魏應(yīng)鳳，梁雁，林臣鴻，章旭君，陳佳寧，湯建華，顧秋平，刁宏燕*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003； 2.贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000)

研究進(jìn)展

無菌動(dòng)物在腸-肝軸研究中的應(yīng)用前景

魏應(yīng)鳳1,2，梁雁1，林臣鴻1，章旭君1，陳佳寧1，湯建華2，顧秋平2，刁宏燕1*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003； 2.贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000)

腸道和肝之間通過腸-肝軸緊密相連，腸道疾病可以影響肝功能，肝疾病也可以誘發(fā)腸道菌群和功能的改變。無菌動(dòng)物是一種身體所有部位都沒有任何活的細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的動(dòng)物，無菌動(dòng)物的出現(xiàn)為研究微生物與宿主之間的相互作用提供了有力的實(shí)驗(yàn)工具。同時(shí)，由于無菌動(dòng)物缺乏正常腸道菌群的特點(diǎn)，它在腸-肝軸的研究中也起到了極大的推進(jìn)作用。本文將對(duì)無菌動(dòng)物在腸-肝軸中的應(yīng)用前景做簡(jiǎn)要綜述。

無菌動(dòng)物；腸-肝軸；腸道菌群

無菌動(dòng)物是指身體任何部位及生活環(huán)境中均檢測(cè)不出任何活的細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的動(dòng)物。通常情況下，哺乳動(dòng)物在母體的子宮內(nèi)時(shí)處于完全的無菌狀態(tài)。構(gòu)建無菌動(dòng)物可通過將臨產(chǎn)動(dòng)物的子宮取出后轉(zhuǎn)移到無菌手術(shù)隔離器中，然后在隔離器內(nèi)將子宮剖開，從而獲得完全無菌的新生動(dòng)物。接下來將此無菌新生動(dòng)物在無菌隔離包中給予無菌飼料和水飼養(yǎng)，待其成年后在無菌環(huán)境內(nèi)繁殖后代，從而建立無菌動(dòng)物[1-4]。無菌動(dòng)物已經(jīng)成為了一種重要的科研工具，它不僅在腸道菌群的研究中發(fā)揮了舉足輕重的作用，而且在免疫及代謝的研究中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1,5,6]。

腸道和肝臟之間關(guān)系密切，“腸-肝軸”的概念在1998年由馬歇爾提出，肝臟疾病與腸道粘膜屏障及腸道菌群的關(guān)系日益受到關(guān)注。腸道和肝臟有著相同的胚胎起源，因此他們有著非常密切的解剖和功能關(guān)系[7]。肝臟的血流供應(yīng)70%左右是來自于門靜脈，而門靜脈的血液主要是來自于腸系膜上及腸系膜下靜脈，這組靜脈血管中含有來自于消化道的各種微生物的代謝產(chǎn)物及其他消化道代謝物[8]。腸道屏障的改變會(huì)增加腸腔內(nèi)的細(xì)菌和毒素等物質(zhì)進(jìn)入腸系膜靜脈，然后這些物質(zhì)可隨血流到達(dá)肝臟，從而影響肝臟的功能。另一方面，肝臟的功能的變化對(duì)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)也會(huì)造成很大影響，比如肝硬化患者和正常人相比腸道菌群會(huì)發(fā)生巨大改變[9]，小鼠發(fā)生急性肝臟損傷時(shí)腸道的通透性也會(huì)發(fā)生巨大的改變[10]。

無菌動(dòng)物的腸道沒有微生物，它的出現(xiàn)為腸-肝軸的研究提供了新方法開辟了新思路。無菌鼠的出現(xiàn)方便了研究正常腸道菌群對(duì)維持機(jī)體功能發(fā)揮的作用，結(jié)合菌群移植等技術(shù)為探究各類不同腸道菌群對(duì)機(jī)體各類正常功能的維持和各類疾病的發(fā)展提供了可能。無菌鼠在腸-肝軸研究中有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，我們課題組應(yīng)用無菌小鼠研究了急性肝損傷，發(fā)現(xiàn)無菌小鼠對(duì)刀豆蛋白誘導(dǎo)的急性肝臟損傷不敏感，這一現(xiàn)象和無菌小鼠腸道缺乏活化肝臟自然殺傷性T細(xì)胞(natural killer T，NKT)的糖脂質(zhì)抗原相關(guān)[10]。近些年應(yīng)用無菌動(dòng)物研究腸-肝軸的報(bào)道越來越多[11-14]，本文就無菌動(dòng)物在腸-肝軸研究中的應(yīng)用前景作簡(jiǎn)要綜述。

