霍志鵬，王 玉，周水平，馮 鋒

(1. 天士力控股集團(tuán)研究院，天津 300410； 2. 創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300410； 3. 中國藥科大學(xué)，南京 210009)

黃連生物堿成分的HPLC-DAD-MS分析

霍志鵬1,2，王 玉1,2，周水平1,2，馮 鋒3

(1. 天士力控股集團(tuán)研究院，天津 300410； 2. 創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300410； 3. 中國藥科大學(xué)，南京 210009)

目的：優(yōu)化測定黃連中生物堿成分的高效液相色譜法條件，并用LC-MS鑒定黃連中主要生物堿類成分。方法：使用Zorbax SB C18色譜柱，流動相A為乙腈，流動相B為水溶液(含20 mmol/L乙酸銨和0.5%乙酸)，梯度洗脫，檢測波長345 nm。聯(lián)用電噴霧-離子阱質(zhì)譜檢測器鑒定主要色譜峰的成分。結(jié)果：建立了測定黃連中黃連堿、巴馬汀和小檗堿三個成分含量HPLC方法，黃連堿、巴馬汀和小檗堿的線性范圍分別為0.042 0～0.840 μg、0.044 8～0.896 μg和0.050 2～1.004 μg；LC-MS鑒定了黃連中7個色譜峰。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，能用于控制黃連藥材及飲片的質(zhì)量，同時該方法使用溶解性好、易揮發(fā)的乙酸銨代替十二烷基硫酸鈉(SDS)做離子對試劑，適用于LC-MS分析。

黃連，高效液相色譜，黃連堿，鹽酸巴馬汀，小檗堿

黃連為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall) 的干燥根莖[1]，黃連中的主要活性成分原小檗堿類生物堿為季銨類生物堿。采用RP-HPLC測定黃連中生物堿類成分含量時，小檗堿類在C18為填料的色譜柱上保留行為較差，通常需在流動相中加入離子對試劑改善保留行為，常用的離子對試劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)[1, 2]，SDS有分子量大、難揮發(fā)不適用于LC-MS分析、易析出堵塞管路等缺點(diǎn)[2, 3]，有文獻(xiàn)在用三乙胺調(diào)節(jié)流動相pH值后LC-MS法分析黃連中生物堿[4]，但三乙胺進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)后殘留時間較長，很難清除。本實(shí)驗用分子量小、溶解性好、易揮發(fā)、質(zhì)譜中易清除的乙酸銨做HPLC流動相中的離子對試劑，建立了同時測定黃連中3個主要生物堿類成分的方法。測定了5批黃連藥材的含量，并采用HPLC-ESI-MS聯(lián)用方法鑒定了黃連中的主要生物堿類成分。以期為黃連及含黃連制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 鹽酸小檗堿對照品和鹽酸巴馬汀對照品(均購于中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110713-200609和110732-200506)，鹽酸黃連堿對照品(南京澤郎科技有限公司，批號200803)；乙腈為色譜純；乙酸銨、冰乙酸、甲醇為分析純；二純水為MilliQ純化水系統(tǒng)制備；黃連藥材(20101001)、黃連藥材(20101201)分別由天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司采購自重慶石柱，經(jīng)中國藥科大學(xué)馮鋒教授鑒定分別為黃連(CoptischinensisFranch)和三角葉黃連(CoptisdeltoideaC Y Cheng et Hsiao)；姜黃連(20101202)、酒黃連(20101203)、萸黃連(20101204)三種炮制品為黃連藥材(20101001)在天津市興達(dá)中藥材加工廠炮制加工而成。

1.2 儀器 BP-110S型電子天平(Sartorius)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore)，1100型高效液相色譜儀(Agilent)，LC/MSD Trap system(Agilent)， Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(Agilent)，IKA-MF10型粉碎機(jī)(IKA)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相A為乙腈，流動相B為20 mmol/L乙酸銨-0.5%醋酸水溶液，流速1.0 ml/min，梯度洗脫：0 min (A 10%)→10 min (A 15%)→15 min (A 28%)→30 min (A 32%)→35 min (A 32%)，分析時間為35 min，每次進(jìn)樣前用A 10%平衡10 min，柱溫30 ℃，檢測波長為345 nm[2]。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液配制 精密度稱取對照品適量，加甲醇配制成每ml含42.0 μg鹽酸黃連堿、44.8 μg鹽酸巴馬汀和50.2 μg鹽酸小檗堿的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶制備 黃連藥材或飲片粉碎后過二號篩，精密稱取約0.20 g藥材粉末，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入50 ml甲醇-鹽酸(100∶1)溶液，稱定重量，密塞，超聲30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶液補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密移取5.0 ml續(xù)濾液至50 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得[1]。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別吸取混合對照品、供試品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件檢測。對照品和供試品的色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿色譜峰的理論塔板數(shù)均不低于34 927；供試品中鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿與相鄰色譜峰的分離度分別為2.87、6.49和3.85，三個成分的分離度良好。見圖1。

