萬銳杰 劉紹凡 徐敏敏 陳 愉

(重慶市中醫(yī)院骨科，重慶 400000)

椎間盤突出患者骨髓血血清Th1、Th2、IL-12及IL-4的表達及臨床意義

萬銳杰 劉紹凡 徐敏敏 陳 愉

(重慶市中醫(yī)院骨科，重慶 400000)

目的探討Ⅰ型輔助性T細胞(Th1)、Ⅱ型輔助性T細胞(Th2)、白細胞介素(IL)-4和IL-12在椎間盤突出(LDH)患者骨髓血血清中的表達水平及其臨床意義。方法選取該院2013年9月至2015年9月住院的腰椎骨折并摘除椎間盤的患者15例(對照組)及手術(shù)治療LDH患者15例(觀察組)，分別抽取兩組骨髓血，分離骨髓血血清，流式細胞術(shù)用以檢測骨髓血血清中Th1和Th2細胞數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)用以檢測IL-4和IL-12的表達。結(jié)果觀察組骨髓血血清中Th1和Th2的細胞數(shù)高于對照組(P<0.05)，觀察組骨髓血血清中IL-12的表達高于對照組(P<0.05)，而兩組IL-4的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，觀察組骨髓血血清中IL-12與IL-4的表達呈負相關(guān)(r=-0.320，P<0.05)。結(jié)論LDH患者血清中Th1和Th2細胞數(shù)增加，Th1分泌的細胞因子IL-12的表達增加，Th1及其分泌的細胞因子IL-12可能參與LDH疾病的發(fā)生發(fā)展。

椎間盤突出；Ⅰ型、Ⅱ型輔助性T細胞；白細胞介素

椎間盤突出(LDH)發(fā)病率高〔1〕。Ⅰ型輔助性T細胞(Th1)和Ⅱ型輔助性T細胞(Th2)同屬于Th細胞亞群，白細胞介素(IL)-4是由Th2細胞分泌的細胞因子，IL-12是由Th1細胞分泌的細胞因子〔2〕。Th1和Th2細胞的平衡及IL-4和IL-12的表達水平與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括哮喘〔3〕，免疫系統(tǒng)疾病〔4〕，脊髓炎〔5〕等，近年來有研究表明LDH患者髓核組織中Th1、Th2、IL-12和IL-4的表達與其發(fā)病有相關(guān)性〔6〕。本研究擬分析LDH患者骨髓血血清中Th1、Th2、IL-12和IL-4的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床樣本 選取重慶市中醫(yī)院骨外科2013年9月至2015年9月住院的患者30例，其中15例腰椎骨折并摘除椎間盤的患者為對照組，15例手術(shù)治療LDH患者為觀察組，兩組男均9例，女6例，年齡49～73〔平均(57.97±9.33)〕歲。納入標準：經(jīng)病理學檢查，所有腰椎骨折并摘除椎間盤的患者其骨髓組織均正常，沒有明顯退行性病變，選取的LDH患者符合椎間盤退變的病理形態(tài)學改變。排除標準：影響神經(jīng)或免疫系統(tǒng)功能的疾病，均無血液系統(tǒng)疾病或家族遺傳病史，患者手術(shù)前均未接受任何藥物或介入治療。該實驗的所有過程均遵從赫爾辛基宣言的標準，且研究方案均經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2骨髓血血清的抽取 分別抽取兩組患者的骨髓血2 ml，4℃保存，后續(xù)骨髓血血清的提取需迅速進行，分別將兩組骨髓血血清樣本從冰箱中取出，4℃度靜置2 h，9 000 r/min離心10 min后，小心將上層血清吸出，轉(zhuǎn)移至一干凈的EP管中，2 ml骨髓血可提取的骨髓血血清量約500 μl。

