唐曉媛，劉志春，馬廉蘭，張文平，王潤秀

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

具有莢膜的白假絲酵母菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析*

唐曉媛1，劉志春，馬廉蘭，張文平，王潤秀1

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

目的：研究從淋病患者陰道分泌物中分離鑒定的具有莢膜的白假絲酵母菌蛋白質(zhì)組學(xué)特征。方法：采用二維凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分離從淋病患者陰道分泌物中分離鑒定的具有莢膜的白假絲酵母菌(C1-4)和無莢膜的白假絲酵母菌(ATCC14053)的菌體蛋白質(zhì)，用ImageMaster 2D platinum 7.0軟件識(shí)別差異蛋白點(diǎn)，MALDI-TOF-MS鑒定差異蛋白。結(jié)果：C1-4與ATCC14053相比，顯著差異表達(dá)蛋白點(diǎn)232個(gè)，其中180種蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，52種蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，質(zhì)譜鑒定了32差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，8個(gè)得到鑒定，均在C1-4菌株顯著表達(dá)。結(jié)論：具有莢膜的白假絲酵母菌與無莢膜的白假絲酵母菌菌株相比，蛋白質(zhì)表達(dá)存在明顯差異。

白假絲酵母菌；莢膜；蛋白質(zhì)組學(xué)；2-DE；MALDI-TOF-MS

白假絲酵母菌(Candidaalbicans)為人類最常見的機(jī)會(huì)致病性真菌[1]。馬廉蘭等[2-3]從性病患者分泌物分離及鑒定了多株具有莢膜的白假絲酵母菌，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)具有莢膜的白假絲酵母菌與無莢膜的白假絲酵母菌在致病性、藥物敏感性等方面存在明顯的差異[4-5]，提示莢膜結(jié)構(gòu)與白假絲酵母菌的致病性密切相關(guān)，但目前國內(nèi)外對(duì)白假絲酵母菌莢膜的形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)成分等方面還未闡明。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)比分析具有莢膜的白假絲酵母菌和無莢膜的白假絲酵母菌蛋白質(zhì)表達(dá)水平的

差異，為進(jìn)一步闡明白假絲酵母菌莢膜形成機(jī)制及致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 白假絲酵母菌國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC14053)由北大醫(yī)院真菌保藏中心(北京)提供，具有莢膜的白假絲酵母菌由本課題組從臨床分離并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所鑒定，編號(hào)為C1-4。

