孫曼霽

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

·科海鉤沉·

梭曼啊，梭曼！
——紀念周廷沖院士誕辰100周年

孫曼霽

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

編者按：周廷沖（1917.03-1996.10），生化藥理學(xué)家，曾任軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院原藥理毒理研究所副所長、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所所長，1980年當選中國科學(xué)院學(xué)部委員（院士）。周廷沖教授1941年畢業(yè)于原上海醫(yī)學(xué)院，1947年獲英國牛津大學(xué)博士學(xué)位，1948-1949年先后在美國康乃爾大學(xué)、波士頓麻省理工學(xué)院從事生物化學(xué)研究。中華人民共和國成立后，他和妻子黃翠芬院士懷著滿腔愛國熱情，毅然決定回國為祖國建設(shè)貢獻力量，但受到美國移民局的阻撓和刁難。他們冒著被搜捕的危險，乘坐舊金山開往天津的貨船，漂洋過海，歷時56天回到祖國。謹此在周廷沖院士誕辰100周年之際，本刊特發(fā)此文，以茲紀念。

1949年建國初期，我國軍事醫(yī)學(xué)研究是一片空白，核化生武器及其醫(yī)學(xué)防護一無所有。當時世界大戰(zhàn)和局部戰(zhàn)爭威脅著年輕的共和國。1951年，中央決定組建軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，研究戰(zhàn)時大規(guī)模特種武器傷害的醫(yī)學(xué)防護。1953年，周廷沖教授奉命調(diào)入軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院原藥理毒理研究所，創(chuàng)建藥理系。1955年，周廷沖教授與蘇聯(lián)專家凱林開辦了我國第一個防化醫(yī)學(xué)訓(xùn)練班。學(xué)員們后來都成長為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所及各軍醫(yī)大學(xué)的防化骨干。

神經(jīng)性毒劑是一類強烈的速殺性膽堿酯酶抑制劑，乙酰膽堿酯酶失活導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在突觸間隙大量積聚，持續(xù)地作用于下一級神經(jīng)元或效應(yīng)器，引起膽堿能系統(tǒng)反應(yīng)極度亢進，造成嚴重的神經(jīng)功能紊亂，甚至死亡。神經(jīng)性毒劑是美軍的制式裝備，其中毒機制及防治藥物的研究就成為迫切的任務(wù)。

20世紀50年代末期，周廷沖教授開創(chuàng)了神經(jīng)性毒劑生化藥理學(xué)研究方向。當時，文獻中已經(jīng)報道了丙氟磷和沙林磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶老化的脫烷基現(xiàn)象，磷（膦）酰化乙酰膽堿酯酶的重活化劑（酶的復(fù)活劑）也已發(fā)現(xiàn)。奇怪的是，重活化劑只要有足夠劑量并給得及時，對丙氟磷及沙林抑制的乙酰膽堿酯酶均顯示良好的重活化作用，而對梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶的重活化作用卻怎么也測不來，藥物防治研究遇到了極大的困惑。動物實驗表明，梭曼是神經(jīng)性毒劑中最難防治的一種毒劑，梭曼的防治是化學(xué)戰(zhàn)劑醫(yī)學(xué)防護中國際上公認的尖端課題。藥物合成組千方百計地改構(gòu)重活化劑，藥物過篩組努力地篩選中草藥，但幾年下來，梭曼的重活化劑卻始終未能發(fā)現(xiàn)。梭曼防治向何處去？一時困擾著大家。周廷沖教授決定從梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶不能被重活化的機制來開展研究。那時國內(nèi)外對梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶不能被重活化的原因有多種猜測，如轉(zhuǎn)膦酰基學(xué)說、空間障礙學(xué)說、脫烷基學(xué)說和酶變性學(xué)說等。國外許多實驗室也都為闡明梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化機制而積極地探索著。我們于1961年掌握了同位素示蹤技術(shù)并提純了高比活性乙酰膽堿酯酶之后，也向梭曼沖刺。

