朱曄斌+朱曄君+李淑珍

[摘 要] 目的 研究異常血流應(yīng)力或壓力單獨作用對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號傳導(dǎo)通路及下游炎癥因子：血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）及血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）等的影響，探討異常血流動力導(dǎo)致動脈粥樣硬化的機制。方法 將生長良好的HUVECs以1×105個/ml密度接種于細(xì)胞綜合應(yīng)力刺激實驗系統(tǒng)（型號BIO-CCS13）中進行干預(yù)。將HUVECs按所受的應(yīng)力不同分成應(yīng)力組、壓力組和正常組。在各組應(yīng)力作用下培養(yǎng)一天后收集細(xì)胞備用，用qPCR方法測定TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6）、血凝素樣氧化低密度酯蛋白受體-1（LOX-1）、核因子-κB（NF-κB）、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表達，用蛋白質(zhì)印跡方法測定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表達。結(jié)果 與正常組比較，應(yīng)力組和壓力組TLR4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達水平顯著升高（P<0.01），TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 異常血流動力導(dǎo)致動脈粥樣硬化的機制可能與激活TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路和增強下游炎癥因子：LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體4；壁面壓力；張應(yīng)力；壁面切應(yīng)力；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R331 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-816X（2016）06-0415-04

[Abstract] Objective To study the effect of abnormal blood flow stress or pressure solely on expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4）/NF-κB signaling pathway and downstream inflammatory factors in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）， namely lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 （LOX-1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1）， vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）， as well as its possible mechanisms leading to atherosclerosis. Methods The HUVECs were divided into stress group， pressure group and normal group according to the different stresses. The 4th， 5th generation of HUVECs were inoculated in the cell synthetic stress stimulation test system （model bio-ccs13） at 1×105 cells/ml. The cells were collected respectively 24 hours after the stress of each group. The gene expressions of TLR4， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 （TRAF-6）， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 were detected by qPCR， and the protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， ICAM-1 and VCAM-1 by Western blot. Results Compared with the normal group， mRNA expressions of TLR4， MyD88， TRAF-6， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 increased significantly （P<0.01） in the stress group and pressure group； protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 also increased significantly （P<0.01）. The difference was statistically significant. Conclusions The mechanism of abnormal blood flow stress or pressure leading to atherosclerosis might be associated with the activation of TLR4/NF-κB signal transduction pathway and the enhancement of its downstream inflammatory factors， such as the expressions of LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1.

[Key words] Toll like receptor 4；wall pressure；circumferential strain；wall shear stress；Atherosclerosis

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種常見的大中動脈發(fā)生粥樣病變性疾病。它的發(fā)病機制目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、慢性炎癥有密切的關(guān)系。實驗研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）能夠促進血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）合成與釋放炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。而動脈壁的多種細(xì)胞都能表達Toll樣受體（TLRs）如：內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等，這些細(xì)胞的TLR4被激活后可引發(fā)炎癥反應(yīng)。在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、慢性炎癥導(dǎo)致AS的發(fā)病機制中TLR4扮演著重要角色[1]。目前的研究表明：AS的發(fā)生和發(fā)展與EC的結(jié)構(gòu)和功能變化有著密切的關(guān)系。EC在體內(nèi)不斷地受到血流動力作用。這些力可分為由血管內(nèi)流體靜力所產(chǎn)生的壁面壓力（WP），由EC間的聯(lián)接在血管舒縮運動過程中產(chǎn)生的張應(yīng)力（CS），以及由血液流動所產(chǎn)生的壁面切應(yīng)力（WSS）。適當(dāng)?shù)膽?yīng)力對于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞正常的生理功能必不可少，但如果應(yīng)力和壓力變化超過域值（如應(yīng)力大，壓力小或應(yīng)力小，壓力大），內(nèi)皮細(xì)胞會發(fā)生病變，導(dǎo)致AS[2]。

異常血流動力能否通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4/核因子-κB（NF-κB）信號傳導(dǎo)通路，促進下游炎癥因子的生成，來影響AS炎癥反應(yīng)的發(fā)展。目前，尚無這方面的相關(guān)報道[3]。本實驗通過觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在應(yīng)力（為切應(yīng)力和張應(yīng)力之和）或壓力的單獨作用下，對血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路及下游的炎癥因子表達的影響，從血管內(nèi)皮細(xì)胞所受作用力的角度探討AS的發(fā)病機制，為闡明異常血流動力導(dǎo)致AS的可能機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304（上海豐壽生物科技有限公司）。