1 無菌動(dòng)物

越來越多的研究證實(shí)，腸道微生物在正常生理功能的維持和疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，比如腸道微生物可以調(diào)節(jié)骨密度，影響大腦的發(fā)育和人的行為，影響心血管系統(tǒng)及調(diào)節(jié)肝臟功能[15-18]。無菌動(dòng)物的出現(xiàn)為微生物與宿主之間相互作用的研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)工具，特別是對(duì)肝臟與腸道微生態(tài)之間相互作用的研究起到了極大推進(jìn)作用。

1.1 無菌動(dòng)物的建立

無菌動(dòng)物的概念最早在1885年由巴斯德提出，在1895年世界上第一批無菌動(dòng)物(無菌豬)誕生在柏林大學(xué)，當(dāng)時(shí)這些豬只存活了13 d。由于技術(shù)及條件的限制，無菌動(dòng)物發(fā)展的道路非?？部溃敝?940年科學(xué)家們才成功構(gòu)建出了第一批無菌大鼠，到1959年才成功培育出第一批無菌小鼠[3,19,20]。發(fā)展初期，無菌動(dòng)物是在無菌不銹鋼鐵籠中培育的，隨著技術(shù)的進(jìn)步漸漸的開發(fā)出了更加靈活輕便的塑料無菌籠。無菌動(dòng)物培育裝置為動(dòng)物提供一個(gè)與外界隔絕的無菌生活環(huán)境，所需物品都是經(jīng)過完全消毒滅菌后再通過無菌屏障傳送到無菌培育裝置中。建立一個(gè)新品系無菌動(dòng)物需要較長(zhǎng)時(shí)間，以建無菌小鼠品系為例，首先通過無菌剖宮產(chǎn)技術(shù)將胎兒從普通小鼠母體中取出來，轉(zhuǎn)運(yùn)到無菌培育裝置中以后用其他無菌母鼠代乳，給鼠食用滅菌的食物和水。而且，通過剖宮產(chǎn)技術(shù)得到的第一代無菌小鼠不宜用于實(shí)驗(yàn)，它們可能含有從非無菌小鼠母體中獲得病毒或細(xì)菌[3]。在無菌小鼠的培育過程中，需使用糞便樣本培養(yǎng)基16S PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)小鼠是否被污染[21]。

1.2 無菌動(dòng)物的特征

和普通動(dòng)物相比，無菌動(dòng)物除了無菌以外，在營(yíng)養(yǎng)、代謝、身體結(jié)構(gòu)及免疫方面都有自己的特點(diǎn)。下面以無菌小鼠為例，對(duì)這些特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要舉例。和普通小鼠不同，無菌小鼠需要在食物中額外添加維生素K和B才能保持健康，無菌小鼠的體脂比更低，且無菌鼠的基礎(chǔ)代謝率較低[3]。在身體結(jié)構(gòu)方面，相比普通小鼠，無菌鼠的肝臟體積和腸道總質(zhì)量更小，無菌鼠的腸道固有層和結(jié)腸壁更薄，更為突出的是無菌鼠有巨大的盲腸[3]。此外，無菌鼠和普通鼠的免疫系統(tǒng)也存在一定差異，無菌鼠更容易誘發(fā)感染[3]。

1.3 國(guó)內(nèi)外無菌動(dòng)物培育的現(xiàn)狀

近些年，隨著各種疾病和菌群關(guān)系的研究需求拉動(dòng)，國(guó)內(nèi)外對(duì)無菌動(dòng)物的培育越來越重視，全球各國(guó)對(duì)無菌平臺(tái)的建設(shè)迅速增長(zhǎng)，歐洲以小鼠變異庫(kù)為核心建設(shè)了歐洲悉生動(dòng)物資源體系，美國(guó)以悉生動(dòng)物資源中心為核心構(gòu)建了國(guó)家級(jí)的悉生動(dòng)物平臺(tái)。在國(guó)內(nèi)，第三軍醫(yī)大學(xué)無菌動(dòng)物課題組突破了無菌小鼠培育的關(guān)鍵技術(shù)，在國(guó)內(nèi)建立了最具影響力的無菌動(dòng)物平臺(tái)，培育了C57BL/6 J、BALB/c、DBA及KM小鼠等無菌鼠品系[1]；此外，浙江大學(xué)傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立了無菌大鼠品系，為腸道微生態(tài)的研究提供了有力工具[22]。

