郭煜暉 胡大軍 陳 靜 彭丹麗 李玉婷

(三峽大學(xué)，湖北 宜昌 443002)

衰老相關(guān)基因Klotho的研究進(jìn)展

郭煜暉 胡大軍1陳 靜 彭丹麗 李玉婷

(三峽大學(xué)，湖北 宜昌 443002)

衰老；Klotho基因

隨著衰老研究及分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，衰老機(jī)制的研究已經(jīng)走向分子與基因水平。Klotho基因是哺乳動(dòng)物體內(nèi)第一個(gè)過表達(dá)延長生命、低表達(dá)加速衰老的衰老抑制基因。Klotho基因在抗衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生中發(fā)揮著極為重要的作用，現(xiàn)將這方面的研究綜述如下。

1 Klotho基因的生物學(xué)屬性

Kuro-o等〔1〕首次從衰老小鼠中成功克隆Klotho基因，隨之發(fā)現(xiàn)大鼠和人也有Klotho基因，且它們之間具有較高(83%)的同源性。人和小鼠Klotho基因定位在第13號(hào)染色體區(qū)域，大鼠Klotho基因定位在第12號(hào)染色體區(qū)域，全長50 kb，包含5個(gè)外顯子。在Klotho基因結(jié)構(gòu)中，其mRNA存在一個(gè)可變剪切位點(diǎn)，故而可產(chǎn)生膜型與分泌型兩種蛋白產(chǎn)物。人的膜型Klotho蛋白主要表達(dá)在腎臟、小腸、胎盤等臟器；分泌型Klotho蛋白與模型分布大致相同，分泌型Klotho蛋白無跨膜、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，主要以通過游離的形式行使其功能，血清中也含有Klotho蛋白〔2〕。Klotho基因突變的小鼠會(huì)過早出現(xiàn)與人類衰老相似的癥狀，且壽命縮短，而其過度表達(dá)會(huì)使小鼠壽命延長〔3〕。

2 Klotho基因的功能

2.1 保護(hù)腎臟 Kuro-o等〔1〕發(fā)現(xiàn)Klotho在腎臟中高表達(dá)，免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析表明，Klotho基因高表達(dá)僅限于腎臟和腦脈絡(luò)膜〔4〕。Sugiura等〔5〕通過手術(shù)建立雙側(cè)腎損傷的大鼠模型，腎臟Klotho mRNA及其蛋白水平均明顯下降，需要很長時(shí)間才能恢復(fù)到對(duì)照組的水平；而經(jīng)轉(zhuǎn)入Klotho基因處理后，治療組組織損傷程度小，血漿肌酐水平正常、凋亡細(xì)胞數(shù)量少，說明Klotho基因在腎臟損傷的恢復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。Haruna等〔6〕發(fā)現(xiàn)腎小球腎炎(ICGN)小鼠模型轉(zhuǎn)入Klotho(ICGN/ Klotho TG)處理后，較對(duì)照組其血肌酐水平、尿蛋白總量有所下降，此外，細(xì)胞間質(zhì)、毛細(xì)血管、系膜等形態(tài)學(xué)方面均有明顯改善，死亡率明顯降低，并認(rèn)為Klotho基因可以保護(hù)腎臟。有學(xué)者研究，給大鼠持續(xù)少量泵入兩個(gè)銀原子(AgⅡ)，7 d后可出現(xiàn)腎損傷，出現(xiàn)蛋白尿增多，腎小球?yàn)V過率下降，轉(zhuǎn)入Klotho基因后，可使大鼠尿蛋白減少，并能防止腎小球?yàn)V過率進(jìn)一步下降及小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷〔5〕。通過轉(zhuǎn)Klotho基因處理可上調(diào)抗感染性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10表達(dá)，抑制氮氧化物和過氧化產(chǎn)物的生成，從而減輕腎損傷，保護(hù)腎臟〔7〕。