1.1.2 主要儀器 酵母蛋白抽提試劑(康為世紀(jì)公司)，固相 pH 梯度干膠條 (IPGs，pH=3～10，GE)，乙腈(Fisher)，N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、碳酸氫銨購自Sigma，胰酶、三氟乙酸購自Promega，過硫酸胺 (AP)、二硫蘇糖醇(DTT)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基胺基甲烷 (Tris)、丙烯酰胺(Acylamide)、尿素、甘氨酸、 甘油等均購自Amersham，十二烷基磺酸鈉 (SDS)購自Promega， 溴酚藍(lán)(BPB)、考馬斯亮藍(lán)R-250等購自Bio Basic Inc，其余均為國產(chǎn)分析純或色譜純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器 冷凍離心機(jī)(H5050R,湘儀)，超聲儀(JY96-Ⅱn,寧波新芝生物科技股份有限公司)，分光光度計(jì)(318C+,上海沛歐)，等電聚焦儀(ETTAN IPGphor3,GE)，凝膠圖像掃描儀(ScanMaker i800,MICROTEK)，凝膠圖像分析軟件(ImageMaster 2D platinum 5.0,GE)，質(zhì)譜儀(Ultraflex III TOF/TOF)及分析軟件購自德國Bruker Dalton公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白樣品制備 分別取白假絲酵母菌C1-4、ATCC14053接種至SDA液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩(120 rpm)培養(yǎng)48 h， 2 000×g離心5 min收集培養(yǎng)物，預(yù)冷PBS(pH 7.4)洗滌3遍。每個(gè)樣本加入酵母蛋白抽提試劑(使用前加入PMSF，終濃度1 mM)，按照每50 mg樣本加入500 μL試劑，冰浴20 min，超聲破碎，然后13 400×g離心10 min取上清，加入4倍體積冷丙酮(-20 ℃)沉淀過夜。第二天13 400×g離心20 min，去上清，風(fēng)干丙酮得蛋白團(tuán)塊，裂解液溶解后超濾至體積100 μL，加500 μL裂解液，再超濾，重復(fù)3次。利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 二維凝膠電泳 操作步驟主要按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。吸取相應(yīng)量的蛋白質(zhì)與水化液(8 mol·L-1尿素、1%DTT、40 mmol·L-1Tris、1%IPG pH 3～10緩沖液、1×BPB)混合至總體積為460 μL，水化12 h后進(jìn)行等電聚焦(500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 7 h)。等電聚集結(jié)束取出膠條并放入平衡管中，先后用10 mL平衡A液(50 mmol·L-1Tris-HCI pH 8.8、6 mmol·L-1尿素、30%甘油、0.2%DTT、1×BPB)和10 mL平衡B液(50 mmol·L-1Tris-HCI pH 8.8、6 mmol·L-1尿素、30%甘油、3%碘乙酰胺、1×BPB溴酚藍(lán))各平衡15 min。平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5%SDS-PAGE膠上端進(jìn)行第二向垂直電泳，電泳結(jié)束后取膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 凝膠圖像分析 應(yīng)用掃描儀以及軟件掃描考馬斯亮藍(lán)染膠獲取圖像，ImageMaster 2D platinum 5.0軟件比較分析具有莢膜的白假絲酵母菌與無莢膜的白假絲酵母菌的蛋白二維電泳圖譜的差異，選取表達(dá)水平相差5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.4 質(zhì)譜分析與鑒定 從膠中切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)于0.5 mL EP管中， 50%甲醇120 μL(5 mL甲醇和50 mM 碳酸氫銨)脫色30 min， 50%乙腈 100 μL和100 mmol·L-1碳酸氫銨50 μL脫水30 min，冷凍抽干。加入20 ng·μL-1胰蛋白酶的4～8 μL，冰上吸脹60 min。吸去多余的胰酶，加入10 μL覆蓋液(10%乙腈和50 mM碳酸氫銨)，37 ℃酶解12 h。取出酶切完的膠粒超聲處理15 min，吸出覆蓋液至0.5 mL EP管，加入60 μL抽提液(90%乙腈和2.5%三氟乙酸)脫水10 min。吸出抽提液至0.5 mL EP管，真空干燥。制備好的樣品加入1.5 μL重溶液(30%乙腈和0.1%三氟乙酸)充分溶解肽段后揮發(fā)至原體積的1/3，加入0.5 μL基質(zhì)，在質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，測(cè)出各個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽指紋圖譜。參數(shù)：UV波長為355 nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da，掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da。測(cè)定結(jié)果利用Mascot軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 二維凝膠電泳及圖像分析 實(shí)驗(yàn)中用相同的條件通過3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)分別提取了C1-4和ATCC14053處理后樣本的全組蛋白，建立了重復(fù)性、分辨率較高的白假絲酵母菌全組蛋白2-DE圖譜，通過專業(yè)2-DE圖像處理軟件和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，C1-4與ATCC14053相比，顯著差異蛋白點(diǎn)232個(gè)，其中180種蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，52種蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖1)。

2.2 差異蛋白質(zhì)譜分析 從膠中切取32個(gè)差異蛋白點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析，利用Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，如果Mascot分?jǐn)?shù)>20分(P<0.05)則認(rèn)為得到鑒定，否則視為未得到鑒定(圖2)。在32個(gè)差異蛋白點(diǎn)中有8個(gè)點(diǎn)得到鑒定，即Possible sphingolipid long chain base sensory protein、14-3-3 protein homolog、Prohibitin、Thiamine thiazole synthase、Enolase 1、Protein BOB1、Spermidine synthase、Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，在C1-4中的表達(dá)水平均高于ATCC14053。這些差異蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息見表1。

A: C1-4, 180 proteins were significantly higher than that in ATCC14053 labeled with number,B: ATCC14053, 52 proteins were significantly higher than that in C1-4 labeled with number.

Fig.1 2-DE maps of proteins fromCandidaalbicans

圖1 白假絲酵母菌的二維凝膠電泳

A:Mascot search results and protein view of spot 1 B:Mascot database query result and scores of spot 1.