1.3流式細胞術(shù)檢測骨髓血血清中Th1和Th2細胞 按照人IL-4、IL-12的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(美國，美天妮公司)的說明書進行操作，將方法1.2中制備的骨髓血血清中加入組織多肽抗原(TPA)和離子霉素，3 h后收集。實驗分為對照管和實驗管，分別加CD3-活化蛋白(AP)C和CD8-PercP，混勻，室溫放置20 min，加細胞裂解液，混勻，放置10 min，隨后1 000 r/min離心5 min，棄上清。加Cytofix/Cytoper液，4℃放置20 min，加入Cytofix/Cytoperm液1 ml，1 500 r/min離心5 min，棄上清。實驗管加入IL-4-PE和IL-12-PE，對照管加入相應抗體，4℃避光放置30 min。加Perm/Wash液洗滌兩次，洗滌液重懸。FACScom軟件和CD3-APC、CD8-PercP及IL-4-PE，IL-12-PE抗體標記細胞，調(diào)節(jié)儀器補償，Cellquest軟件分析細胞。其中區(qū)分細胞分別采用前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設門，CD3和CD8散點圖設門區(qū)分Th細胞(CD3+CD8-)，用IL-12和IL-4的散點圖表示Th1和Th2。該實驗過程中用到的細胞表面標記抗體(抗人)CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC，IL-4-PE，IL-12-PE，Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution均購于美國的BD公司。

1.4ELISA法檢測骨髓血血清中IL-4和IL-12的表達 按照ELISA試劑盒說明書進行操作，稀釋標準品，加樣時分別設空白孔(不加酶標試劑)、標準孔、待測樣品孔。分別為標準品50 μl加入酶標包被板，40 μl樣品稀釋液加入待測樣品孔，待測樣品10 μl，封板膜封板后37℃孵育3 min，30倍濃縮洗滌液蒸餾水稀釋成1倍后備用，揭去封板膜，棄液體甩干，加洗滌液靜置30 s，棄洗滌液，重復5次，甩干，加酶標試劑，每孔500 μl，空白孔，不加，37℃孵育3 min，洗滌液洗滌，加入顯色劑(A液50 μl，B液50 μl，混勻)，37℃避光，顯色15 min，每孔加50 μl終止液，終止反應，設置空白調(diào)零，450 nm波長下檢測各孔的吸光度(OD值)，檢測設備為LISA-STAR全自動酶標分析儀(瑞典，LISA-STAR公司)。以標準物濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，繪制成標準曲線，根據(jù)所測的樣品OD值在標準曲線上查出相應濃度，乘以釋倍數(shù)即為實際濃度即為兩組患者的骨髓血血清中IL-4和IL-12的表達水平。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、線性相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組骨髓血血清中Th1/Th2細胞的分布 觀察組骨髓血血清中Th1和Th2的細胞數(shù)〔(13.14±3.07)%、(5.37±1.22)%〕高于對照組〔(3.67±1.23)%,(1.78±0.36)%;t=4.135,4.562,P=0.027,0.012〕。

2.2兩組骨髓血血清中IL-4和IL-12表達比較 觀察組骨髓血血清中IL-12的表達〔(20.16±4.37)pg/ml〕顯著高于對照組〔(4.85±2.18)pg/ml,t=4.321,P=0.017〕，而兩組IL-4的表達〔(1.65±1.21)pg/ml、(1.41±1.14)pg/ml〕差異無統(tǒng)計學意義(t=0.776,P=0.628)。