1.鹽酸黃連堿 2.鹽酸巴馬汀 3.鹽酸小檗堿

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10和20 μl，按“2.1”項下色譜條件檢測，以對照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性方程見表1。

表1 三個生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μl按“2.1”項下色譜條件檢測，重復(fù)進(jìn)樣6次，6次進(jìn)樣峰面積的RSD黃連堿為0.87%，巴馬汀為0.91%，小檗堿為0.91%；出峰時間的RSD黃連堿為0.02%，巴馬汀為0.02%，小檗堿為0.03%，方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 稱取黃連粉末(批號20101001)0.2 g 按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液，分別于0、2、4、8、16和24 h進(jìn)樣10 μl，6次進(jìn)樣峰面積的RSD黃連堿為1.21%，巴馬汀為1.13%，小檗堿為1.06%，黃連供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取黃連粉末(批號20101001)6份，按上述供試品制備方法和HPLC方法檢測，6次含量測定得到3個成分含量的RSD黃連堿為2.34%，巴馬汀為1.90%，小檗堿為1.33%。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取對照品適量，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶液配置成每ml含0.055 2 mg鹽酸黃連堿、0.036 2 mg鹽酸巴馬汀和0.128 6 mg鹽酸小檗堿的加標(biāo)對照品溶液，精密稱取約0.10 g黃連藥材粉末加入錐形瓶，精密加入上述加標(biāo)對照品溶液50 ml，按“2.2.2”項下方法從“稱定重量，密塞”起制備加標(biāo)供試品溶液，平行6份，按上述方法檢測，計算回收率。鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率依次為98.7%、97.6%和102.3%，RSD依次為2.47%、2.10%和1.62%。

2.9 樣品測定 取黃連藥材兩批，3種黃連炮制品各一批，每批樣品平行兩份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測。黃連藥材及黃連三種炮制品的生物堿含量測定結(jié)果見表2，可見各樣品的生物堿含量差異較小，炮制對樣品中生物堿含量無明顯影響。

2.10 LC-DAD-ESI-MS分析方法 液相分析條件同“2.1”項，DAD檢測器記錄190～400 nm紫外吸收光譜；離子化方式為電噴霧離子化(ESI)，干燥氣體N2，流量12 L/min，霧化器壓力50 psi，脫溶劑干燥溫度350 ℃，質(zhì)譜檢測器為離子阱檢測器(Ion-Trap)，掃描范圍：m/z50～1 100。

表2 黃連及不同炮制品的生物堿含量

注：表中各生物堿的含量為以其鹽酸形式計算得到

2.11 LC-MS檢測樣品處理 稱取黃連粉末10 g，加入150 g純化水，稱定重量，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，加入純化水補(bǔ)足失重，濾紙過濾，精密移取續(xù)濾液1 ml置50 ml量瓶中，加純化水定容至刻度，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得樣品溶液。取樣品溶液10 μl按“2.10”項下方法檢測。

2.12 LC-DAD-ESI-MS檢定黃連中成分結(jié)果 樣品的紫外吸收色譜圖和總離子圖見圖2和圖3，本實(shí)驗中的HPLC方法對黃連中物質(zhì)的分離度和峰形良好。對主要色譜峰190～400 nm的吸收特征分析顯示黃連中7個峰分為兩類，1號峰(λmax=270，305 nm)吸收特征與木蘭花堿的吸收特征相似；2～7號峰分別在255～270 nm和345～360 nm之間有兩個最大吸收帶，吸收特征與小檗堿相似，見圖4。根據(jù)各高效液相色譜峰的紫外吸收和質(zhì)譜裂解規(guī)律，從7個色譜峰中鑒別出8個成分，見表3，包括一個阿樸啡類生物堿和7個原小檗堿類生物堿。

