段雅晨 綜述，陳小軍，吳小華 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

宮頸癌是女性中第二常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率從2000年的4.0/10萬(wàn)到2011年的9.5/10萬(wàn)呈成倍上升趨勢(shì)［1］，超過(guò)98%的宮頸癌［2］組織中能分離出人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，目前有足夠的證據(jù)證明高危HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的主要原因［2］。此外，HPV的感染與陰道、外陰、食管、頭頸部、肛門(mén)和陰莖的腫瘤也密切相關(guān)［3］。鑒于其在多種腫瘤中的致病作用，對(duì)該病毒的預(yù)防及治療的相關(guān)研究也在持續(xù)進(jìn)行中。2006年人類第一個(gè)預(yù)防腫瘤的HPV疫苗問(wèn)世［4］，ACGO在今年子宮頸癌的篩查和預(yù)防實(shí)踐指南中更新了HPV的起始篩查年齡，從30歲降低到了25歲［5］。作為宮頸癌一、二級(jí)預(yù)防的有效手段，人群中HPV的篩查及其疫苗的廣泛接種，已成為人類抗擊腫瘤的成功典范。

基于HPV-DNA在宮頸癌患者中的高檢出率，我們猜測(cè)這些患者外周循環(huán)血中應(yīng)該也存在HPV的痕跡，并且，同樣是病毒致病的鼻咽癌，監(jiān)測(cè)血液EB病毒拷貝數(shù)已作為常規(guī)臨床指標(biāo)。因此，我們進(jìn)一步猜想它可否作為監(jiān)測(cè)宮頸癌患者腫瘤進(jìn)展的預(yù)后指標(biāo)；另一方面，由于HPV預(yù)防性疫苗已取得了顯著進(jìn)展，那么該病毒是否也可成為一個(gè)治療靶點(diǎn)？針對(duì)于HPV的免疫治療是否可廣泛應(yīng)用于臨床？

1 宮頸癌發(fā)病機(jī)制與外周血中HPV存在的特異性

高危HPV編碼的E6和E7蛋白是HPV導(dǎo)致宮頸癌的重要癌蛋白，E2開(kāi)放讀碼框具有負(fù)性調(diào)節(jié)E6和E7癌蛋白表達(dá)的功能，當(dāng)高危HPV-DNA整合入宿主DNA時(shí)，HPV雙鏈DNA通常在E2發(fā)生斷裂，導(dǎo)致其對(duì)E6和E7癌蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)功能喪失，加快細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［6］。

HPV是黏膜侵襲性病毒，可潛伏于宮頸黏膜基底細(xì)胞中，早期較難入血。從高危HPV感染到宮頸浸潤(rùn)癌的發(fā)生通常認(rèn)為需要10年以上的時(shí)間，期間存在不同程度的宮頸癌前病變，其中，在大多數(shù)宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級(jí)及部分Ⅱ級(jí)組織中，HPV主要以游離病毒的形式存在，大部分患者可以不經(jīng)治療而自然消退，而在CIN Ⅲ級(jí)或?qū)m頸浸潤(rùn)癌組織中，HPV-DNA通常已整合入宿主DNA，此時(shí)病變無(wú)法逆轉(zhuǎn)，表明高危HPV-DNA整合入宿主DNA是宮頸癌發(fā)生的晚期事件，同時(shí)也是不可逆的關(guān)鍵步驟［7］。

對(duì)于HPV的嵌入位點(diǎn)，Hu等［8］通過(guò)大樣本的全基因組測(cè)序及高通量病毒嵌入檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，HPV病毒的嵌入呈現(xiàn)多樣性，除了之前已被證實(shí)的6個(gè)位點(diǎn)POU5F1B(9.7%)、FHIT(8.7%)、KLF12(7.8%)、KLF5(6.8%)、LRP1B(5.8%)和LEPREL1(4.9%)外，還發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的嵌入熱點(diǎn)HMGA2(7.8%)、DLG2 (4.9%)和SEMA3D(4.9%)，并證實(shí)HPV病毒可能通過(guò)MHs介導(dǎo)的DNA修復(fù)通路，如FoSTeS/MMBIR方式插入人類染色體。

HPV較難入血與易嵌入宿主DNA的生物學(xué)特性是它在外周血中檢出困難的生物學(xué)原因。相信隨著檢測(cè)技術(shù)靈敏度的提高，該瓶頸終將被克服，HPV也可作為宮頸癌患者腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)及預(yù)后的指標(biāo)，相關(guān)研究目前已取得了一定進(jìn)展。

