張玥 羅俊 黃能慧 張小毅

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

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靈芝三萜類化合物對(duì)AD大鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40的影響

張玥 羅俊△黃能慧 張小毅

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 研究靈芝三萜類化合物(GLT)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40表達(dá)的影響。方法 將自然衰老模型大鼠60只隨機(jī)均分為六組：模型組，GLT低、中、高劑量組，溶媒對(duì)照組(食用油)及陽性對(duì)照組(健腦膠囊)，5個(gè)月齡大鼠10只為正常對(duì)照組。連續(xù)灌胃給藥60 d后，免疫組化法檢測(cè)海馬Aβ1-40表達(dá)。結(jié)果 模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40表達(dá)增多，GLT組Aβ1-40表達(dá)減少。結(jié)論 GLT有防治AD的作用，其作用機(jī)制可能與減輕Aβ的神經(jīng)毒性以及減少腦內(nèi)Aβ沉積有關(guān)。

靈芝三萜類化合物； 阿爾茨海默病； 自然衰老； β-淀粉樣肽

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為僅次于心血管疾病、腫瘤、腦卒中的第4位死因。AD起病潛隱，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能減退等[1]。AD病因不明，缺乏有效的防治手段。除了使用腦細(xì)胞代謝激活劑和其他一些藥物外，對(duì)該病的中藥治療也開始研究[2]。本課題組曾在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用靈芝主要有效成分GLT(ganoderma Lucidum triterpenoids)進(jìn)行防治AD的研究。本文擬觀察GLT對(duì)AD模型大鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40(β-Amyloid1-40)表達(dá)的影響，以深入探討其防治AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 GLT(中科院地化所提取)，健腦膠囊(JNJN，青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)公司)，ANTI-β-Amyloid(1-40)(武漢 BOSTER公司)，BIOMIAS-99圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)。SD大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組及方法 取24月齡大鼠100只，5月齡大鼠10只，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以后者逃避潛伏期均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)，24月齡大鼠大于該值的為AD大鼠[3]。篩選出的60只AD大鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，雌雄各半。1次/d灌胃給藥，連續(xù)60 d。模型組(NS 10 mL/kg)、溶媒對(duì)照組(食用油 10 mL/kg)、GLT低、中、高劑量組(0.25g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)及陽性對(duì)照組(JNJN 0.38 g/kg)。5月齡大鼠為正常對(duì)照組(NS 10 mL/kg)。

給藥結(jié)束后迅速于冰臺(tái)上0 ℃下斷頭取出大腦。取視交叉后5 mm厚的冠狀位腦片(包含海馬)，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，用于分析海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40的表達(dá)水平(按試劑盒操作)。用BIOMIAS-99圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(400倍)，每個(gè)視野選取5個(gè)陽性表達(dá)區(qū)域，測(cè)量平均灰度值(mean gradation，MG)，以5個(gè)視野MG平均值代表其陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

模型組大鼠的海馬神經(jīng)元胞漿呈深染棕黃色顆粒狀改變，經(jīng)圖像分析測(cè)定，模型組MG(81.82±3.80)及溶媒組MG(84.71±4.52)較正常對(duì)照組MG(190.56±4.68)顯著降低(P<0.01)，提示Aβ1-40的表達(dá)增多，神經(jīng)毒性增強(qiáng)；與模型組比較，GLT低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿呈淺染棕黃色顆粒狀改變，GLT低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組MG較模型組顯著增高(P<0.01)，分別為(124.74±4.31)、(149.97±5.73)、(177.57±5.91)、(88.11±4.48)，提示Aβ1-40的表達(dá)減少，神經(jīng)毒性減弱，見圖1。

圖1 GLT對(duì)自然衰老模型大鼠海馬Aβ1-40表達(dá)的影響 (×400)

3 討 論

AD的發(fā)病機(jī)制據(jù)研究可能與腦內(nèi)Aβ沉積、膽堿能傳遞功能紊亂、自由基損傷等因素有關(guān)。AD是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)代謝紊亂，Aβ是負(fù)面效應(yīng)的核心分子。習(xí)慣所稱靈芝屬中赤芝的子實(shí)體部分。靈芝具有廣泛的藥理活性，主要有效成分之一是GLT[4-6]，本文旨在觀察GLT對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞Aβ1-40的影響，研究該藥對(duì)AD有無防治功能，并探討其可能的作用機(jī)制。

AD的病理學(xué)改變有老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、大量神經(jīng)元丟失及顆粒空泡變性等，聚集的Aβ具有神經(jīng)毒性作用，Aβ沉積是AD的主要發(fā)病因素[7]。建立理想的模型是研究的重要環(huán)節(jié)，而本研究采用自然衰老認(rèn)知障礙模型，更符合衰老因素在AD發(fā)病過程中的重要作用[8]，在組織病理學(xué)以及神經(jīng)生物化學(xué)變化方面模擬出與AD相似的特征。本研究結(jié)果表明：與正常對(duì)照組相比，自然衰老模型大鼠海馬神經(jīng)元胞漿呈深染棕黃色顆粒狀改變，Aβ1-40表達(dá)明顯增多，神經(jīng)毒性增強(qiáng)。Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)及前體類似物等經(jīng)蛋白酶分解后的產(chǎn)物，APP是存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，廣泛存在于各種組織中，但只有在神經(jīng)元中，APP才易裂解產(chǎn)生Aβ。正常代謝情況下APP被α分泌酶水解，生成可溶性分泌型APP(sAPPα)，sAPPα可以保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒素和氧化反應(yīng)損傷；異常情況下，β分泌酶裂解APP產(chǎn)生一個(gè)sAPPβ片段，剩下的羧基端肽段在γ分泌酶作用下產(chǎn)生Aβ(80%～90%的Aβ1-40和10%～20%的Aβ1-42)。產(chǎn)生的Aβ，其1/3左右的序列位于APP的跨膜結(jié)構(gòu)域，由于其跨膜區(qū)的疏水性，使Aβ易于聚集沉積導(dǎo)致SP出現(xiàn)[9]。予GLT灌胃兩個(gè)月后，與模型組比較，GLT低、中、高劑量組及陽性藥組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿呈淺染棕黃色顆粒狀改變，Aβ1-40表達(dá)減少，神經(jīng)毒性減弱，提示GLT有一定程度的對(duì)抗Aβ神經(jīng)損傷的作用。本文結(jié)果表明GLT有防治AD的作用，其作用機(jī)制可能與減輕Aβ的神經(jīng)毒性以及減少腦內(nèi)Aβ沉積有關(guān)。

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Effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer disease of the model animals through Ganoderma Lucidum Triterpenoids

ZhangYue,LuoJun,HuangNenghui，ZhangXiaoyi.

DepartmentofPharmachology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China

Objective To observe the effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer Disease (AD) of model animals by used the Ganoderma Lucidum Triterpenoids (GLT).Methods 60 natural aging rats were randomly divided into 6 groups which were GLT low dose group, GLT middle dose group, GLT high dose group, model group, solvent group (oil), and positive group (JNJN). Then the intragastric administration was used. After being treated with GLT for 60 days, the expression of Aβ1-40in hippocampus was tested by immunohistochemistry.Results The expression of Aβ1-40in hippocampus increased in model rats, while GLT group significantly decreased. Conclusion GLT can protect AD model animals, and the following mechanisms may be decreasing the deposition of Aβ.

Ganoderma Lucidum Triterpenoids; Alzheimer disease; Natural aging; β-Amyloid

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(V200801);貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合2004NGY031);貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金(2005293)

R285.5

A

1000-744X(2016)07-0681-02

2016-04-25)

△通信作者