董亞旗，朱習芳，李程，陳穎鈺，索朗斯珠，郭愛珍

（1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

牛支原體病診斷技術(shù)研究

董亞旗1,3，朱習芳2,3，李程1,3，陳穎鈺2,3，索朗斯珠1，郭愛珍2,3

（1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

近年來，牛支原體對世界養(yǎng)牛業(yè)尤其是肉牛、奶牛養(yǎng)殖業(yè)的威脅日漸嚴重，在如何控制牛支原體的傳播和降低經(jīng)濟損失中，快速準確診斷牛支原體病備受關(guān)注。隨著研究的深入，針對牛支原體的診斷技術(shù)不斷被開發(fā)。本文從獸醫(yī)流行病學(xué)、臨床病理學(xué)、細菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面綜述了牛支原體病的診斷技術(shù)，以期能夠為該病的早期治療和防控提供依據(jù)。

牛支原體；診斷；支原體；肺炎；乳腺炎

牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是一種介于細菌和病毒之間、能自由生活且沒有細胞壁的最小微生物，是牛的一種重要致病菌，最早出現(xiàn)在歐洲、北美等地區(qū)，之后在世界范圍內(nèi)普遍存在，造成的經(jīng)濟損失非常嚴重[1]。1961年Hale等在美國首次從乳腺炎患牛的牛奶中分離出牛支原體，1976年鑒定其與呼吸道疾病有關(guān)，除主要引起牛肺炎和乳腺炎外，還導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎等多種病癥[2,3]。我國于1983年首次從患乳腺炎奶牛的奶中分離到牛支原體，2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[4,5]。

目前，臨床上還未有牛支原體防治的特效藥物及疫苗，而耐藥菌株卻在不斷出現(xiàn)，更給牛支原體病的防控造成極大困難[6～8]。由于牛感染牛支原體后不表現(xiàn)典型的臨床癥狀，且臨床上多以混合感染的形式出現(xiàn)，因此早期準確診斷對于牛支原體病的確診、及時治療、減少損失等意義重大。目前牛支原體診斷技術(shù)主要包括流行病學(xué)和臨床癥狀、病理學(xué)觀察、細菌學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)等方面。綜合運用多種技術(shù)有助于提高診斷的靈敏性和特異性。

1 流行病學(xué)

研究發(fā)現(xiàn)，運輸應(yīng)激與牛支原體肺炎的暴發(fā)密切相關(guān)。隨著國內(nèi)國際牛業(yè)貿(mào)易的迅速發(fā)展，牛支原體肺炎已呈全球傳播趨勢[9,10]。在歐洲，由牛支原體引起的呼吸道疾病約占犢牛呼吸道疾病的25%～35%，法國的牛支原體發(fā)生率為30%，英國為20%～25%[11,12]。我國于2008年首次報道肉牛流行牛支原體肺炎，平均病死率10%，最高可達40%以上[13]。

新生犢牛的牛支原體肺炎與母牛發(fā)生牛支原體乳腺炎相關(guān)，犢牛吸吮含有牛支原體的初乳和常乳感染，15日齡左右出現(xiàn)典型癥狀，包括呼吸道癥狀和關(guān)節(jié)炎等[14]。

2 臨床和病理學(xué)診斷

2.1 肺炎型

牛感染牛支原體后，根據(jù)病程長短可分為急性型和慢性型。急性型病牛精神沉郁，高熱，食欲減退或廢絕，伴有間歇性的咳嗽、氣喘，鼻腔有清亮分泌物；后期轉(zhuǎn)變?yōu)轲ば曰蚰撔员且?，形體消瘦、體重減輕，被毛粗亂無光[13]；并可繼發(fā)中耳炎、關(guān)節(jié)炎、壞死性咽炎、難產(chǎn)、流產(chǎn)等疾病，嚴重者出現(xiàn)死亡，犢牛病情相對嚴重，死亡率可達50%[15～17]；慢性型無明顯臨床癥狀。