2 HPV的血液檢測(cè)現(xiàn)狀

早期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示，宮頸浸潤(rùn)癌患者血液中HPV DNA的檢出范圍為7%～45%［9-11］。周?chē)蠬PV的低檢出率與HPV整合入人體DNA的生物性質(zhì)密不可分。對(duì)于整合入宿主DNA的HPV檢測(cè)一直是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。人們先后研發(fā)了多種整合入宿主DNA的HPV檢測(cè)方法［12-14］。目前較被認(rèn)可的是通過(guò)二代測(cè)序的方式，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中HPV序列進(jìn)行比對(duì)，一般比對(duì)E6或E7片段［14］。首先在聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的基礎(chǔ)之上進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩除發(fā)生錯(cuò)配的產(chǎn)物，接下來(lái)通過(guò)BioBloom Tools［15］進(jìn)行RNA-Seq數(shù)據(jù)讀取，再通過(guò)PathSeq［16］進(jìn)行RNA-Seq中的病原體檢測(cè)。該方法的靈敏度及特異度均相對(duì)較高，在宮頸癌患者中的檢出率為95%［14］。

另外，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RTFQ-PCR)的方法分別檢測(cè)組織中HPV的腫瘤基因E6、E7及E2，通過(guò)其比值來(lái)判斷HPV的嵌入或整合狀態(tài)［17］。通過(guò)該研究方法發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌的早期即可發(fā)生HPV病毒的嵌入，6例CIN Ⅰ級(jí)患者中有5例(83.3%)存在HPV-16的嵌入，在CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)中有10例(90.9%)患者存在HPV-16的嵌入［18］。

連接介導(dǎo)PCR可更加直觀的檢出血清中嵌入的HPV片段［19］，該方法的檢測(cè)位點(diǎn)是HPV整合入宿主DNA后的連接區(qū)域，在16例已知HPV16/18感染及嵌入位點(diǎn)的宮頸癌患者外周循環(huán)血清中使用該檢測(cè)方法［20］，被檢出的片段即為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，通過(guò)該方法可排除外周循環(huán)血中游離HPV對(duì)研究造成的影響，直觀的研究ctDNA與患者預(yù)后之間的關(guān)系。

3 血液中HPV的檢測(cè)與患者預(yù)后

部分研究認(rèn)為，宮頸癌患者血液中HPV的檢測(cè)可作為疾病進(jìn)展的DNA標(biāo)志物［11,20-23］。Widschwendter等［11］對(duì)24例宮頸癌組織和血清中檢出同型別HPV的患者進(jìn)行隨訪，其中有13例患者發(fā)生局部或遠(yuǎn)處的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，4例患者在初始治療中出現(xiàn)疾病的持續(xù)或進(jìn)展。Ho等［22］研究發(fā)現(xiàn)，10例宮頸癌患者中有8例患者血清中可檢測(cè)出HPV DNA，并且在治療3個(gè)月后發(fā)生復(fù)發(fā)，其中有87.5%(7/8)的患者發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Campitelli等［20］檢測(cè)了13例腫瘤大于20 mm的宮頸癌患者，發(fā)現(xiàn)其中有11例的血清中可檢出HPV的ctDNA，通過(guò)對(duì)血清中HPV DNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，患者血清中的ctDNA濃度與腫瘤的動(dòng)態(tài)變化具有相關(guān)性。Pornthanakasem等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在50例宮頸癌組織HPV陽(yáng)性的患者中，有6例血漿中可檢出HPV，其中有3例是ⅣB期或已發(fā)生遠(yuǎn)處的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者血漿中HPV的檢出拷貝數(shù)是未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的3倍。在1年的隨訪過(guò)程中，同期別血漿中檢出HPV的患者其復(fù)發(fā)率較血漿中未檢出該病毒的患者高。在CIN患者血清中，很難檢測(cè)出HPV［22］。以上研究顯示，外周循環(huán)血中HPV的檢出與患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示其ctDNA可作為晚期宮頸癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測(cè)的腫瘤指標(biāo)。

進(jìn)一步將HPV分型與疾病進(jìn)展程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸癌患者FIGO分期的升高，HPV16的病毒載量會(huì)隨之升高，但是HPV18感染的人群中無(wú)此現(xiàn)象［22,24-25］。也有研究表明，血漿中HPV16-DNA與FIGO分期(P1/4 0.733)、腫瘤分級(jí)(P1/4 0.879)和病理類型(P1/4 0.733)之間沒(méi)有相關(guān)性［23］。研究結(jié)果的不一致性可能在于諸多研究不能成功區(qū)分外周循環(huán)血中游離的HPV和嵌入的HPV。

4 血液中HPV檢出的治療意義

如前文所述，HPV是宮頸癌的主要致病因素，E6、E7為其主要致癌蛋白，能夠通過(guò)多條腫瘤信號(hào)通路的激活導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。外周循環(huán)血中HPV的檢出為宮頸癌的全身化療，特別是HPV的靶向治療及免疫治療提供了更高效的理論基礎(chǔ)。