圖2 黃連水煎液UV圖(345 nm)

圖3 水提樣品的總離子流圖

圖4 1號峰和7號峰的紫外吸收圖

峰號化合物名分子離子峰m/z離子碎片m/zUVλmax(nm)1木蘭花堿342319，297，282，265，237220，270，3052四脫氫碎葉紫堇堿322307，292，279230，260，3573非防己堿338．2323，308，294，280230，262，3454表小檗堿336320，308，292，278240，270，345藥根堿338323，294240，270，3455黃連堿320292，290，276，262，249238，255，3586巴馬亭352337，322，308，294227，270，3457小檗堿336321，320，306，292，278230，262，346

圖5 峰1的質(zhì)譜圖

峰1，[M]+為342，[M-H+Na]+為364，有297 [M-CH4-NHCH2]+，282 [M-CH4-NHCH2-CH3]+，265[M-CH4-NHCH2-CH3-OH]+，237[M-CH4-NHCH2-CH3-OH-CO]+等離子碎片，見圖5。結(jié)合文獻(xiàn)報道的裂解規(guī)律和最大紫外吸收[5, 6]，可確定該峰為木蘭花堿[C20H24NO4]+，木蘭花堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖6。

圖6 木蘭花堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律圖

峰7，[M]+的m/z為336，有321 [M-CH3]+，320 [M-CH3-H]+， 306 [M-CH3-CH3]+，292 [M-CH3-H-CO]+，278 [M-CH3-CH3-CO]+等離子碎片，見圖7。峰7的分子量和小檗堿的分子量相同，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道的裂解規(guī)律和標(biāo)準(zhǔn)品比對確定該峰為小檗堿[C20H18NO4]+。小檗堿的斷裂規(guī)律見圖8，原小檗堿類化合物為同一母核，與小檗堿的斷裂規(guī)律相似。

圖7 峰7的質(zhì)譜圖

圖8 小檗堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律

峰2，[M]+的m/z為322，有307 [M-CH3]+，292 [M-CH3-H-CH2]+，279 [M-CH3-CO]+,根據(jù)文獻(xiàn)報道[7]的裂解規(guī)律鑒定為四脫氫碎葉紫堇堿(Tetradehydrocheilanthifoline) [C19H16NO4]+。峰3，[M]的m/z為338，有323 [M-CH3]+，308[M-CH3-CH3]+，294[M-CH3-H-CO]+，280 [M-CH3-CH3-CO]+等碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道鑒定為非防己堿[C20H20NO4]+。

峰4為兩個化合物共出峰，[M]+的m/z分別為336和338，峰4的主要的離子m/z為336，其二級離子譜顯示該離子有320 [M-CH3-H-CO]+，308 [M-CO]+，292 [M-CH3-H-CO]+，278 [M-CH3-CH3-CO]+等離子碎片，該分子離子峰與小檗堿分子量相同，斷裂規(guī)律與小檗堿相似，但出峰時間不同，鑒定為表小檗堿[C20H18NO4]+。在峰4的后半部分出現(xiàn)m/z338的離子，二級離子譜顯示該分子離子有323 [M-CH3]+，294 [M-CH3-H-CO]+等離子碎片，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道的裂解規(guī)律確定該分子離子為藥根堿[C20H20NO4]+。

峰5，[M]+的m/z為320，有292 [M-CO]+，290 [M-CH2O]+，277 [M-CH2O-CH]+，262 [M-CH2O-CO]+，249[M-CH2O-CH-CO]+等離子碎片，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道的裂解規(guī)律確定該峰為黃連堿[C19H14NO4]+。峰6，[M]+的m/z為352，有337[M-CH3]+，322 [M-CH3-CH3]+，308 [M-CH3-H-CO]+，294 [M-CH3-CH3-CO]+等離子碎片，峰6的分子量和巴馬汀相同，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道的裂解規(guī)律確定該峰為巴馬汀[C21H22NO4]+。黃連中原小檗堿類生物堿的母核見圖9。