牛支原體感染后的病變部位主要在胸腔和肺。剖檢患牛，可觀察到皮下有結(jié)節(jié)，輕者可見膈葉、心葉及肺臟尖葉有紅色肉變區(qū)，肺臟與胸膜輕度粘連；重者心包積液，液體黃色透亮；胸水增多，液體黃色透亮；肺部發(fā)生大面積肉變區(qū)，分布很多化膿灶或干酪樣壞死灶，肺部質(zhì)地變硬[18]；腎局部出血，腎小管上皮細胞發(fā)生透明滴樣變或顆粒變性，部分細胞壞死脫落形成管型；淋巴結(jié)被膜和小梁均表現(xiàn)水腫，間隙增大，淋巴竇擴張，其間有免疫細胞浸潤[19]。

2.2 乳腺炎型

牛支原體乳腺炎多發(fā)于奶牛，臨床上可分為慢性型和急性型。慢性型：主要為亞臨床感染, 癥狀不明顯，有時出現(xiàn)間歇性急性發(fā)作，有時可見關(guān)節(jié)炎、跛行、繁殖障礙。急性型：患牛精神沉郁，食欲減退，奶產(chǎn)量急劇下降；多個乳區(qū)有急性炎癥，乳區(qū)發(fā)熱，乳房腫漲，觸診呈捏粉樣感覺；乳汁外觀不一，早期為水樣，并有“沙粒樣”絮狀物, 漸而為黃色漿液樣物質(zhì)、凝塊、絮片狀物或膿樣。

根據(jù)臨床癥狀只能初步診斷為牛支原體病，確診還需實驗室進一步診斷。

3 細菌學(xué)診斷技術(shù)

支原體和L型細菌具有某些相似的特性，如均無細胞壁、形態(tài)呈多形性、在固體培養(yǎng)基上的菌落為“油煎蛋”狀等，但兩者仍存在明顯特性差別：支原體可在自然條件下生長，生長需要固醇類物質(zhì)，而L型細菌常常是實驗中形成的，有抗生素的壓力，不依賴固醇類物質(zhì)即可生長；L型細菌較大，直徑可達50μm，支原體較小，直徑為0.1～0.8μm；支原體的基因組比L型細菌小，支原體C+G的含量一般在23%～41%，而L型細菌的C+G含量一般高于41%；在無抗生素等誘導(dǎo)物下連續(xù)培養(yǎng)5代以上，支原體菌無返祖現(xiàn)象，而L型細菌在除去誘導(dǎo)物情況下易返祖成母菌形態(tài)。

細菌學(xué)診斷技術(shù)通常是指對待檢測樣本進行牛支原體的分離培養(yǎng)鑒定。采集牛支原體侵襲過的靶組織，無菌操作將小塊組織研磨涂于PPLO固體培養(yǎng)基上，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，同時加入適量的無菌生理鹽水將小組織塊研磨，過濾到PPLO液體培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)；2～3d后低倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，牛支原體菌落呈“煎蛋樣”生長，液體培養(yǎng)基由紅色透亮變成黃色渾濁[4]。再依據(jù)牛支原體不能分解糖類和精氨酸而能夠分解乳酸等有機酸、可以氧化丙酮獲取能量、可利用甘油作為碳源等生化特性，輔以配套的生化試驗可對牛支原體進行初步鑒定[20]。雖然這是鑒定牛支原體的經(jīng)典方法，但存在耗時過多、中間環(huán)節(jié)復(fù)雜、培養(yǎng)條件要求高等缺陷，給牛支原體的臨床分離帶來了一定的困難，不適合臨床快速診斷。

牛支原體通常和多殺性巴氏桿菌A型、化膿隱秘桿菌、溶血曼氏桿菌、 嗜昏睡嗜血桿菌、牛呼吸道合胞體病毒、牛皰疹病毒、牛病毒性腹瀉病毒以及副流感病毒3型等病原混合致病?；旌细腥静≡w的鑒定有助于對牛支原體進行綜合治療與預(yù)防。

4 免疫學(xué)診斷技術(shù)

4.1 血清學(xué)檢測技術(shù)

血清學(xué)檢測技術(shù)具有特異性較高、靈敏度較好、快速、易于操作等優(yōu)點，非常適合臨床樣本的快速檢查和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。牛感染牛支原體后，其蛋白抗原和脂質(zhì)都可以激發(fā)機體免疫系統(tǒng)，而且血清中的牛支原體抗體可持續(xù)存在數(shù)月，因此血清抗體檢測技術(shù)被認為是牛支原體病流行病學(xué)研究的重要手段之一[21]。

