包建忠 張震宇 葉紅波 黃 鈺 彭 琪

(深圳市坪山新區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳 518122)

碘過(guò)量不同處理時(shí)間對(duì)Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的影響

包建忠 張震宇 葉紅波 黃 鈺 彭 琪

(深圳市坪山新區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳 518122)

目的探討碘過(guò)量不同處理時(shí)間對(duì)Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的影響。方法采用含0(對(duì)照組)、0.1 mmol/L碘化鉀的Coons F12培養(yǎng)基培養(yǎng)Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞2、6 h、1 d，對(duì)小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C蛋白、死亡細(xì)胞百分比、線粒體超氧化物生成、乳酸脫氫酶活力進(jìn)行檢測(cè)分析研究。結(jié)果0.1 mmol/L碘化鉀組處理2 h、6 h、1 d時(shí)，小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞率遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P<0.05)；Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物生成明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，且處理2 h時(shí)增長(zhǎng)幅度最大；隨著0.1 mmol/L碘化鉀處理時(shí)間的增加，培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶活力程序持續(xù)增加趨勢(shì)，處理2、6 h、1 d時(shí)乳酸脫氫酶活力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論碘過(guò)量處理2 h可能會(huì)導(dǎo)致Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體發(fā)生過(guò)氧化損傷，而處理1 d則極有可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

碘過(guò)量；Fischer大鼠；甲狀腺細(xì)胞線粒體；過(guò)氧化損傷

碘對(duì)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的分泌和生長(zhǎng)具有重要作用。研究表明〔1〕，對(duì)碘具有較高敏感性的人，尤其是患有隱性甲狀腺疾病者，攝取過(guò)多碘會(huì)引發(fā)或加重機(jī)體免疫性甲狀腺疾病。運(yùn)用5、20 mmol/L碘化鉀對(duì)不滅的甲狀腺細(xì)胞系進(jìn)行48 h處理，可有效延緩甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)，促使細(xì)胞壞死或凋亡〔2〕。此外，產(chǎn)生細(xì)胞中活性氧的主要場(chǎng)所為線粒體，同時(shí)也是凋亡觸發(fā)的靶點(diǎn)。本研究探討碘過(guò)量不同處理時(shí)間對(duì)Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1儀器及試劑 (1)流式細(xì)胞儀；倒置熒光顯微鏡；(2)DNA ladder檢測(cè)試劑盒；乳酸脫氫酶活力檢測(cè)試劑盒；山羊抗小鼠二步法免疫組化試劑盒；小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C單克隆抗體及線粒體超氧化物指示劑。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞放置于Coons F12培養(yǎng)基中，將0.25%鏈霉素、0.25%青霉素、1 U/L促甲狀腺激素、0.3 g/L谷氨酰胺、5.0 μg/L氫化可的松、5.0 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、10.0 mg/L胰島素及5.0%新生小牛血清加入其中，隨后放于37℃的100.0%濕度培養(yǎng)箱中，每間隔4 d更換1次液體。

1.3處理方法 采用含0(對(duì)照組，n=6)、0.1 mmol/L碘化鉀的Coons F12培養(yǎng)基培養(yǎng)Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞2 h、6 h、1 d(n=6)。

1.4小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C蛋白 首先處理細(xì)胞爬片，隨后通過(guò)免疫組化二步法對(duì)小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C蛋白進(jìn)行檢測(cè)；評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)陽(yáng)性：棕黃色粗大顆粒；陽(yáng)性：黃色中等大小顆粒；弱陽(yáng)性：淡黃色細(xì)小顆粒。每個(gè)爬片選擇5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)后計(jì)算強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞率，強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞率=(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100.0%。

1.5死亡細(xì)胞百分比檢測(cè) 在6孔板接種Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞，進(jìn)行3 d貼壁培養(yǎng)，并通過(guò)0.1 mmol/L碘化鉀處理2、6 h、1 d，隨后收集貼壁細(xì)胞，并進(jìn)行10 min離心；隨后通過(guò)70%乙醇對(duì)其進(jìn)行固定處理，放置在4℃環(huán)境中過(guò)夜保存；將200 mg/L RNA酶和50 mg/L 碘化丙啶與其混合；利用流式細(xì)胞儀對(duì)其亞二倍體峰進(jìn)行測(cè)定，死亡細(xì)胞百分比=(亞二倍體細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100.0%。