我們設(shè)想，如果梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化也是脫烷基反應(yīng)，酶分子上的梭曼膦酰殘基應(yīng)該是甲膦酸，而不是特己基甲膦酸。我們將梭曼與乙酰膽堿酯酶在37℃，pH 7.2的條件下相互作用5 min，94%膦酰殘基顯示以甲膦酸形式存在，只有6%為特己基甲膦酸，大家十分興奮。進而設(shè)想假如分子上確有膦?；霓D(zhuǎn)變，就必然有一個過程存在，那么其堿水解的降解產(chǎn)物中應(yīng)該找到殘基轉(zhuǎn)化過程的痕跡。我們又想到，一切酶反應(yīng)都是溫度依賴性的，降低反應(yīng)溫度使酶反應(yīng)過程變慢是否就能夠找到這一痕跡？果然，當我們將溫度降至20℃時，特己基甲膦酸5 min的相對量達到22%，而0℃時，竟然高達73%。膦酰基的轉(zhuǎn)變在3種溫度條件下的時間進程顯示了良好的時效性。

以上實驗中梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子上膦?；拿撏榛?yīng)是從膦酰殘基的相對百分率判斷推定的，我們推想溫度效應(yīng)也應(yīng)該在膦酰化乙酰膽堿酯酶活性的重活化率上得到反映。氯磷啶是沙林膦酰化乙酰膽堿酯酶活性的有效重活化劑，但實驗證明它在37℃，pH 7.2條件下對梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶完全沒有重活化作用?？墒钱斘覀儗囟冉档椭?℃時，氯磷啶對梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶竟然也顯現(xiàn)出重活化作用，實驗證實了預(yù)先的設(shè)想。進而我們又設(shè)想，如果老化的脫烷基學(xué)說是正確的，那么氯磷啶對任何毒劑的未老化的磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶都應(yīng)該有重活化作用，而對任何毒劑的老化的磷（膦）酰化乙酰膽堿酯酶均應(yīng)無重活化效果，無論這種毒劑是丙氟磷、沙林、梭曼或者其他。實驗完全證實了我們的推斷。

在有機磷（膦）毒劑抑制乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)中，膦?；c乙酰膽堿酯酶活力中心酯解部位中被三聯(lián)體共軛效應(yīng)活化了的絲氨酸的羥基相結(jié)合，其化學(xué)鍵是C-O-P，而膦?；耐檠趸c磷原子間的化學(xué)鍵也是CO-P。因而從方法學(xué)上可以提出這樣的質(zhì)疑，即堿水解處理樣品時，既然可以使前者的C-O-P鍵高效地斷裂，會不會使后者的C-O-P鍵也被斷裂？如果那樣，烷基的脫落就可能是人工操作的假象。首先，我們證明用堿處理梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶時98%的膦?；撀?，說明堿水解對結(jié)合在活力中心的C-O-P鍵是非常有效的。進而我們用不同濃度、不同時程的堿水解反應(yīng)處理梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶樣品。結(jié)果顯示，均獲得了相似的甲膦酸和特己基甲膦酸比率，從而證明了實驗方法的可靠性。

我們又注意到，梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶的膦?；缟纤鲈趶妷A處理條件下不能發(fā)生脫烷基反應(yīng)，而在37℃，pH 7.2生理條件下卻能在瞬間脫去烷基，而且這種脫烷基反應(yīng)在0～37℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而加快，這似乎意味著脫烷基反應(yīng)是乙酰膽堿酯酶的一種自家酶催化反應(yīng)，可能是靠近酶活力中心酯解部位的一個酸性基團在起作用。因此，我們又設(shè)計了一組實驗，測試梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶在0℃、不同pH條件下被氯磷啶重活化的效率。結(jié)果顯示，酸性條件可以加速脫烷基反應(yīng)，而堿性環(huán)境則可顯著地延遲反應(yīng)的進程。這也完全符合酶催化反應(yīng)的性質(zhì)，實驗證實了我們的預(yù)想。