比利時、美國、加拿大、瑞士等國已經(jīng)成功生產(chǎn)出商品化的牛支原體血清抗體檢測試劑盒，但由于成本高、使用局限大等原因，難以在臨床上推廣應(yīng)用；同時，檢測靈敏度和特異性有待進一步提高。

國內(nèi)對牛支原體病的研究起步晚，但已建立多種牛支原體血清學(xué)抗體檢測技術(shù)，其中，使用全菌蛋白和特異性抗原來檢測抗體的間接ELISA技術(shù)仍是主要的血清學(xué)檢測技術(shù)。Han X 于2014年建立了一種基于抗體親和力的檢測方法，可有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫個體，敏感性可達96.0%，特異性可達95.8%，具有較好的應(yīng)用前景[22]；Sun Z將利用牛支原體PDHB蛋白建立的間接ELISA方法與商業(yè)化ELISA試劑盒進行對比，同時對358份牛血清進行檢測，陽性檢出率分別為50.8%和39.9%[23]；除間接ELISA檢測抗體外，競爭ELISA方法用于檢測牛支原體也有報道：Fu P基于P48蛋白制備了單克隆抗體，并建立了直接競爭ELISA方法，對中國地區(qū)165份臨床牛血清進行檢測，并與兩種商業(yè)化的間接ELISA試劑盒相對比，結(jié)果顯示P48競爭ELISA技術(shù)不僅臨床上具有更高的陽性檢出率，而且在以20份陽性牛血清和20份陰性牛血清確定的抑制百分數(shù)臨界值為32%的條件下，競爭ELISA具有特異性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，可用于對大規(guī)模牛場進行牛支原體監(jiān)測[24]；Farhan發(fā)現(xiàn)了牛支原體的一個新的抗原蛋白MbovP579，并建立了間接ELISA方法，此方法能在感染后7d檢測到血清反應(yīng)[25]，其對于臨床樣品的敏感性為90.2%，特異性為97.8%，均顯著高于已有的商品化試劑盒。

但是，國內(nèi)尚無商業(yè)化試劑盒供應(yīng)市場。對于牛支原體病診斷而言，基于抗原檢測的快檢或批量檢測技術(shù)有更好的應(yīng)用前景，目前國內(nèi)外市場上都缺少這類試劑盒。

4.2 免疫組化診斷技術(shù)

免疫組化技術(shù)是一門將組織學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，是在組織細胞原位，通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)和組織化學(xué)顯色反應(yīng)，借助可見的標記物對相應(yīng)抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測[26]。此外，免疫組化可對結(jié)果進行追溯，尤其是其他的檢測方法已檢出牛支原體，而病原培養(yǎng)為陰性時，免疫組化技術(shù)就尤為重要。免疫組化技術(shù)一般作為病原分離的輔助技術(shù)，臨床有很高的陽性檢出率，有時可達100%[27]。

基于單克隆抗體建立的免疫組化技術(shù)可檢測出牛支原體抗原在組織中的分布情況，不僅提高了牛支原體的分菌率，而且降低了由于細菌污染對分菌所造成的影響，具有敏感特異等優(yōu)點[28]。但對于病情不重或者選擇病灶部位出現(xiàn)偏差較大時，免疫組化則難以檢測到牛支原體的存在。

5 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

5.1 PCR診斷技術(shù)

在眾多檢測方法中，多聚酶鏈式反應(yīng)（ploymerase chain reaction, PCR）是簡便且行之有效的檢測方法。Higuchi于2011年基于牛支原體菌株ATCC 25523建立了簡易PCR技術(shù)，用于快速診斷由牛支原體引起的乳腺炎，3h可分析300個樣品，敏感性和特異性高達98.7%～99.7%，適用于奶牛養(yǎng)殖場大規(guī)模篩選患牛支原體乳腺炎病牛[29]；用定量RT-PCR技術(shù)對牛奶樣品檢測，能快速識別因牛支原體感染而患乳腺炎的奶牛，提高成本效益，具有高度特異性，敏感性可達96.6%，適用于奶牛場對牛支原體的監(jiān)測[30,31]。大罐奶PCR的建立不僅可通過對牛奶或奶制品中牛支原體的檢測來監(jiān)管牛場，還可以用于在種群水平上對牛支原體進行流行情況監(jiān)測[32,33]。