2 腸-肝軸

腸道和肝臟之間有著非常密切的解剖和功能關(guān)系，肝臟疾病可以引起腸道功能紊亂，而且腸道疾病也會(huì)帶來肝臟功能的損傷。

2.1 肝臟疾病誘發(fā)腸道功能紊亂

肝臟疾病患者通常合并惡心、嘔吐及腹瀉等胃腸道癥狀，這些癥狀的出現(xiàn)與肝臟疾病可誘發(fā)腸道功能紊亂相關(guān)。肝臟功能紊亂時(shí)可能降低腸道的蠕動(dòng)，促進(jìn)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)，誘發(fā)細(xì)菌異位及導(dǎo)致腸道血流循環(huán)障礙等。在肝硬化的病人中，有研究提示肝硬化會(huì)降低腸道的蠕動(dòng)[23,24]，然而腸道活動(dòng)能力受阻的程度和肝功能的Child-Pugh分級(jí)不呈正相關(guān)[24]。小鼠門脈高壓模型研究提示，腸蠕動(dòng)受阻和升高的門脈壓力阻礙了腸道的肌電活動(dòng)相關(guān)[25]。腸道蠕動(dòng)能力受阻會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)其他腸道功能紊亂發(fā)生，腸腔內(nèi)細(xì)菌可能因此而過分生長(zhǎng)。有研究指出，20%～75%的慢性肝病患者會(huì)出現(xiàn)腸道細(xì)菌異常增長(zhǎng)，該現(xiàn)象的發(fā)生率和肝臟疾病的嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性[26]。肝病患者腸道細(xì)菌的異常增長(zhǎng)可能和患者的胃酸分泌減少、腸腔IgA缺乏，營(yíng)養(yǎng)失調(diào)及腸蠕動(dòng)異常相關(guān)。腸道細(xì)菌異常增長(zhǎng)可誘發(fā)維生素B12、碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的吸收異常，可增加肝臟細(xì)菌毒素的積聚，導(dǎo)致肝臟膽汁酸的異常分泌，從而進(jìn)一步的加重肝臟損傷[27,28]。此外，嚴(yán)重肝臟疾病引起的門脈高壓可進(jìn)一步的導(dǎo)致腸道淤血，從而影響腸道微生態(tài)平衡及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收?？傊捎诟闻K與腸道的解剖及功能的緊密關(guān)系，肝臟疾病會(huì)間接的導(dǎo)致腸道功能的紊亂。

2.2 腸道疾病合并肝臟損傷

腸道和肝臟解剖關(guān)系密切，門靜脈提供肝臟70%左右的血流，且門靜脈血主要來源于腸系膜靜脈，腸道中微生物的代謝物、腸道分泌物及消化產(chǎn)物可以通過門脈到達(dá)肝臟，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟功能。炎癥性腸病(IBD)是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。IBD通常合并肝臟及膽道疾病，比如CD患者常常合并肝肉芽腫[29]，大約40%～50%的IBD患者合并脂肪肝，一些出現(xiàn)瘺管及肛周病變的CD患者可合并肝淀粉樣變性[30]。腸道腫瘤的發(fā)病率越來越高，特別是結(jié)腸及直腸腫瘤給人類健康造成極大的威脅，由于肝臟和腸道密切的解剖關(guān)系，很多腸道腫瘤首發(fā)轉(zhuǎn)移到肝臟。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腸道感染也會(huì)影響到肝臟，比如某些細(xì)菌引起的感染性腹瀉導(dǎo)致進(jìn)入肝臟的內(nèi)毒素增加，進(jìn)而引起明顯的肝功能異常[31]?？傊?，腸道和肝臟之間可以通過腸-肝軸相互影響，腸-肝軸在腸道及肝臟疾病的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。

3 無菌動(dòng)物在腸-肝軸研究中的應(yīng)用

近些年，關(guān)于腸-肝軸的研究越來越多，無菌動(dòng)物成為研究腸-肝軸的有力工具，無菌動(dòng)物可為研究單一細(xì)菌或者部分腸道微生物與宿主的相互作用提供簡(jiǎn)單模型。下面我們將對(duì)無菌鼠在肝臟及腸道相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用做簡(jiǎn)要總結(jié)。

3.1 腸道菌群影響肝臟的損傷和修復(fù)