2.2 保護(hù)動(dòng)脈 人類衰老過程與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)，衰老是動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素之一。出生4 w后的Klotho基因缺陷小鼠就出現(xiàn)主動(dòng)脈、肌性動(dòng)脈的粥樣硬化，轉(zhuǎn)入外源性Klotho基因的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)后，動(dòng)脈硬化得到有效改善〔1〕。Nakamura等〔8〕發(fā)現(xiàn)，和野生型Klotho+/+大鼠相比，Klotho-/+大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，一氧化氮(NO)生成減少，對(duì)乙酰膽堿的血管舒張反應(yīng)隨之降低，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)降低，VEGF可修護(hù)血管內(nèi)皮，延緩細(xì)胞衰老〔9〕。這也表明血管內(nèi)皮細(xì)胞NO與VEGF的合成都和Klotho基因的表達(dá)相關(guān)，Klotho基因可能通過促進(jìn)NO合成和上調(diào)VEGF表達(dá)防止血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。Ohta等〔10〕把含有Klotho基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Klotho基因敲出小鼠體內(nèi)1 w，小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯提高，脂質(zhì)過氧化物的生成減少，血漿中NO含量也升高，所以認(rèn)為Klotho基因可以協(xié)調(diào)體內(nèi)氧化與抗氧化間的平衡，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

2.3 對(duì)鈣、磷代謝的調(diào)節(jié) Klotho基因敲除小鼠鈣、磷代謝明顯異?！?1〕。在1～2周齡的Klotho基因敲除小鼠就有高磷血癥和高鈣血癥表現(xiàn)，隨周齡的增長，鈣、磷代謝失調(diào)日趨嚴(yán)重。高鈣血癥使得主動(dòng)脈血管中層鈣化，累及腎小血管受損。Tsujikawa等〔11〕發(fā)現(xiàn)限制維生素D的攝入可使Klotho-/-的小鼠血鈣、血磷、1，25二羥基維生素D3〔1,25-(OH)2D3〕濃度恢復(fù)正常、糾正各種衰老表現(xiàn)并延長其壽命(生存15 w以上)。而限制磷的攝入可糾正(FGF)23-/-小鼠的高磷血癥、各種衰老表現(xiàn)并延長其壽命〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，膜型Klotho蛋白可明顯增加纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)23和受體的親和力，還可與FGF23一起抑制1α-羥化酶的基因Cyp27b1表達(dá)，從而減少1,25-(OH)2D3的合成〔13〕。因甲狀旁腺也表達(dá)模型Klotho，甲狀旁腺激素(PTH) 也是FGF23作用的一個(gè)靶器官，PTH可以增加Cyp27b1基因的表達(dá)和血漿中1,25(OH)2D3的水平，同時(shí)FGF23可增加編碼24-羥化酶的基因Cyp24表達(dá)，抑制腎臟對(duì)磷的重吸收和維生素D的生物合成〔14〕，血漿中FGF23水平升高后可造成磷的丟失和骨骼骨化功能障礙〔15〕?？梢姡琄lotho與 FGF23共同完成鈣、磷的調(diào)節(jié)。

2.4 抗氧化與抗凋亡 活力氧(ROS)對(duì)組織損傷的作用日趨明顯，如氧化應(yīng)激是急性腎損傷的重要發(fā)病因素之一，可以采取清除氧自由基的方法治療。應(yīng)激下動(dòng)物體內(nèi)Klotho mRNA及其蛋白表達(dá)降低。Mitobe等〔16〕發(fā)現(xiàn)在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，小鼠腎臟Klotho基因表達(dá)下降低，腎內(nèi)髓集合管3細(xì)胞凋亡增多，而此變化與時(shí)間、劑量改變呈正相關(guān)，可作為氧化應(yīng)激下組織細(xì)胞凋亡的一項(xiàng)指標(biāo)〔17〕。Haruna等〔6〕發(fā)現(xiàn)，在40 w時(shí)相比轉(zhuǎn)Klotho基因小鼠的腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)，腎小球腎炎的小鼠模型明顯增多，凋亡蛋白Bax表達(dá)的上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。Yamamoto等〔18〕觀察通過Klotho高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠(EFmKLOTHO48)和野生小鼠尿中活體內(nèi)DNA氧化損傷的生物標(biāo)記(8-OhdG)的分泌量發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠尿中8-OhdG分泌量明顯增多，為EFmKLOTHO48鼠的1倍，提示Klotho能對(duì)抗體內(nèi)DNA的氧化損傷；百草枯是一種農(nóng)用除草劑，能生成過氧化物。把百草枯放入HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)基里，將可溶性的Klotho蛋白加入處理組中，觀察它們各自細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的變化。相比對(duì)照組，處理組的脂質(zhì)過氧化較輕;此外，將加入百草枯中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)基與經(jīng)過可溶性Klotho蛋白處理的處理組比較，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞凋亡明顯減少，上述實(shí)驗(yàn)均可證明Klotho基因可以減少細(xì)胞凋亡，具對(duì)抗氧化應(yīng)激。

