李福智 梁 帥 熊茂林 王宇彤 張克劍 侯 陽

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121001)

CIK細(xì)胞對(duì)LLC小鼠肺癌細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡的影響

李福智 梁 帥1熊茂林1王宇彤1張克劍2侯 陽3

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121001)

目的探討干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2及CD3抗體誘導(dǎo)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)對(duì)LLC小鼠肺癌細(xì)胞株存活率和凋亡相關(guān)因子14-3-3ζ及p-Bad蛋白表達(dá)的影響。方法常規(guī)CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，LLC小鼠肺癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞，通過復(fù)合培養(yǎng)體系(Transwell培養(yǎng)板)將CIK細(xì)胞與LLC小鼠肺癌細(xì)胞株建立共培養(yǎng)體系。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間不同分3組(10、15、20 d)運(yùn)用四甲基唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)LLC小鼠肺癌細(xì)胞的存活率。Western印跡檢測(cè)CIK細(xì)胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表達(dá)變化。結(jié)果光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，成功地誘導(dǎo)出CIK細(xì)胞。培養(yǎng)20 d時(shí)LLC肺癌細(xì)胞的存活率明顯低于10 d組和15 d組(Plt;0.01)。Western印跡檢測(cè)LLC小鼠肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad的表達(dá)均有下調(diào)。結(jié)論隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)CIK細(xì)胞對(duì)LLC小鼠肺癌細(xì)胞的存活率逐漸降低并能促進(jìn)LLC小鼠肺癌細(xì)胞的凋亡。

CIK 細(xì)胞；LLC小鼠肺癌細(xì)胞株；14-3-3ζ；p-Bad

肺癌已經(jīng)成為各種癌癥中導(dǎo)致死亡的首要原因〔1〕。目前，我國肺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)26.9%〔1〕。目前各種腫瘤的免疫細(xì)胞治療非?；钴S〔2～4〕，成為腫瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。1991年美國斯坦福大學(xué)Sdmfidt-Wolf等首次報(bào)道了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)。他們采用多種細(xì)胞因子，由非貼壁的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)出具有高增殖能力和高細(xì)胞毒性的殺傷細(xì)胞〔5〕。14-3-3蛋白是一種高度保守的可溶性酸性蛋白家族，參與細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控〔6〕。14-3-3ζ可以通過不同機(jī)制對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制效應(yīng)，其中之一就是對(duì)Bcl-2家族的調(diào)控〔7〕。Bad是促凋亡因子，在腫瘤中的表達(dá)具有重要意義。本文旨在探討CIK細(xì)胞對(duì)LLC小鼠肺癌細(xì)胞株凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 LLC小鼠肺癌細(xì)胞株(LLC)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。屬上皮樣肺腺癌細(xì)胞。CIK細(xì)胞來源于健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院體檢中心提供。加樣器GILSON(法國)、生物顯微鏡Olympus(日本)、倒置顯微鏡Olympus(日本)、加濕CO2孵箱Thermo SCIENTICFIC(德國)、生物安全柜HEAL FORCE HFsafe-1200(上海)、主要試劑Transwell培養(yǎng)板Corning Incorporated(美國)、噻唑藍(lán)(MTT)Sigma公司、DMEM(培養(yǎng)基)GIBCO公司、胎牛血清(FBS)GIBCO公司、Percoll分離液華美生物工程公司、P-Bad兔多克隆抗體Santa cruz公司、14-3-3ζ、兔多克隆抗ASCAM公司、蛋白marker NEB公司、CD3單克隆抗體美國。

1.2方法 LLC小鼠肺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)：在倒置顯微鏡下觀察整體細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)尚可。放置培養(yǎng)箱中靜置4～5 h，可進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)液以防止殘留培養(yǎng)液中的血清對(duì)胰蛋白酶的抑制作用，用磷酸鹽緩沖液(PBS，不含鈣、鎂離子)洗2次。加1 ml胰酶消化液置培養(yǎng)瓶中，倒放37℃培養(yǎng)箱或室溫25℃以上，消化1～4 min。之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶10～30 s后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況：見細(xì)胞大部分變圓、胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大。迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS、100 μ/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素)終止消化。按5 ml/瓶補(bǔ)加入完全培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出一半，分到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。LLC小鼠肺癌細(xì)胞株的凍存方法：凍存液90% FBS，10%二甲基亞砜(DMSO)。梯度降溫：4℃，15～20 min；-20℃ 30～40 min。見細(xì)胞懸液結(jié)凍后，放入-80℃冰箱最后儲(chǔ)存于液氮中長(zhǎng)期保存。