2.3觀察組IL-12與IL-4相關(guān)性 觀察組骨髓血血清中IL-12與IL-4的表達呈負相關(guān)(r=-0.320，P<0.05)。

3 討 論

LDH是常見的腰部疾病之一，且個體之間常常因為存在性別、年齡、部位和時間的差異，而有不同的臨床表現(xiàn)或癥狀，常表現(xiàn)為腰痛或麻痹癥等癥狀，其發(fā)病人群一般為中老年人，但近來有逐漸從中老年人向青壯年人發(fā)展的變化趨勢〔7〕。LDH以腰椎間盤退變?yōu)椴±砘A(chǔ)。研究顯示，發(fā)生椎間盤突出的患者其細胞外基質(zhì)(ECM)可發(fā)生明顯的降解，其椎間盤細胞總數(shù)會顯著降低，ECM發(fā)生降解，導致整個腰椎間盤的力學性能改變，使得腰椎間盤發(fā)生脫出或突出等癥狀，進一步引發(fā)腰椎間盤突出的各種臨床癥狀〔8〕。其誘發(fā)因素有患者的職業(yè)、年齡、外傷、種族和妊娠等因素〔9〕。目前也有研究認為LDH的發(fā)生與遺傳性、生物力學變化和細胞因子的表達異常等密切相關(guān)〔10〕。本研究顯示，LDH的發(fā)病原因除了與機械性因素有關(guān)以外，還與炎性因子和免疫細胞有著密切的關(guān)系。Th1參與細胞的遲發(fā)型超敏反應或免疫反應等過程，能合成分泌細胞因子IL-12，但不能合成分泌IL-4，Th2則主要參與體液免疫應答等過程，能合成分泌細胞因子IL-4，不能合成分泌IL-12，IL-12為炎性細胞因子，發(fā)揮促進疾病的發(fā)生發(fā)展的作用，IL-4為抑制炎癥的細胞因子，阻止疾病的發(fā)生發(fā)展〔11〕。由于IL-4和IL-12的表達反映了T細胞的活化程度，即LDH可使患者骨髓血血清中T細胞的活化程度增加。龔韶華等〔6〕在LDH患者的髓核組織中也發(fā)現(xiàn)了這一變化，可能原因是IL-12參與Th1的細胞活化，IL-4參與Th2的活化。Th1 型細胞因子為炎性細胞因子，促進疾病的發(fā)生發(fā)展，Th2型細胞因子IL-4則主要發(fā)揮抑制炎癥的作用，阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，緩解疾病。本研究結(jié)果也表明了Th1和IL-12 在LDH患者骨髓血血清中處于高表達狀態(tài)，參與LDH疾病的發(fā)生發(fā)展。

1喬曉峰，李長德，解云川，等.腰椎間盤突出癥患者髓核組織TNF-α、IL-8以及IL-10的表達及其意義〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(17)：4276-7.

2曹 涌，姚 羽，張 烽.腰椎間盤突出癥與Th細胞、NK細胞的相關(guān)性研究〔J〕.中國脊柱脊髓雜志，2013；23(10)：912-5.

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6龔韶華，石曉兵，包朝魯.輔助性T細胞1，2及白細胞介素4，12在椎間盤突出癥患者髓核組織中的表達〔J〕.中國基層醫(yī)藥，2016；23(9)：1299-320.

7崔 偉，阮學廣，王慧明，等.老年骨質(zhì)疏松癥與腰椎間盤突出癥的相關(guān)性研究〔J〕.放射學實踐，2012；27(4)：444-6.

8Wen W，Yang L，Liu S，etal.Reporting quality and effect size comparison in randomized controlled trials of bo′s abdominal acupuncture using CONSORT statement and STRICTA〔J〕.J Tradit Chin Med，2016；36(3)：382-91.

9Hong SJ，Kim DY，Kim H，etal.Resorption of massive lumbar disc herniation on MRI treated with epidural steroid injection：a retrospective study of 28 cases〔J〕.Pain Physician，2016；19(6)：381-8.

10Beculic H，Skomorac R，Jusic A，etal.Impact of timing on surgical outcome in patients with cauda equina syndrome caused by lumbar disc herniation〔J〕.Med Glas，2016；13(2)：136-41.

11Saxena R，Kaur J.Th1/Th2 cytokines and their genotypes as predictors of hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma〔J〕.World J Hepatol，2015；7(11)：1572-80.

〔2016-07-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

劉紹凡(1976-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)骨傷研究。

萬銳杰(1984-)，男，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)骨傷研究。

R68

A

1005-9202(2017)17-4341-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.083