1.2 試劑及儀器：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司，PCR引物（上海生物工程技術(shù)有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），TLR4、NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）及血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）因子一抗和羊抗兔抗體（二抗）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Hema9600基因擴增儀、GSG-2000核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。細(xì)胞綜合應(yīng)力刺激實驗系統(tǒng)（型號BIO-CCS13）：3Think公司。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)與分組：將HUVECs株ECV-304于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用含10%FBS的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代至4～5代，將細(xì)胞以1×105個/ml接種于細(xì)胞綜合應(yīng)力刺激實驗系統(tǒng)（型號BIO-CCS13）中，待細(xì)胞生長良好時隨機將HUVECs按所受的應(yīng)力和壓力不同分成應(yīng)力組、壓力組和正常組，每組12孔。對應(yīng)力組HUVECs施加20dyne/cm2的切應(yīng)力和15%應(yīng)變量的張應(yīng)力。對壓力組HUVECs施加12.0kPa的壓應(yīng)力。對正常組HUVECs施加20dyne/cm2的切應(yīng)力、15%應(yīng)變量的張應(yīng)力和12.0kPa的壓應(yīng)力（接近正常生理時血管內(nèi)皮細(xì)胞所受的力）[4]。應(yīng)力組、壓力組和正常組在各自應(yīng)力的持續(xù)作用下，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，以用于后續(xù)實驗。

1.4 TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TRAF-6）、NF-κB、TNF-α、LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA的檢測：采用qPCR的方法檢測其mRNA的表達。收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA后檢測純度和完整性，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA、PCR儀擴增目的基因觀察結(jié)果。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性7min，30個循環(huán)（95℃、45s，57℃、30s，72℃、40s），72℃延伸3min。PCR引物使用Primer5.0引物設(shè)計軟件從Gene Bank獲得，以GAPDH為內(nèi)參。由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。電泳結(jié)束后由GSG-2000核酸凝膠圖像分析系統(tǒng)計算得出Ct值，用2-△△Ct方法計算和統(tǒng)計。△△Ct（實驗對照組-空白對照組）=△Ct（實驗對照組）-△Ct（空白對照組）。

1.5 TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達檢測：采用Western blot法檢測目標(biāo)蛋白的表達。以1×106個/ml濃度收集細(xì)胞，用含PMSF（100mM）的裂解液，于冰上裂解30min，離心取上清分裝置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA法測定樣品蛋白濃度，以每泳道60μg樣品蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，將分離膠中樣品蛋白于電轉(zhuǎn)移槽中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加適當(dāng)濃度一抗，室溫孵育1.5h，用TBST在脫色搖床上洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的適當(dāng)濃度的二抗，置室溫1h后用TBST洗滌2次，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、顯影、定影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理：全部實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用（x -±s）表示，資料服從正態(tài)分布，直接采用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路各因子mRNA表達水平比較：見表2。與正常組比較，應(yīng)力組和壓力組各因子mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 三組中TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達水平比較：見表3。與正常組比較，壓力組和應(yīng)力組TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

TLRs屬于I型跨膜蛋白模式識別受體，可表達于多種人類體細(xì)胞表面，HUVECs高度表達TLR4。TLRs通過跨膜信號傳遞作用介導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，在細(xì)胞跨膜活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要作用。TLRs通過調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答而將二者緊密聯(lián)系[5，6]，TLRs中，TLR4研究的最多且與AS的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系最密切。

進一步研究表明激活EC和平滑肌細(xì)胞膜表面的TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路可以誘導(dǎo)其合成與釋放大量的與AS相關(guān)的炎癥因子，這些炎癥因子促進AS的發(fā)生，而且在AS斑塊中TLR4顯著高表達[7]。與此同時，TLR4還可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，同時強烈增殖平滑肌細(xì)胞[8]，進入內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后就形成了泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞過度增殖和泡沫細(xì)胞大量堆積導(dǎo)致AS的形成。Hayashi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4缺乏組小鼠與對照組相比其AS斑塊面積明顯減小。

關(guān)于TLR4的研究表明，TLR4信號傳導(dǎo)通路包括MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑，其中前者可激活NF-κB，活化后的NF-κB能夠促進其下游的炎癥因子（LOX-1、ICAM-1、VCAM-1及TNF-α）高表達。而這些炎癥因子均可促進AS的形成[10～12]。

本實驗結(jié)果表明，在正常生理條件下（正常組）血管內(nèi)皮細(xì)胞同時受張應(yīng)力、切應(yīng)力、壓力的平衡作用，TLR4這一模式識別受體在平衡力作用下不被激活，MyD88依賴性信號傳導(dǎo)通路處于封閉狀態(tài)，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等AS標(biāo)志性炎癥因子低水平表達，AS不發(fā)生。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨受應(yīng)力（為張應(yīng)力和切應(yīng)力之和）或壓力作用時，血管內(nèi)皮細(xì)胞所受應(yīng)力和壓力不平衡（如應(yīng)力不變，壓力小或應(yīng)力小，壓力不變），TLR4在不平衡力作用下被激活，進而激活下游MyD88依賴性信號傳導(dǎo)通路，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等炎癥因子高表達，促進AS的發(fā)生和發(fā)展。因此，異常血流動力因素通過激活TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路和增強下游炎癥因子的表達，導(dǎo)致AS，這可能是AS發(fā)生的機制之一。

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（收稿日期：2016-9-3）