秦忠宗 鄧一帆 祝剛 晏廣

(惠州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 惠州 516001)

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MicroRNA-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用研究

秦忠宗 鄧一帆 祝剛 晏廣

(惠州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 惠州 516001)

目的 觀察膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞表達(dá)miR-203后對(duì)其生物學(xué)特性的影響。方法 采用免疫磁珠分選出CD133+腫瘤干細(xì)胞，對(duì)其轉(zhuǎn)染并表達(dá)miR-203，免疫熒光染色檢測(cè)CD133等，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)巢蛋白(nestin)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和微管相關(guān)蛋白2(MAP2)表達(dá)以鑒定其多向分化能力，成球?qū)嶒?yàn)評(píng)價(jià)其自我更新能力；最后采用CCK-8和流式凋亡分別檢測(cè)miR-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果 培養(yǎng)并分選出的CD133+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞表達(dá)CD133和nestin標(biāo)記物，且分化后表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2，且CD133+細(xì)胞miR-203表達(dá)明顯低于CD133-細(xì)胞(P<0.05)；miR-203轉(zhuǎn)染兩個(gè)7 d后CD133+腫瘤干細(xì)胞的一、二次成球數(shù)目均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞的成球數(shù)(P<0.05)；進(jìn)一步實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)示miR-203轉(zhuǎn)染4 d后細(xì)胞CD133和nestin的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，而GFAP和MAP2的mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；miR-203轉(zhuǎn)染24，48，72，96和120 h后細(xì)胞存活率均明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)；進(jìn)一步流式檢測(cè)示miR-203細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 miR-203可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的分子治療靶點(diǎn)。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤； 干細(xì)胞； miR-203； 靶向治療

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生存預(yù)后較差的惡性腫瘤，治療后患者的生存期僅約為1年[1]。目前的研究[2]證明腫瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展和治療抵抗中可能發(fā)揮了重要作用。MicroRNA是一條23 nt的非編碼單鏈RNA，可與其靶向mRNA的3’末端非編碼區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)配對(duì)以下調(diào)基因表達(dá)，且已證明[3]其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。miR-203在多種腫瘤中表達(dá)降低，其可能是一種抑癌miRNA[4-6],再者，膠質(zhì)瘤患者中的miR-203低表達(dá)提示了預(yù)后不良。本研究旨在探討miR-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自我更新、多向分化能力、增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 原代培養(yǎng) 收集膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤組織于無(wú)菌離心管中，內(nèi)含Neurobasal干細(xì)胞培養(yǎng)基(1∶50 B27 vitaminA添加劑、20 μg/L重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20 μg/L重組人表皮生長(zhǎng)因子EGF、10 μg/L重組人白血病抑制因子、4 μ/L肝素和1∶100雙抗青霉素/鏈霉素)，去除壞死組織液及血液，剪成0.5 mm3并加入0.1%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min，吹打至單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后1 000 rpm離心5 min，加入紅細(xì)胞裂解液處理3 min，離心收集細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)。

1.2 分選CD133+干細(xì)胞并純度測(cè)定 觀察到懸浮細(xì)胞球達(dá)直徑150～200 μm時(shí)用免疫磁珠細(xì)胞分選試劑盒及分選器，嚴(yán)格按照說(shuō)明書行CD133的陽(yáng)性細(xì)胞分選。收集細(xì)胞，按200 μL/108細(xì)胞加入免疫磁珠細(xì)胞分選液，吹打至單細(xì)胞懸液，同時(shí)按100 μL/108細(xì)胞加入與微磁珠結(jié)合的CD133抗體，4 ℃中結(jié)合30 min，并按1 mL/108細(xì)胞加入分選液清洗細(xì)胞，離心后棄上清收集細(xì)胞且按500 μL/108細(xì)胞加入分選液重懸；將結(jié)合作用后的細(xì)胞懸液加入分離柱中，加入2 mL分選液抽提，以沖洗出CD133陽(yáng)性細(xì)胞。分選出的CD133陽(yáng)性和陰性細(xì)胞分別加入50 μL CD133/2(293C3)-PE抗體或50 μL同型對(duì)照mIgG2b-PE抗體，流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)行純度測(cè)定。

1.3 分子鑒定 免疫熒光染色檢測(cè)分選后細(xì)胞CD133、nestin的表達(dá)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，檢測(cè)分化后細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元的標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2(MAP2)的表達(dá)。

1.4 miR-203轉(zhuǎn)染 人成熟miR-203與其對(duì)照的無(wú)意義寡核苷酸鏈(NC)嚴(yán)格按照使用說(shuō)明轉(zhuǎn)染CD133+干細(xì)胞。將帶有紅色熒光標(biāo)記的miR-203和NC分別轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48 h，RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞的miR-203的表達(dá)。