圖9 黃連中原小檗堿類生物堿的母核

峰號 成分M+R1R2R3R42四脫氫碎葉紫堇堿322-H-CH3-CH2-3非防己堿338-CH3-H-CH3-CH34表小檗堿336-CH3-CH3-CH2-藥根堿338-H-CH3-CH3-CH35黃連堿320-CH2--CH2-6巴馬亭352-CH3-CH3-CH3-CH37小檗堿336-CH2--CH3-CH3

實(shí)驗中建立的分析方法能簡便、快速的鑒定黃連中的生物堿成分，證實(shí)了本文中用對照品對比得到的峰歸屬，為黃連藥材及含黃連的中藥復(fù)方制劑的成分分析和含量控制提供了可靠的實(shí)驗基礎(chǔ)。本實(shí)驗的方法對黃連中生物堿有良好的分離度和質(zhì)譜響應(yīng)，可能在黃連生物堿的藥物代謝分析上有很好的適用性。

3 討論

2010版《中國藥典》黃連含量測定項中流動相需添加0.4%SDS做離子對試劑[1]，SDS在流動相中的溶解性對溫度和有機(jī)相比例敏感，溫度降低或流動相比例發(fā)生變化都有可能析出堵塞管路[2, 3]， SDS具有對C18填料有改性作用、難揮發(fā)、不適合LC-MS分析等局限。本實(shí)驗使用分子量小、溶解度好、易揮發(fā)的乙酸銨代替SDS改善生物堿的分離度和峰形，可以避免以上問題。

實(shí)驗中比較了等度洗脫與梯度洗脫，梯度洗脫分離度較好；還比較了20 mmol/L醋酸銨，與100 mmol/L醋酸銨的區(qū)別，兩個濃度的分離度和線性范圍無顯著區(qū)別，所以選擇鹽濃度較低的20 mmol/L醋酸銨作為離子對試劑，使用梯度洗脫方法。

本實(shí)驗建立的方法能同時測定黃連中小檗堿、巴馬汀和黃連堿3個主要成分的含量。方法學(xué)考查結(jié)果顯示，該方法穩(wěn)定、可靠，可用于黃連及黃連炮制品質(zhì)量的控制和評價。實(shí)驗中還用HPLC-MS對黃連樣品進(jìn)行了分析，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到的峰歸屬結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比對相附，黃連藥材樣品中5、6、7號峰為純物質(zhì)峰，進(jìn)一步證明了本實(shí)驗中色譜方法的準(zhǔn)確性。相對于前人用醋酸-醋酸銨改善黃連生物堿分離效果的研究[7]，本方法分離度和峰形均有較大的改善，并測定了含量相對較多的黃連堿的含量。

本實(shí)驗的方法比2010版《中國藥典》中黃連項少測定了一個表小檗堿成分；但小檗堿、巴馬亭和黃連堿均為黃連中含量較多的生物堿，3個生物堿的含量之和占了黃連生物堿中的大部分，控制這3個成分的含量也能在很大程度上保障黃連及含黃連制劑的質(zhì)量。并且有多數(shù)含黃連的復(fù)方制劑在黃連生物堿中只需要控制小檗堿的含量。本實(shí)驗的方法有很大的應(yīng)用空間。

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Huo Zhipeng1,2, Wang Yu1,2, Zhou Shuiping1,2,Feng Feng3

(1. Tasly Academy, Tasly holding Group Co Ltd, Tianjin 300410;2. State Key Laboratory of Innovative Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300410;3. China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)

Objective： To optimize the RP-HPLC method for assaying the alkaloids inRhizomaCoptidis, and indentify main alkaloids by LC-MS. Method： A Zorbax SB C18column was used. Mobile phases A and B were acetonitrile and water solution with 20 mmol/L ammonium acetate and 0.5% glacial acetic acid. Gradient elution was employed for separation. The detecting wavelength was 345 nm. ESI-IonTrap mass detector was attached to the system for identifying of chromatography peaks . Results： The linear range of copsitine hydrochloride, palmatine hydrochloride and berberine were 0.042 0～0.840 μg, 0.044 8～0.896 μg and 0.050 2～1.004 μg, respectively. Seven compounds were identified by the method. Conclusions： The HPLC method established was simple, accurate and reliable, and can be used in quality control ofRhizomaCoptidis.

RhizomaCoptidis， HPLC-MS， copsitine hydrochloride， palmatine hydrochloride， berberine

2016-01-27

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2010ZX09401-406)

R927

A

1006-5687(2016)02-0008-05