4.1 HPV的靶向治療

通過(guò)對(duì)HPV相關(guān)分子通路的分析發(fā)現(xiàn)，HPV E6蛋白的表達(dá)可以抑制PDZ、p53的表達(dá)并可靶向作用于幾個(gè)miRNA；同時(shí)也可激活Wet、Notch和Akt通路。E7蛋白也可激活PI3K/Akt信號(hào)通路［26］。這些通路的激活可引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如果可以在E6、E7蛋白水平阻斷其與腫瘤相關(guān)通路之間的相互作用，即可降低HPV的致腫瘤性，從而起到治療的效果。

PI3K/Akt通路是一個(gè)常見(jiàn)的腫瘤生存調(diào)節(jié)通路［27］，E6蛋白可激活該通路［28］。有研究報(bào)道，在拉丁美洲宮頸癌患者中，PIK3CA的突變率為33%［29］；我國(guó)的數(shù)據(jù)顯示，PIK3CA在宮頸癌中的突變率為13.6%［30］。

PAM(PI3K/AKT/mTOR)抑制劑是針對(duì)該通路的靶向制劑，雷帕霉素及依維莫司是針對(duì)乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥患者的mTOR抑制劑，目前在臨床上取得了較好的療效［31］。該類藥物在宮頸癌中尚未進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)。

4.2 HPV的免疫治療

外周血T細(xì)胞會(huì)編碼表達(dá)一種腫瘤靶向的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)及T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，因?yàn)樯掀ば阅[瘤的靶向抗原同時(shí)存在于腫瘤和正常組織中，所以該研究受限于重要組織的靶向非腫瘤毒性作用［32］。這種毒性作用可通過(guò)靶向于健康組織不表達(dá)的抗原來(lái)避免，但是在上皮性腫瘤中，惡性腫瘤獨(dú)有的且大量表達(dá)的抗原極少見(jiàn)［32-33］。HPV的E6/E7腫瘤蛋白是T細(xì)胞靶向治療的理想靶點(diǎn)。它們表達(dá)于HPV+的宮頸癌患者腫瘤細(xì)胞中，并且對(duì)患者生存率具有較大影響；同時(shí)，在健康組織中不表達(dá)［33］。

在晚期及復(fù)發(fā)的腫瘤患者中，腫瘤特異度T細(xì)胞的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移治療(adoptive T-cell Therapy，ACT)是一非常有前景的免疫治療模式。

Stevanovic等［34］報(bào)道了一項(xiàng)在9例轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者中進(jìn)行ACT治療的研究，其中有3例患者表現(xiàn)出腫瘤緩解(2例完全緩解，1例部分緩解)，2例完全緩解的患者治療結(jié)束后的無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)分別為22和15個(gè)月，1例部分緩解的患者PFS為3個(gè)月。針對(duì)這一結(jié)果，Draper等［35］在分子水平上對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了解釋驗(yàn)證，證實(shí)了有E6特異性TCR的T細(xì)胞能夠靶向殺傷HPV16+的腫瘤細(xì)胞。HPV16陽(yáng)性的宮頸癌患者中，血液和腫瘤組織中可分離出HPV16特異性T細(xì)胞的概率分別為30%［36］和35%［37］。

5 展望

雖然有證據(jù)證實(shí)，宮頸癌患者外周血中HPV ctDNA的檢出與患者預(yù)后相關(guān)，但是如何研發(fā)低成本高敏感性的檢測(cè)方法是目前亟待解決的問(wèn)題?？紤]到HPV特殊的生物學(xué)特征，可通過(guò)測(cè)序的方式對(duì)外周循環(huán)血液中的ctDNA進(jìn)行檢測(cè)，為宮頸癌患者的預(yù)后提供精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。根據(jù)宮頸癌HPV的高致病性及相關(guān)通路的研究結(jié)果，可以在以下兩個(gè)方面進(jìn)行宮頸癌靶向藥物的嘗試：可針對(duì)HPV的E6、E7蛋白進(jìn)行靶向藥物的設(shè)計(jì)，特異性殺傷表達(dá)E6、E7的腫瘤細(xì)胞；另外根據(jù)PIK3CA的突變率，可探究PAM靶向抑制劑在宮頸癌患者中的臨床應(yīng)用。HPV在宮頸癌中不僅是主要的致病因素，其血液學(xué)檢測(cè)還與患者預(yù)后息息相關(guān)；同時(shí)也是靶向治療的首選靶點(diǎn)，需要我們通過(guò)更多的研究去證實(shí)。

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