1.3CIK效應(yīng)細(xì)胞的制備 CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法〔8〕：取健康者PBMC 30 ml,將其收集于裝有肝素瓶中，37℃室溫存放即可轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)上。用移液器轉(zhuǎn)移至裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，注意外周血需要放在淋巴細(xì)胞的上層。12 000 r/min離心15 min。用0.9%生理鹽水1∶1稀釋混勻，12 000 r/min離心15 min。取細(xì)胞層，生理鹽水在12 000 r/min漂洗10 min棄上清，再漂洗1次。離心和洗滌均完成后，棄上清再將其移至IMDM培養(yǎng)液中(含10%FBS)懸浮細(xì)胞，置175 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。第1天加入rh干擾素(rhIFN)-γ 1 000 U/ml，放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2天加50 ng/ml的抗CD3單克隆抗體、300 U/ml的rhIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d半量換液，同時(shí)補(bǔ)加300 U/ml的白細(xì)胞介素(IL)-2，調(diào)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，LLC小鼠肺癌細(xì)株為靶細(xì)胞，通過復(fù)合培養(yǎng)體系(Transwell培養(yǎng)板)將CIK細(xì)胞與LLC小鼠肺癌細(xì)胞建立培養(yǎng)體系。設(shè)立正常對(duì)照組和空白對(duì)照組。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間不同分3組(10 d、15 d、20 d)運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)LLC肺癌細(xì)胞的存活率，Western印跡檢測(cè)CIK細(xì)胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表達(dá)變化。

1.5MTT比色法檢測(cè)LLC小鼠肺癌細(xì)胞活力 測(cè)定共培養(yǎng)10、15、20 d LLC肺癌細(xì)胞活力。調(diào)整靶細(xì)胞LLC小鼠肺癌細(xì)胞濃度5×104/ml，加入96孔板內(nèi)，200 μl/孔，24 h后換液。檢測(cè)前3 h換成相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)至3 d時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配制，pH7.4)10 μl，37℃繼續(xù)孵育3 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，記錄結(jié)果。重復(fù)5次，取其均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6Western印跡檢測(cè)LLC小鼠肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad表達(dá)變化 收集在7 d的Lewis肺癌細(xì)胞(密度為2×106個(gè)/ml)，離心，PBS沖洗。加入細(xì)胞裂解液60～100 μl，短暫振蕩。冰上作用30 min，12 000 r/min離心5 min。棄上液，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)樣品，Bradford法測(cè)定濃度。在120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中進(jìn)行電泳分離后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用轉(zhuǎn)膜液潤(rùn)濕一張厚濾紙，鋪于半干轉(zhuǎn)印儀的底層電極板上。將PVDF膜鋪于濾紙上，勿留氣泡。將凝膠貼于PVDF膜上，不留氣泡。潤(rùn)濕另一張厚濾紙，蓋在凝膠上面，用玻璃試管趕去氣泡。蓋上頂層電極板，接通正負(fù)極電源，15 V(不超過25 V)轉(zhuǎn)印20 min。配封閉液。取出PVDF膜，和膠相鄰面向上浸入封閉液置于搖床緩慢搖1 h以上。倒掉封閉液，洗膜液略洗一下。取15 ml離心管加入用5 ml雜交液，按適當(dāng)比例稀釋一抗。PVDF膜在含有50 g/L脫脂奶粉的Tris鹽緩沖液(TTBS)中37 ℃封閉90 min，依次加入一抗(抗人CD3、 CD56單克隆抗體，抗體稀釋濃度為1∶1 000)，4℃孵育過夜。取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5 min。倒掉TBST，把PVDF膜放入裝有二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG，抗體稀釋濃度為1∶1 000)37℃作用40 min。TTBS充分漂洗(10 min×3次)后，化學(xué)熒光法(BCIP/NBT混合液)顯色，觀察結(jié)果，進(jìn)行凝膠圖像分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LLC小鼠肺癌細(xì)胞在光鏡下觀察 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞已完全伸展，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或類似成纖維狀。CIK細(xì)胞在剛培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，大小均一，折光性強(qiáng)。5 d時(shí)可見細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞出現(xiàn)集落生長(zhǎng)。12 d時(shí)細(xì)胞數(shù)量開始增多，光鏡下可見胞核增大，胞質(zhì)增多。

2.2MTT比色法檢測(cè)共培養(yǎng)后LLC小鼠肺癌細(xì)胞存活率 培養(yǎng)20 d時(shí)LLC小鼠肺癌細(xì)胞的存活率〔(60.32±1.02)%〕明顯低于10 d〔(79.23±1.22)%〕、15 d〔(69.45±1.34)%〕、空白對(duì)照組〔(95.52±0.22)%〕和正常對(duì)照組〔(100.00±0.00)%〕。結(jié)果培養(yǎng)不同時(shí)間(10 d、15 d、20 d)LLC小鼠肺癌細(xì)胞組與空白對(duì)照組和正常對(duì)照組，差異均有顯著性(Plt;0.01)。