1.6線粒體超氧化物生成檢測(cè) 將已完成處理的Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞放入5.0 μmol/L 線粒體超氧化物指示劑中，放置在37℃的環(huán)境中避光放置0.5 h；通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)線粒體超氧化物指示劑平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，并利用線粒體超氧化物指示劑平均熒光強(qiáng)度反應(yīng)線粒體超氧化物生成量。

1.7乳酸脫氫酶活力檢測(cè) 通過(guò)比色法對(duì)乳酸脫氫酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C蛋白檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞呈上皮樣生長(zhǎng)，胞膜較為完整，胞核為橢圓形，體積較大，生長(zhǎng)狀態(tài)較為良好，且以細(xì)胞質(zhì)中有均衡分布的淡黃色小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C陽(yáng)性顆粒的細(xì)胞為主；0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h后，細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色的粗大小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C陽(yáng)性顆粒的細(xì)胞數(shù)增加，并且部分細(xì)胞膜發(fā)生缺損；0.1 mmol/L碘化鉀處理6 h后，細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色的粗大小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C陽(yáng)性顆粒的細(xì)胞數(shù)與處理2 h相比更多，并且顏色更深；0.1 mmol/L碘化鉀處理1 d后，棕黃色顆粒完全包圍藍(lán)色細(xì)胞核，并可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生破碎，小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C顏色變淡。0.1 mmol/L碘化鉀組處理2、6 h、1 d時(shí)，小鼠抗大鼠細(xì)胞色素C強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞率(34.2%±3.5%，44.7%±5.4%，30.2%±6.0%)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(13.7%±1.1%，P<0.05)。

2.2死亡細(xì)胞百分比檢測(cè)結(jié)果 0.1 mmol/L碘化鉀處理2、6 h、1 d時(shí)死亡細(xì)胞百分比(7.41%±0.11%，9.18%±0.13%，12.69%±0.15%)均明顯高于對(duì)照組(4.55%±0.19%)(P<0.05)，且隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，死亡細(xì)胞比例持續(xù)升高。

2.3線粒體超氧化物生成檢測(cè)結(jié)果 0.1 mmol/L碘化鉀處理Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞2 h，線粒體超氧化物指示劑平均熒光強(qiáng)度高達(dá)對(duì)照組的5.19倍，處理6 h高達(dá)2.18倍，處理1 d高達(dá)2.03倍。經(jīng)熒光顯微鏡輔助可知，對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中紅色的線粒體超氧化物指示劑熒光強(qiáng)度較弱；0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明線粒體超氧化物生成顯著提升；而處理6 h及1 d時(shí)熒光強(qiáng)度開始下降，表明與處理2 h相比，線粒體超氧化物生成降低，但依舊高于對(duì)照組。

2.4乳酸脫氫酶活力檢測(cè)結(jié)果 隨著0.1 mmol/L碘化鉀處理時(shí)間的增加，培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶活力程序持續(xù)增加趨勢(shì)，處理2、6 h、1 d時(shí)乳酸脫氫酶活力〔(1.74±0.21)U/mg、(6.52±0.13)U/mg，(8.24±0.23)U/mg〕明顯高于對(duì)照組〔(0.78±0.03)U/mg，P<0.05〕。