我們得出結(jié)論，膦?；阴Ｄ憠A酯酶隨著時間的進程，由一種可以被親核試劑重新活化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成不能被重活化的狀態(tài)的現(xiàn)象叫做老化。老化的實質(zhì)是膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子上膦酰殘基的脫烷基反應(yīng)。它是一種單分子裂解反應(yīng)，即烷氧基團C-O鍵的斷裂。梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶在生理條件下不能被重活化的原因，是由于老化發(fā)生太快致使重活化劑來不及發(fā)揮其作用的緣故，而梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化反應(yīng)的實質(zhì)是酶分子上毒劑殘基中特己氧基的去烷基反應(yīng)。烷基脫落后，氧原子上的負電荷排斥重活化劑的親核性使之不能進行親核攻擊。

膦?；阴Ｄ憠A酯酶中膦酰殘基烷氧基團對于重活化劑的親核攻擊的確存在著空間障礙，但它只是未老化的膦?；阴Ｄ憠A酯酶活性難以被重活化的原因，而不是老化的原因，因為它不能解釋老化的時間依賴性。從而我們否定了空間障礙學(xué)說是老化反應(yīng)的機制。

經(jīng)過3年的努力，我們對梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶的老化機制有了一個比較清晰完整的描述。這一成果比國外文獻報道早2年。梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化機制的闡明是防化醫(yī)學(xué)中的重大發(fā)展，其理論意義在于揭示了梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化的分子基礎(chǔ)，其實用意義在于指出重活化劑研究對老化的梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶將是徒勞的，梭曼中毒的防治應(yīng)從中毒過程的其他環(huán)節(jié)加以解決，梭曼抗毒藥物研究的方向不是重活化劑，而是抗膽堿藥和可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，從而給藥物設(shè)計及梭曼中毒的防治指明了方向。至今，梭曼中毒防治藥物均嚴格遵循這一原則，藥物類型均限定在這一基礎(chǔ)框架內(nèi)。

在弄清了梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化的分子機制后，我們又進行了膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化規(guī)律的研究。實驗表明，有機磷（膦）毒劑是一類強烈的乙酰膽堿酯酶抑制劑，膦?；阴Ｄ憠A酯酶的形成并不是反應(yīng)的終結(jié)，它可以繼續(xù)向2個方向轉(zhuǎn)化，即整個膦酰殘基的脫落（自動復(fù)活）或膦?；糠謿埢拿撀洌ɡ匣?。膦?；阴Ｄ憠A酯酶繼續(xù)轉(zhuǎn)化的多向性是就膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子的群體而言的，對某一個膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子來說則只有一種可能。群體中哪些分子走向老化，哪些分子走向自動復(fù)活是隨機的。在理想的體系中，所有膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子的機會是均等的。同系結(jié)構(gòu)中，膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子朝哪個方向轉(zhuǎn)化主要取決于膦酰殘基上烷氧基團的結(jié)構(gòu)，即膦酰化乙酰膽堿酯酶的內(nèi)部因素，而體系中的環(huán)境因素只是變化的條件。去膦?；磻?yīng)（自動復(fù)活）及脫烷基反應(yīng)（老化）是兩個相對獨立發(fā)展的過程。不同的膦?；阴Ｄ憠A酯酶發(fā)展的速度相差懸殊，發(fā)生頻率高的反應(yīng)是轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢方向，發(fā)生頻率低的是劣勢方向。去膦?；磻?yīng)的優(yōu)勢可以接近100%，如甲氟膦酸正丁酯膦?；阴Ｄ憠A酯酶，而劣勢者可趨于零，如梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶。多數(shù)有機膦毒劑則處于中間的地位。