2.3Western印跡檢測(cè)14-3-3ζ、p-Bad蛋白的表達(dá) 取10 d組，15 d組、20 d組不同培養(yǎng)時(shí)間的LLC小鼠肺癌細(xì)胞，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)LLC小鼠肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad蛋白含量的變化，β-actin為內(nèi)對(duì)照。結(jié)果顯示LLC小鼠肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad的表達(dá)均降低。

3 討 論

肺癌是起源于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，臨床上常分為非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞癌兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌約占75%。近年來肺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，現(xiàn)已為我國男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。肺癌的發(fā)病年齡大多在40歲以上，男性居多，但女性肺癌的發(fā)病率近年來明顯增加。早期肺癌通過手術(shù)等綜合治療，治愈率可以達(dá)到50%以上，但是仍然面臨復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等棘手問題。因此肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，以及術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的盡早發(fā)現(xiàn)與治療,是肺癌獲得根治的關(guān)鍵和難點(diǎn)之一。CIK細(xì)胞選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。CIK細(xì)胞殺瘤譜廣、殺瘤效率高、對(duì)化療耐藥腫瘤同樣敏感。同時(shí)具有免疫殺傷活性強(qiáng)且持久。

本研究結(jié)果提示，CIK細(xì)胞能夠降低體外培養(yǎng)LLC小鼠肺癌細(xì)胞的存活率，CIK細(xì)胞可分泌大量的Th1類細(xì)胞因子〔9〕。CIK細(xì)胞作為最終的效應(yīng)細(xì)胞，可以通過MHC非限制性途徑〔10〕發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。CIK細(xì)胞是誘導(dǎo)、激活的自體細(xì)胞，在共培養(yǎng)的過程中CIK細(xì)胞可致DC高表達(dá)特異性的抗原提成分子，促進(jìn)DC大量分泌IL-12等細(xì)胞因子，進(jìn)而增強(qiáng)CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并能成功誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。CIK細(xì)胞具有獨(dú)特的功能，可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，殺瘤效率高且對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性，即使對(duì)化療耐藥的腫瘤也同樣敏感。

CIK細(xì)胞共同表達(dá)了CD3和CD56兩種膜蛋白分子,是目前所知?dú)钚宰顝?qiáng)的一種腫瘤生物治療效應(yīng)細(xì)胞〔4〕,研究認(rèn)為CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用是通過釋放顆粒酶、穿孔素而裂解靶細(xì)胞,對(duì)靶細(xì)胞的裂解是CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要機(jī)制,也有學(xué)者認(rèn)為進(jìn)入體內(nèi)活化的CIK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子如干擾素γ、腫瘤壞死因子和IL-2等,不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用,而且還可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷瘤細(xì)〔5,6〕。

凋亡受到抑制，才導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖而發(fā)展為腫瘤細(xì)胞。14-3-3蛋白家族可以和許多信號(hào)蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體等結(jié)合，在信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。14-3-3ζ是該家族中的一個(gè)亞型，其確切功能還不完全明了，目前對(duì)14-3-3ζ的研究主要集中在它對(duì)凋亡的調(diào)控上。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中存在14-3-3ζ的高表達(dá)，且降低14-3-3ζ的表達(dá)可使體外實(shí)驗(yàn)的癌細(xì)胞活性減弱。本實(shí)驗(yàn)表明DC-CIK細(xì)胞可以降低體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ蛋白的表達(dá)。Bad在許多人類正常組織中都有表達(dá)，在睪丸、乳腺、結(jié)腸和脾內(nèi)有較高水平的穩(wěn)定表達(dá)。Bad在生存期較長(zhǎng)的位于基底膜的基底細(xì)胞表達(dá)密度較低，而在向表面遷移的分化細(xì)胞中密度較高，表明Bad在分化細(xì)胞中有促凋亡作用。另外Bad是多種刺激引起激酶的普遍靶點(diǎn)，這些外界刺激包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣升高的藥物和介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的神經(jīng)遞質(zhì)等。14-3-3ζ蛋白在細(xì)胞凋亡過程中的具體作用及其機(jī)制目前尚無定論，但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3ζ可以競(jìng)爭(zhēng)性地與p-Bad結(jié)合，導(dǎo)致p-Bad喪失了與Bcl-XL和Bcl-2結(jié)合的機(jī)會(huì)，進(jìn)而啟動(dòng)一系列下游反應(yīng)并最終抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此認(rèn)為，DC-CIK細(xì)胞可能是通過上述機(jī)制降低了14-3-3ζ和p-Bad蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而阻止了癌細(xì)胞的無限增殖。

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〔2017-04-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

R734.2

A

1005-9202(2017)22-5549-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.027

遼寧省教育廳2016年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20161060044)

1 錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 吉林省腫瘤醫(yī)院胸外一科

3 錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院

侯 陽(1982-)，女，講師，主要從事腫瘤免疫研究。

李福智(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的發(fā)病機(jī)制與轉(zhuǎn)移研究。