1.5 成球?qū)嶒?yàn) 在轉(zhuǎn)染miR-203和NC后，吹打至單細(xì)胞懸液并以1 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度于96孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中7 d后，對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以記錄形成的一次成球數(shù)目。再收集每個(gè)孔的細(xì)胞球，輕柔反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，再次轉(zhuǎn)染且計(jì)數(shù)，同樣按1 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度于96孔板中再培養(yǎng)7 d后，計(jì)數(shù)每個(gè)孔形成的二次成球數(shù)目。

1.6 轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-203和NC 4 d后，抽提細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為：27 ℃，9 min；37 ℃，120 min；85 ℃，5 min；最后降至4 ℃，cDNA保存于-80 ℃冰箱。使用熒光染料法進(jìn)行mRNA的定量測(cè)定，嚴(yán)格按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)為：93 ℃，4 min預(yù)變性；93 ℃，20 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 sec；共循環(huán)40次。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及凋亡實(shí)驗(yàn) 收集分選鑒定后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，以10 000個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別轉(zhuǎn)染miR-203和無(wú)意義寡核苷酸鏈NC，在轉(zhuǎn)染后的24，48，72，96，120 h，采用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖活性的測(cè)定，并采用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-203和NC 3 d后細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，Cell Quest分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)、分選與鑒定 將收集的原代細(xì)胞置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中約3～5 d后可見形成懸浮細(xì)胞球，并經(jīng)免疫磁珠法分選得CD133+細(xì)胞，將細(xì)胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3～5 d后形成神經(jīng)干細(xì)胞樣的細(xì)胞球(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤球)，7～9 d后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤球呈圓形或卵圓形，邊緣清楚光滑，折光性較好。免疫熒光染色示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞廣泛表達(dá)CD133和Nestin兩種干細(xì)胞標(biāo)記物(圖1A～B)，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化后細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2(圖1C～D)。

2.2 miR-203在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)示CD133-細(xì)胞中miR-203的表達(dá)較CD133+細(xì)胞顯著性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)CD133+干細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，得到miR-203組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(72.11±15.83)%；RT-PCR檢測(cè)示轉(zhuǎn)染miR-203組細(xì)胞的miR-203表達(dá)為NC組的(74.21±10.76)倍(n=3，P<0.05)。

2.3 miR-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自我更新能力的影響 CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染7 d后miR-203組細(xì)胞球形成數(shù)量較少，體積也較小，按NC組細(xì)胞球數(shù)目為100%計(jì)算，一次成球miR-203組細(xì)胞球數(shù)目為(52.34±15.19)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.05)，二次成球miR-203組細(xì)胞球數(shù)目為(30.15 ± 9.27)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.05)。

2.4 miR-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞多向分化能力的影響 CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4 d，定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-203和NC兩組細(xì)胞的CD133、nestin、GFAP、MAP2的mRNA表達(dá)情況，與NC組比較，miR-203組細(xì)胞的CD133和nestin的mRNA表達(dá)明顯降低，GFAP和MAP2的mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 miR-203對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與NC組比較，CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-203組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率均顯著性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。其中最小的細(xì)胞生存率出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后72 h。與NC組(4.10±0.28)%比較，流式細(xì)胞儀檢測(cè)示轉(zhuǎn)染miR-203組的細(xì)胞凋亡率(11.87±1.66)%明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

本研究首先從人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的原位腫瘤組織中分離、培養(yǎng)、分選和鑒定得到了CD133陽(yáng)性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，且可形成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤球，并可表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和nestin，也可誘導(dǎo)分化表達(dá)GFAP和MAP；再者，在CD133陽(yáng)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中， miR-203均呈低表達(dá)狀態(tài)，這提示了miR-203的低表達(dá)可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的分子特征之一。某些miRNA的特異性表達(dá)可能代表著膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的不同起源，不同的miRNAs表達(dá)譜也就代表著膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的特有表型[7]。在進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-203可以逆向調(diào)節(jié)著膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的特性，轉(zhuǎn)染miR-203后干細(xì)胞的自我更新能力受限，再有miR-203促進(jìn)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，并且可以抑制增殖和促進(jìn)凋亡。研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-203在U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中可以直接靶向作用于PLD2發(fā)揮其抑癌作用。目前PLD2基因的生物學(xué)作用逐漸被揭示，在HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PLD2增高可以激活ERK和p38 MAPK信號(hào)通路，且可以提高抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)以發(fā)揮其促癌作用。再者，PLD2在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中可以通過(guò)激活活性氧和p38 MAPK通路提高COX-2的表達(dá)發(fā)揮作用。

注：A.CD133+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)；B.Nestin陽(yáng)性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)；C.GFAP陽(yáng)性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)；D：MAP2陽(yáng)性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)。圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

基于ARIMA模型的貴陽(yáng)市云巖區(qū)手足口病預(yù)測(cè)分析

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