我們系統(tǒng)地研究了梭曼及其類似物與膦酰化乙酰膽堿酯酶老化反應(yīng)間的規(guī)律性，揭示了毒劑殘基中烷氧基團結(jié)構(gòu)在膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化反應(yīng)中的獨特地位。發(fā)現(xiàn)氟甲膦酸酯系列中，烷氧基團的化學(xué)結(jié)構(gòu)對老化速度影響甚大。α甲基取代促進老化的效力大于β取代者，而α和β甲基同時取代則有顯著的協(xié)同效應(yīng)。可以得出結(jié)論，α碳原子上1個甲基取代，β碳原子上3個甲基取代時，最易于老化的發(fā)生。特己氧基是促進老化的最佳基團，梭曼是此系列毒劑中利于老化發(fā)生的最佳結(jié)構(gòu)。進而我們想到，如果這一結(jié)論是真實的，那么凡是有特己氧基的甲膦酸酯類有機磷（膦）毒劑所形成的膦酰化酶，在生理條件下將都會迅速地發(fā)生老化，實驗完全證實了這一推斷。這些實驗結(jié)果的理論意義在于闡明了神經(jīng)性毒劑化學(xué)結(jié)構(gòu)與膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化之間的規(guī)律性，加深了對有機膦毒劑結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的認識。其實用意在于，根據(jù)膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化的規(guī)律性預(yù)見一些像梭曼一樣迅速地使膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化的未知神經(jīng)性毒劑，為新毒劑的追蹤提供線索。

我們在梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶難以被重活化的研究中，還考慮到中毒機體內(nèi)存在“過剩的”游離毒劑的可能性。果如所料，大鼠在1個致死劑量以上中毒時，腦和膈肌中均有游離毒劑存在，表現(xiàn)在對外加乙酰膽堿酯酶的抑制。劑量愈大，游離毒劑愈多。梭曼中毒時的游離毒劑比等致死劑量的沙林及塔崩中毒時多，顯示了梭曼的特殊性。游離毒劑的發(fā)現(xiàn)，從作用機制上給神經(jīng)性毒劑毒理學(xué)增添了新的內(nèi)容，給中毒防治及解毒藥物的研究提出了新的啟示，乙酰膽堿酯酶的再抑制可能是膦酰化乙酰膽堿酯酶難以恢復(fù)活性的又一原因。十多年后，國外文獻才提出了毒劑庫的概念。

根據(jù)酶的催化原理，酶具有同時催化正向和逆向反應(yīng)的性質(zhì)，我們又研究了神經(jīng)性毒劑酶促合成的可能性。發(fā)現(xiàn)G類毒劑，如梭曼及沙林的水解產(chǎn)物氟離子和甲膦酸酯，在試管內(nèi)有外加乙酰膽堿酯酶存在的條件下，可被G類毒劑水解酶催化重新合成毒劑，表現(xiàn)在對外加乙酰膽堿酯酶活性的嚴重抑制。我們在國外發(fā)表后，被認為是G類毒劑中毒機制研究中又一個重要的發(fā)現(xiàn)。這一實驗結(jié)果，國外迄今沒有報道。

光陰荏苒，斗轉(zhuǎn)星移，與梭曼打拼的這一段歷史不覺已離去了幾十年。周廷沖院士已經(jīng)仙逝，那時一塊兒為梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化機制研究戰(zhàn)斗拼搏的同志也都年逾古稀，你們還記得那些苦思冥想又興高采烈的時光嗎？今天，我們已經(jīng)能用生物藥物預(yù)防比格犬6個致死量的梭曼中毒，并將1個致死量梭曼中毒的預(yù)防時程提高到了7天。第二代生物藥物抗毒研究也在規(guī)劃之中。這是自1958年周廷沖教授提出A70生物制劑后，我們?nèi)〉玫淖钚逻M展。如果周廷沖老師能聽見這些喜訊該是多么地欣慰?。?/p>

今天，在這里寫下這篇回憶性的科技散文，紀念周廷沖老師對我們的指導(dǎo)和引領(lǐng)，以及與大家建立的深厚的戰(zhàn)斗友誼，以寄托我們的懷念。

（本文編輯：齊春會）

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.001

：1000-3002-（2017）03-0207-03

2017-02-16接受日期：2017-03-16）