜜蜂基因功能的研究，進(jìn)一步闡明其中的分子機(jī)理，有助于更好的闡釋蜜蜂的行為特征，從而為蜜蜂的遺傳改良、抗病育種提供有利的基因。

隨著意大利蜜蜂全基因組測(cè)序的完成，大量未知功能的基因等待挖掘，而驗(yàn)證基因組中這些基因的功能、基因的表達(dá)調(diào)控以及基因間的相互關(guān)系等是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。生物信息學(xué)雖然能夠預(yù)測(cè)基因的功能，但是具有局限性，而且基因功能的研究最終仍需要實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。蜜蜂雖具有悠久的飼養(yǎng)歷史，但有關(guān)其功能基因驗(yàn)證的研究比較少。現(xiàn)在，功能基因研究的技術(shù)主要有轉(zhuǎn)基因技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、基因編輯技術(shù)等。本文就功能基因的驗(yàn)證技術(shù)做一綜述，旨在為蜜蜂基因功能的研究提供思路。

1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因最初應(yīng)用于基因功能的研究，即把外源基因?qū)胧荏w基因組內(nèi)，通過(guò)觀察生物體表現(xiàn)出來(lái)的性狀，達(dá)到揭示基因功能的目的。有關(guān)蜜蜂轉(zhuǎn)基因的研究早在30幾年前就已經(jīng)開始，但并沒(méi)有大的突破[4]。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有顯微注射法、精子介導(dǎo)法、電穿孔法、轉(zhuǎn)座子載體法、病毒轉(zhuǎn)染法等。

1.1 精子介導(dǎo)法

用精子作為轉(zhuǎn)移外源DNA的載體最早由Brackett等[5]提出。1991年，Atkinson等[6]首次證實(shí)了蜜蜂的精子能夠吸收外源DNA。2000年，Robinson等[7]證實(shí)了蜜蜂精子能夠?qū)⑼庠碊NA攜帶進(jìn)入卵子，數(shù)月之后，仍能在受體蜜蜂中檢測(cè)到外源DNA，并且可以穩(wěn)定遺傳給下一代，證實(shí)了精子介導(dǎo)法在蜜蜂上的可行性。郭冬生等[8]通過(guò)精子介導(dǎo)法以及人工授精技術(shù)將線性化的pGFP-2質(zhì)粒導(dǎo)入處女王，成功獲得了帶有綠色熒光的后代，得到克隆轉(zhuǎn)基因蜜蜂。該研究為利用精子介導(dǎo)法使外源基因在蜜蜂體內(nèi)表達(dá)提供了理論支持，同時(shí)，為蜜蜂基因功能的驗(yàn)證做出了探索。

利用精子能夠吸收外源DNA的能力，將其作為載體，然后結(jié)合人工授精技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入到胚胎中，這一方法具有簡(jiǎn)單、易操作、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，但是，外源DNA在蜂王的受精囊內(nèi)有被降解的風(fēng)險(xiǎn)，所以，為降低外源DNA的降解率，提高成功率，在人工授精之后應(yīng)盡量縮短蜂王開始產(chǎn)卵的時(shí)間。

1.2 電穿孔法

活體電穿孔法是指通過(guò)電場(chǎng)作用，將外源基因?qū)肽繕?biāo)組織或器官。其原理是細(xì)胞膜表面在直流電場(chǎng)作用的瞬間會(huì)產(chǎn)生疏水或親水的微小通道，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，在此期間生物大分子可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞，而后通道自行恢復(fù)[9]。

2004年，Kunieda and Kubo[10]建立了蜜蜂電穿孔法轉(zhuǎn)基因體系，RT-PCR和免疫印跡分析證明導(dǎo)入的外源基因在蜜蜂大腦中獲得表達(dá)。郭冬生等[11]通過(guò)電穿孔法成功將外源基因EGFP導(dǎo)入中華蜜蜂的卵內(nèi)，并且檢測(cè)到EGFP基因的表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到1.05%。該兩項(xiàng)研究為利用電穿孔法研究基因功能做出了有益探索，并為蜜蜂功能基因的研究提供了技術(shù)參考，奠定了理論基礎(chǔ)。