3 Klotho基因抗衰老的主要機(jī)制

Kurosu等〔19〕用EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48與相同基因的野生小鼠比較，發(fā)現(xiàn)EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48兩組的小鼠壽命長。Ikushima等〔20〕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)用Klotho蛋白處理后發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)的β-半乳糖酐酶活性降低，p53與p21的表達(dá)明顯下降，說明Klotho基因通過抑制p53/p21的表達(dá)減緩細(xì)胞衰老。

Klotho基因的分泌型Klotho蛋白通過提高解毒有害ROS的能力，行使與抗衰老激素一樣的功能。Klotho基因過表達(dá)的小鼠體內(nèi)Klotho蛋白表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，胰島素含量也隨之升高；反之，Klotho基因缺陷小鼠體內(nèi)Klotho基因缺失時(shí)，胰島素含量也隨之下降，這種小鼠對(duì)胰島素敏感度很高，可以得知Klotho蛋白與胰島素含量變化密切相關(guān)，參與胰島素的抗性全過程〔19〕。當(dāng)使用遺傳學(xué)方法對(duì)Klotho基因缺陷小鼠同時(shí)進(jìn)行胰島素(INS)/胰島素樣生長因子(IGF)-1通路干涉處理后，可使Klotho基因缺陷小鼠的衰老癥狀明顯緩解。

Klotho基因能調(diào)控多個(gè)離子通道和生長因子的活動(dòng)，包括INS、IGF-1和Wnt，對(duì)多種靶器官發(fā)揮生理效應(yīng)〔21,22〕。Klotho蛋白通過與細(xì)胞膜表面特定受體結(jié)合而啟動(dòng)了胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，該信號(hào)傳遞可以抑制其下游的INS和IGF-1的胞內(nèi)信號(hào)傳遞，因此出現(xiàn)胰島素抗性，如特定的靶酶磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB又稱為Akt)的磷酸化過程均被抑制〔23〕，而導(dǎo)致Akt的去磷酸化,后者又抑制叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)1、FOXO3a、FOXO4等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化。FOXO家族成員FOXO1、FOXO3a、FOXO4在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上起了很重要的作用，Kyoung Kim等〔24〕篩選出穩(wěn)定表達(dá)FOXO3a siRNA的人二倍體成纖維細(xì)胞(HDFs),發(fā)現(xiàn)下調(diào)HDFs中FOXO3a RNA和蛋白導(dǎo)致許多衰老形態(tài)出現(xiàn),包括細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞增殖速度減慢、SA-β-gal染色增加及上調(diào)p53/p21蛋白的表達(dá)。FOXO3a的活力可受磷酸化、乙酰化和蛋白水解調(diào)節(jié),其中磷酸化是最主要的調(diào)節(jié)方式，而PI3K/Akt又是磷酸化FOXO3a最重要的信號(hào)通路。一旦INS/IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制就會(huì)激活FOXO，而抑制FOXO的磷酸化，并促進(jìn)它的核遷移〔25〕。進(jìn)而直接調(diào)控并且促進(jìn)SOD2(MnSOD)的表達(dá)，有利于活性氧類物質(zhì)撤除和對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗，并最終抑制衰老〔18,26〕。以上研究表明，Klotho蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而達(dá)到抗衰老，且抗衰老作用與抵抗氧自由基緊密相關(guān)。

綜上，Klotho基因同時(shí)具有配體、受體和酶的功能，有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抗氧化、抗凋亡的作用并以此實(shí)現(xiàn)對(duì)臟器的保護(hù)，在衰老過程中所起的作用日益明確，為揭示衰老發(fā)生機(jī)制提供了可靠的依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)Klotho蛋白的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過程(其中涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體及這些信號(hào)與其他衰老途徑的關(guān)系)進(jìn)行研究，有望在實(shí)踐中通過對(duì)Klotho基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)衰老及衰老相關(guān)疾病提供一種新的治療方法。

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〔2015-10-16修回〕

(編輯 苑云杰/杜 娟)

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81403307)

郭煜暉(1983-)，女，博士，副教授，主要從事藏象理論及衰老研究。

R339.3+8

A

1005-9202(2017)03-0759-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.105

1 宜昌市第二人民醫(yī)院 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院