牛支原體與無乳支原體的的同源性高達99%，僅通過16S rRNA基因難以確診[34,35]。uvrC和oppD/F等特異性基因的不斷發(fā)現(xiàn)，一定程度上增加了用PCR擴增來檢測牛支原體的特異性。Bigna基于管家基因uvrC建立的RT-PCR技術(shù)，無需從牛奶和組織樣品中提取DNA，具有操作簡單、耗時短、靈敏度高等優(yōu)點，適用于牛場對牛奶和臨床組織樣品進行牛支原體日常檢測[36]。

可以預(yù)見，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR診斷技術(shù)的特異性和敏感性將不斷提高，應(yīng)用成本也將隨之下降。應(yīng)當積極引進這些技術(shù)，用于牛支原體等病原微生物的檢測，繼而擴展到臨床應(yīng)用，服務(wù)于生產(chǎn)實際。

5.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增診斷技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等在2000年建立的在恒溫條件下對目的基因擴增的方法。該方法僅需要將擴增模板、dNTP、內(nèi)外引物等按適當?shù)谋壤旌希?0℃恒溫孵育1h即可實現(xiàn)高效擴增，在擴增產(chǎn)物中添加熒光染料SYBR Green I，根據(jù)顏色變化即可憑肉眼對結(jié)果作出判斷，具有特異性好、靈敏度高、操作簡單、耗時短、不需要專業(yè)的儀器設(shè)備等優(yōu)點[37]。白智迪等根據(jù)牛支原體特異基因uvrC設(shè)計了4對引物，建立了能快速檢測牛支原體的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，該方法適用于臨床樣本和活體培養(yǎng)物的檢測[38]。Yumiko于2016年優(yōu)化了LAMP診斷技術(shù)，證實靈敏性可達97.2%，特異性可達90.9%[39]。

6 結(jié)語

探索高效、精準、簡單易行的診斷技術(shù)，對牛支原體病的早期治療和控制、最大限度減免損失具有重大意義。針對不同的流行特點和實驗室條件，采用相應(yīng)診斷方法對牛支原體病的確診十分必要。細菌學(xué)方法是診斷金標準，但耗時長，靈感性差；血清抗體技術(shù)簡便快速，但由于牛支原體持續(xù)感染較普遍，檢測的特異性差；抗原檢測方法奇缺；分子生物學(xué)方法靈敏性高，但常需要預(yù)增菌，且因易污染而出現(xiàn)非特異性。配合使用多種方法，可有效補充各方法的不足，做到“早發(fā)現(xiàn)，早治療”；同時，尚需積極開發(fā)新型診斷標識，提高現(xiàn)有檢測方法的靈敏性和特異性。

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Research on Diagnostic Techniques of Mycoplasma bovis Associated Diseases

DONG Ya-qi1,3, ZHU Xi-fang2,3, LI Cheng1,3, CHEN Ying-yu2,3, SUO LANG Si-zhu1, GUO Ai-zhen2,3
(1.College of Animal Science and Technology, Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet, Linzhi 860000; 2.The State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070; 3.College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)

In recent years, Mycoplasma bovis (M.bovis) associated disease is continuously a great threat to beef and dairy cattle industry in the world. The rapid and accurate diagnostic techniques have been paid much attention in the control of this disease and minimize economic losses. With research making progress on Mycoplasma bovis detection, novel techniques are increasingly developed. In this study, based on the epidemiology, clinical symptons, bacteriology, immunology and molecular biology methods, we summarizes the diagnosis technology of M. bovis infectionn order to provide a reference to treatment and control of M.bovis associated diseases.

Mycoplasma bovis; Diagnosis; Mycoplasma; Pneumonia; Mastitis

S858.23

A

1004-4264（2017）08-0036-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.08.009

2016-10-27

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛、牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項經(jīng)費（CARS-38）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31272587）。

董亞旗（1990-），男，碩士研究生。

郭愛珍（1965-），女，教授，主要從事獸醫(yī)傳染病防控理論和技術(shù)研究工作。