近年來(lái)活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道逐漸增多，在基因治療方面的優(yōu)勢(shì)也日漸明顯，是一種有效的活體基因?qū)敕椒╗12]。首先，電穿孔法可在多種組織器官上應(yīng)用，且效率較高[13]。其次，對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒(méi)有限制[14]。此外活體電穿孔法操作簡(jiǎn)單快速，電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘，并且DNA片段不需要特殊的純化操作。但是電穿孔法也存在一些缺點(diǎn)，如：電壓過(guò)低，則外源基因無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞；電壓過(guò)高會(huì)增加對(duì)機(jī)體的損傷，甚至造成外源基因的無(wú)法表達(dá)。另外，在操作過(guò)程中還可能對(duì)活體造成污染。由于蜜蜂的清潔行為，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)處理的卵或者幼蟲的飼養(yǎng)也是需要解決的問(wèn)題，所以電穿孔技術(shù)還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。

分析發(fā)現(xiàn)，近幾年利用精子介導(dǎo)法或者電穿孔法做蜜蜂轉(zhuǎn)基因的相關(guān)研究較少，究其原因，除了技術(shù)本身的缺陷，主要是因?yàn)槊鄯涔し涞那鍧嵭袨?，哺育蜂清潔巢房時(shí)，會(huì)清理掉有異味或者受損的等不正常的卵和幼蟲。而對(duì)蜜蜂的幼蟲或者卵進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作時(shí)肯定會(huì)對(duì)幼蟲或者卵造成損傷或者使幼蟲或者卵攜帶異味，當(dāng)把處理過(guò)的幼蟲或者卵放回蜂群哺育時(shí)，這些幼蟲或者卵就會(huì)被清理掉，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。而蜜蜂是以群體為單位的社會(huì)性昆蟲，若由人工孵育幼蟲或者卵，則失去了實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服性和意義。其次是雌性蜜蜂具有級(jí)型分化現(xiàn)象，如何使經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作的卵或者幼蟲發(fā)育為蜂王，并且將遺傳信息高效穩(wěn)定的遺傳給后代也是阻礙蜜蜂轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的另一主要原因。

近年來(lái)，隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，研究人員將對(duì)蜜蜂轉(zhuǎn)基因的研究轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)座子piggyBac的利用上。2014年，Schulte等[15]構(gòu)建piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體，然后給0～1.5 h的卵注射轉(zhuǎn)基因載體和轉(zhuǎn)座酶mRNA，注射后的卵于34℃孵化72 h后移入有王漿的王臺(tái)，10天后將王臺(tái)移入王籠，羽化后的處女王由哺育蜂哺育，在飛行房中交尾。該實(shí)驗(yàn)表明piggyBac載體能夠有效的將表達(dá)組件導(dǎo)入蜂王基因組，并且可以穩(wěn)定高效的在子代中表達(dá)。這一研究結(jié)果為蜜蜂基因功能的研究提供了參考，并為piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體在基因功能的相關(guān)研究中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。

2 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾是指利用外源或內(nèi)源的雙鏈RNA特異性抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，它通過(guò)導(dǎo)入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA的降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的[16,17]。RNA干擾能特異性地引起基因表達(dá)沉默，是生物體抵御病毒和外源基因的入侵而特異性地調(diào)節(jié)或干擾基因表達(dá)的一種“免疫”應(yīng)答機(jī)制。昆蟲上RNA干擾的方法主要有注射、飼喂、浸泡、病毒轉(zhuǎn)染等。