Table 1 Differential proteins dentified by MALDI-TOF-MS

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用有助于更全面地理解蛋白質(zhì)生物學(xué)行為的方式和過程 ，更深入地研究細(xì)胞的調(diào)控及各種生物學(xué)效應(yīng)，該技術(shù)已應(yīng)用于白假絲酵母菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分組成、致病性、免疫性、菌株基因突變、藥物敏感性等方面研究[6-11]。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)分析具有莢膜的白假絲酵母菌和無莢膜的白假絲酵母菌的全組蛋白質(zhì)差異，結(jié)果顯示它們之間的蛋白質(zhì)表達(dá)水平存在明顯的差異，質(zhì)譜鑒定出8個(gè)差異蛋白。

14-3-3蛋白是一個(gè)在真核生物中廣泛表達(dá)的高度保守的酸性蛋白家族，由不同基因編碼，主要以同源/異源二聚體形式存在[12]，該蛋白在酵母菌又稱為BMH1，與白假絲酵母菌生長繁殖、碳代謝、毒力等密切相關(guān)[13-15]。prohibitin廣泛分布于細(xì)菌、植物、酵母、原蟲及哺乳類等各種生物細(xì)胞中，且具有高度的同源性，為一類新型的分子伴侶蛋白，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、新陳代謝、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮著重要作用[16]。烯醇化酶(Enolase 1)是糖酵解所必需的胞內(nèi)酶，廣泛存在于真菌細(xì)胞中，含量豐富且高度保守，可刺激人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，為真菌感染的常用檢測(cè)指標(biāo)，也應(yīng)用于疫苗研究[17-18]。Spermidine synthase屬于氨丙基轉(zhuǎn)移酶家族，是包括腐胺、亞精胺和精胺在內(nèi)的多胺家族合成過程中的重要調(diào)節(jié)酶，且精胺廣泛存在動(dòng)植物組織中、某些真菌和細(xì)菌中，對(duì)動(dòng)物的正常生長繁殖是必要的，但Spermidine synthase在真菌和細(xì)菌中的功能目前還不是很清楚[19]。BOB1蛋白為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，是B 細(xì)胞正常發(fā)育和免疫應(yīng)答必不可少的蛋白質(zhì)分子，在DNA復(fù)制過程中起著調(diào)控作用[20-21]。Thiamine thiazole synthase是合成硫胺素(維生系B1)的關(guān)鍵酶，在酵母線粒體DNA抗損傷方面起重要作用[22]。Possible sphingolipid long chain base sensory protein在真菌方面的功能目前不太清楚。

綜上所述，本研究質(zhì)譜鑒定的8個(gè)差異蛋白與白假絲酵母菌的生長繁殖、新陳代謝、致病性、免疫性等密切相關(guān)，均在有莢膜的白假絲酵母菌高表達(dá)，且有研究證實(shí)具有莢膜的白假絲酵母菌致病力強(qiáng)，并與莢膜厚度密切相關(guān)[4]，提示這些蛋白質(zhì)可能與白假絲酵母菌的莢膜形成密切相關(guān)，間接地參與了白假絲酵母菌的致病。至于這些蛋白質(zhì)如何參與白假絲酵母菌的莢膜形成以及致病有待進(jìn)一步研究。

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Proteomic Analysis of Candida Albicans with Capsule

TANGXiao-yuan1,LIUZhi-chun2,MALian-lan2,ZHANGWen-ping2,WANGRun-xiu1

(1.ThefirstaffiliatedhospitalofGannanMedicalUniversity; 2.GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To study the proteomic characteristics of candida albicans with capsule isolated from vaginal secretions of gonorrhea patients. Methods: Two-dimensional gel electrophoresis(2-DE) was performed to separate proteins from candida albicans with capsule (C1-4) isolated from vaginal secretions of gonorrhea patients and the standard strain of candida albicans with no capsule(ATCC14053) respectively. ImageMaster 2D platinum 7.0 software was used to analyze 2-DE images and the differential protein spots between C1-4 and ATCC14053 were identified by MALDI-TOF-MS. Results: Campared with ATCC14053, 232 differential protein spots in C1-4 were detected; 180 proteins were significantly higher than that in ATCC14053; 8 proteins of which were identified by MALDI-TOF-MS; 52 proteins were significantly lower than that in ATCC14053. Conclusion: The protein expression of candida albicans with capsule was significantly different campared with candida albicans with no capsule.

Candida albicans; Capsule; Proteomics; 2-DE; MALDI-TOF-MS

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20114BAB215023);江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ10573、GJJ12550)

劉志春,男，碩士研究生，副教授，研究方向：醫(yī)學(xué)真菌學(xué)。E-mail:lzc_96294@163.com

R379

A

1001-5779(2016)06-0864-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.008

2016-01-21)(責(zé)任編輯：敖慧斌)