3 討 論

Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞具備甲狀腺細(xì)胞大部分特征及生理功能，如碘化酪氨酸、甲狀腺過(guò)氧化物酶及甲狀腺球蛋白等，并且具有碘/鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體，但無(wú)法構(gòu)成甲狀腺組織中的濾泡結(jié)構(gòu)，也無(wú)法在培養(yǎng)基中生成游離的甲狀腺素及三碘甲腺原氨酸等物質(zhì)〔3〕。有研究表明〔4〕，在狗和人的甲狀腺結(jié)構(gòu)中，低劑量或中等劑量的碘可對(duì)一系列促甲狀腺素介導(dǎo)的甲狀腺效應(yīng)產(chǎn)生阻滯作用，如碘/鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體及甲狀腺過(guò)氧化物酶的表達(dá)、環(huán)磷酸腺苷的合成等。碘含量過(guò)高會(huì)對(duì)甲狀腺球蛋白碘化產(chǎn)生干擾作用，進(jìn)而使甲狀腺激素的合成過(guò)程發(fā)生中斷〔5〕。

在正常情況下，甲狀腺組織能夠生成過(guò)氧化氫，并使之合成甲狀腺激素。就生成部位而言，產(chǎn)生H2O2的重要來(lái)源為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體生成的超氧陰離子〔6〕。本研究中，采用0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h時(shí)，F(xiàn)ischer大鼠甲狀腺細(xì)胞中線粒體超氧化物指示劑熒光強(qiáng)度顯著增加，表明細(xì)胞中生成了大量超氧化物，并且發(fā)生線粒體過(guò)氧化損傷。而處理6 h及1 d后，指示劑熒光強(qiáng)度仍高于對(duì)照組，表明在過(guò)量碘化鉀的不斷刺激處理下，F(xiàn)ischer大鼠甲狀腺細(xì)胞中線粒體超氧化物生成持續(xù)增加，并且繼續(xù)氧化損傷線粒體。其主要原因可能為：(1)通過(guò)cAMP通路，碘對(duì)甲狀腺細(xì)胞發(fā)揮刺激性作用，進(jìn)而生成H2O2；(2)碘量過(guò)高時(shí)，H2O2消耗量降低，引發(fā)活性氧蓄積〔7，8〕。由于生成H2O2，甲狀腺過(guò)氧化物酶發(fā)生氧化，形成氧化復(fù)合物Ⅰ(CPDI)，該物質(zhì)可接受一個(gè)電子形成復(fù)合物Ⅱ，進(jìn)而生成一個(gè)自由基，形成一個(gè)氧化-還原循環(huán)過(guò)程。該循環(huán)過(guò)程必須精確、穩(wěn)定，當(dāng)氧化趨勢(shì)增強(qiáng)時(shí)，則會(huì)形成游離的H2O2、超氧陰離子及過(guò)氧化脂肪酸等；當(dāng)?shù)饬慨惓Ｔ黾訒r(shí)，則會(huì)對(duì)催化樣活性發(fā)生抑制，從而生成大量自由基，并且會(huì)導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞中聚集大量以氧化形式存在的碘，此類物質(zhì)如果過(guò)多潴留在甲狀腺細(xì)胞中會(huì)對(duì)微粒體、線粒體及細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p傷，破壞甲狀腺組織的正常功能，嚴(yán)重者會(huì)引發(fā)甲狀腺萎縮。

本研究結(jié)果表明，在早期經(jīng)高碘處理可導(dǎo)致Fischer大鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體發(fā)生氧化損傷，破壞線粒體膜的完整性，并且有細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)，隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞膜被破壞程度不斷增加，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死及凋亡。有研究資料指出〔9〕，凋亡機(jī)制的開關(guān)為線粒體，線粒體不僅是損傷效應(yīng)的靶點(diǎn)，同時(shí)也是生成活性氧的重要部位。線粒體呼吸鏈可生成細(xì)胞中大量活性氧，活性氧可對(duì)DNA、脂質(zhì)及線粒體蛋白直接發(fā)揮作用，進(jìn)而影響其正常生理功能。心磷脂過(guò)氧化等多種脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是引發(fā)凋亡關(guān)鍵性事件發(fā)生的重要因素。

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〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R965.1

A

1005-9202(2017)18-4476-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.019

廣東省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No.WSTJJ20121204)；深圳市坪山新區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生發(fā)展孵化資助資金課題(No.201333)

包建忠(1974-)，男，主管藥師，主要從事藥學(xué)研究。