RNA干擾在昆蟲上的應(yīng)用最早是應(yīng)用在黑腹果蠅上[18]。有關(guān)蜜蜂RNA干擾報(bào)道是在1988年，Milne等[19]對(duì)意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）的早期胚胎進(jìn)行了顯微注射的初步探索，他們將產(chǎn)下的卵置于帶有雙面膠膠條的玻片上，在卵的后端注射石蠟油，其中有21%的卵成功孵化。邵瑞宜等[20]利用顯微注射技術(shù)同樣注射石蠟油到中華蜜蜂1日齡卵內(nèi)，其孵化率達(dá)到35.13%。Beye等[21]將dsRNA注射到意大利蜜蜂前囊胚期胚胎的前端，結(jié)果顯示注射的dsRNA片段成功干擾整個(gè)胚胎期目的基因的蛋白表達(dá)，并導(dǎo)致表型缺陷，而注射無(wú)意義密碼子的dsRNA沒(méi)有顯示異?，F(xiàn)象，這是蜜蜂上關(guān)于靶向干擾基因功能的第一篇報(bào)道。Amdam等[22]給蜜蜂0～6 h的卵注射dsRNA，由注射dsRNA的卵孵化而來(lái)的蜜蜂，有15%的蜜蜂其卵黃蛋白原的mRNA水平明顯降低。他們又將dsRNA注射到新出房蜜蜂的腹內(nèi)，其中有96%的蜜蜂的表型發(fā)生突變。石元元等[23]給3日齡的意大利蜜蜂的幼蟲注射DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3（Dnmt3）siRNA，并分別注射Ringer、uth siRNA作為對(duì)照，在注射后的24 h，48 h，72 h分別測(cè)定Dnmt3酶活性、mRNA的表達(dá)量以及相關(guān)基因的甲基化水平，并在蜜蜂羽化后測(cè)定其形態(tài)指標(biāo)，結(jié)果注射Dnmt3 siRNA的蜜蜂幼蟲其初生重、體長(zhǎng)以及第3背板長(zhǎng)均顯著提高，進(jìn)而說(shuō)明了Dnmt3影響蜜蜂幼蟲的發(fā)育。Li-Byarlay等[24]通過(guò)在1日齡蜜蜂的腹部注射siRNA抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3（dnmt3）的表達(dá)，證明了蜜蜂的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3影響基因的可變剪接。Costa等[25]利用RNA干擾技術(shù)抑制骨化激素基因，導(dǎo)致成年蜜蜂表皮完整性的形成以及表皮的黑化和硬化受到影響，從而證明了骨化激素在成年蜜蜂表皮的形成和黑化過(guò)程中具有重要作用。

RNA干擾具有簡(jiǎn)單方便、實(shí)驗(yàn)周期短、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用，成為驗(yàn)證基因功能強(qiáng)有力的工具。而實(shí)現(xiàn)昆蟲高效的RNA干擾，其關(guān)鍵是選擇合適的導(dǎo)入dsRNA的方法。如注射法，蜜蜂的卵容易獲得，而且卵較大，卵膜較薄，易于注射針穿過(guò)注射，方便操作。但是注射不可避免的會(huì)對(duì)昆蟲造成損傷，如果將注射過(guò)的蜜蜂的卵或者幼蟲放到蜂群中哺育，這些經(jīng)過(guò)注射的卵或者幼蟲會(huì)因?yàn)閾p傷而被清理掉，給實(shí)驗(yàn)造成困難。另外，注射效率以及卵的存活率受到操作的熟練程度、注射時(shí)間、注射劑量、注射壓力、環(huán)境等方面的影響[20,26,27]，因此，利用顯微注射技術(shù)進(jìn)行RNA干擾時(shí)，為提高干擾效率，需要優(yōu)化各種相關(guān)條件。再如飼喂法，飼喂法具有操作簡(jiǎn)單，不會(huì)對(duì)昆蟲造成傷害等優(yōu)點(diǎn)，但研究表明，不同的基因其通過(guò)口腔傳輸?shù)腞NA干擾的敏感性不同[28]，是否所有基因都能通過(guò)飼喂法達(dá)到RNA干擾的目的還有待研究。有研究表明，dsRNA 5’端的基團(tuán)對(duì)干擾也會(huì)產(chǎn)生影響[29]。

3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)又稱基因打靶技術(shù)，是對(duì)生物體遺傳信息進(jìn)行定向修飾的一種實(shí)驗(yàn)手段。通過(guò)編輯后的遺傳信息在生物體中的遺傳表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的研究與分析。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系統(tǒng)是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成的一項(xiàng)新興的RNA靶向的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[30]。2013年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被英國(guó)《自然》雜志子刊評(píng)為2013年年度方法，美國(guó)科學(xué)雜志將該技術(shù)評(píng)為2013年年度十大突破之一[31]，雖然該技術(shù)出現(xiàn)較晚，但具有巨大廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)雖然是一種新工具，但已經(jīng)成功應(yīng)用于多種生物體，如大腸桿菌[32]、釀酒酵母[33]、果蠅[34]、斑馬魚[35]、小鼠[36,37]、大鼠[38]、小麥[39]、水稻[39,40]以及人類[41]等。尉偉[42]運(yùn)用TALEN及CRISPR-Cas9技術(shù)在蜂卵上進(jìn)行了基因打靶實(shí)驗(yàn)，尉偉將TALEN mRNA及Cas9/gRNA分別注射到5～6 h的蜂卵中，人工培養(yǎng)48～60 h后進(jìn)行酶切檢測(cè)，結(jié)果兩種技術(shù)均檢測(cè)到了突變。Kohno等[43]給3 h的蜜蜂的受精卵注射sgRNA和Cas9 mRNA，運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了突變體。由此表明，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在蜜蜂中也可有效發(fā)揮基因敲除功能，并且可為后期蜜蜂功能基因的驗(yàn)證及突變體的獲得提供有利工具。

與其他基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9只需要改變一段RNA序列即可識(shí)別多個(gè)不同位點(diǎn)，省去了重新合成不同蛋白的步驟，具有成本低、效率高，可同時(shí)修飾多個(gè)堿基，適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)不僅可以直接在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行多個(gè)基因的編輯，而且可以定向修飾生物活體的遺傳信息，同時(shí)還克服了蜜蜂胚胎不可逆的問(wèn)題，主要缺點(diǎn)是有可能會(huì)出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象[44]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為一項(xiàng)新興技術(shù)，從一出現(xiàn)，就受到廣大科研工作者的極大關(guān)注，雖處于起步階段，但已得到廣泛應(yīng)用，并顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，另外，有研究表明，利用CRISPR-Cas技術(shù)實(shí)現(xiàn)的基因修飾可傳遞到下一代[45]。隨著研究的深入和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)化，相信CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣泛，也必定會(huì)成為基因功能分析的重要工具。

4 展望

蜜蜂作為一種重要的經(jīng)濟(jì)傳粉昆蟲和行為學(xué)等研究的模式動(dòng)物，其基因的功能等待挖掘與研究。蜜蜂的社會(huì)性、清潔行為以及雌性蜜蜂的級(jí)型分化現(xiàn)象等都賦予了蜜蜂一定的特殊性，探討基因的功能及其聯(lián)系，有助于我們更加全面的了解蜜蜂的生物學(xué)特性，并為其他生物的研究提供借鑒。在分子生物學(xué)技術(shù)不斷深入和發(fā)展的同時(shí)，再結(jié)合蜜蜂的特殊性將其加以優(yōu)化完善，相信在不斷的研究探索下，蜜蜂功能基因的研究會(huì)取得重大進(jìn)展與突破。其中，RNA干擾的方法較多，在蜜蜂的任一發(fā)育階段均可進(jìn)行，可操作性優(yōu)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，且應(yīng)用廣泛，相關(guān)研究也比較多，如果再結(jié)合成熟的人工孵化技術(shù)，RNA干擾更有可能成為未來(lái)蜜蜂功能基因研究的主要技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Research advance on the function gene verification technologies of honeybee

Pang Qian,Zhang Wenwen,Wang Kang,Ji Ting
(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009)

Honeybee is important research object and model animal of social behavior and ecology,its functional gene research is of great significance.However,the problem of honeybee functional gene research is enhanced by the sociality phenomenon and the comb cleaning behavior of bees.The honeybee functional gene research is relatively undeveloped.In this review,in order to provide a reference basis for the research of the bee functional genes,we described the research results of transgenic technology,RNAi and CRISPR/Cas9.Meanwhile,we made the prospect of functional gene research in honeybees.

honeybee;gene function;verification technologies

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372382）；國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（CARS-45-SYZ6）

龐倩（1994-），女，碩士研究生，E-mail：18852717155@163.com

吉挺（1974-），E-mail：tji@yzu.edu.cn