肝臟有豐富的血流供應(yīng)，很多因素可以誘發(fā)肝臟損傷，但是肝臟又具有極強(qiáng)的自我修復(fù)能力。無菌動(dòng)物在研究腸道菌群對(duì)肝臟損傷及修復(fù)的影響及機(jī)制中有很大的優(yōu)勢(shì)，這方面的研究也越來越多。早在1990年，有研究發(fā)現(xiàn)部分肝切除的無菌小鼠肝臟修復(fù)速度要明顯比正常小鼠慢，腸道細(xì)菌來源的脂多糖(LPS)可以促進(jìn)肝臟的修復(fù)[32]。近些年的另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，和普通小鼠相比，酒精過量攝入可以在無菌小鼠誘發(fā)更加嚴(yán)重的肝臟損傷，并且酒精可以在無菌小鼠的肝臟中誘發(fā)更加明顯的肝脂肪變性，這些現(xiàn)象可能和無菌小鼠缺乏腸道菌群影響酒精代謝有關(guān)[33]。此外，我們課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)無菌小鼠對(duì)刀豆蛋白誘導(dǎo)的急性肝臟損傷不敏感，這一現(xiàn)象和無菌小鼠腸道缺乏活化NKT的糖脂質(zhì)抗原密切相關(guān)[10]。這些應(yīng)用無菌小鼠研究肝-腸軸的文獻(xiàn)顯示，腸道菌群在肝臟的損傷和修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.2 腸道菌群影響肝臟代謝

肝臟是體內(nèi)以代謝為主要功能的器官，許多藥物的代謝都要經(jīng)過肝臟，研究發(fā)現(xiàn)無菌動(dòng)物肝臟中藥物代謝酶的表達(dá)譜與普通動(dòng)物有很大差異，且對(duì)無菌動(dòng)物的腸道菌群進(jìn)行重構(gòu)可以間接的改變肝臟藥物代謝酶的表達(dá)譜[11,13,34,35]。和普通小鼠相比，無菌小鼠肝臟中的細(xì)胞色素氧化酶(Cyp1a2)基因的表達(dá)水平增加了51%，過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的表達(dá)水平增加了202%[34]。然而，無菌小鼠肝臟中也有一些藥物代謝基因如Cyp2b10、Cyp3a11的表達(dá)水平卻顯著低于普通小鼠[34]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在無菌小鼠的飲水中加入8種活菌(包括3種雙岐菌、4種乳酸菌和1種鏈球菌)喂養(yǎng)一段時(shí)間后，UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1a9和2a3的表達(dá)水平顯著降低[13]。這些數(shù)據(jù)表明，腸道細(xì)菌對(duì)肝臟各類藥物代謝酶的表達(dá)起重要的調(diào)節(jié)作用，腸道菌群是肝臟藥物代謝能力的一種重要調(diào)控因素。

在無菌動(dòng)物的研究中，不但發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)肝臟的損傷、修復(fù)及代謝起重要調(diào)節(jié)作用，也有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)肝臟的分泌功能及肝臟腫瘤生成過程起調(diào)節(jié)作用[14,36]。這些數(shù)據(jù)說明，無菌鼠在研究腸道細(xì)菌對(duì)肝臟代謝的作用方面有很大的應(yīng)用前景。

3.3 無菌動(dòng)物在腸道研究中的應(yīng)用

此外，無菌動(dòng)物在腸道疾病的研究中也有非常大的應(yīng)用價(jià)值。有研究報(bào)道，相比普通小鼠，無菌小鼠有很強(qiáng)的抗腸道細(xì)菌IgA反應(yīng)，但是緩慢的給無菌小鼠腸道定植腸道細(xì)菌可以逐漸的減弱這種IgA免疫反應(yīng)[37]。也有研究報(bào)道，在無菌小鼠中，一些非致病細(xì)菌會(huì)調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞中基因的表達(dá)[38]。此外，無菌小鼠目前也被用于腸道炎癥及腸道腫瘤的研究[39]?？傊?，無菌動(dòng)物的出現(xiàn)對(duì)腸-肝軸的研究起了很大的推動(dòng)作用，無菌動(dòng)物逐漸被使用到各種肝臟及腸道相關(guān)疾病的研究中。

4 總結(jié)

腸道和肝臟之間關(guān)系密切，腸道菌群、腸道分泌物及腸道消化產(chǎn)物可以通過腸-肝軸的作用調(diào)節(jié)肝臟的功能及疾病的發(fā)生，肝臟也可以通過腸-肝軸的作用影響腸道。腸-肝軸的研究越來越受到關(guān)注，無菌動(dòng)物逐漸成為了研究腸-肝軸的熱門實(shí)驗(yàn)工具。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)無菌動(dòng)物在肝臟損傷、修復(fù)及代謝，還有腸道的免疫、炎癥及腫瘤等研究中有很高的利用價(jià)值。由于無菌動(dòng)物得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，相信它在腸-肝軸研究中有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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Prospectsofgerm-freeanimalsinthestudyofgut-liveraxis

WEI Ying-feng1,2,LIANG Yan1,LIN Chen-hong1,ZHANG Xu-jun1,CHEN Jia-ning1,TANG Jian-hua2,GU Qiu-ping2,DIAO Hong-yan1 *

(1.State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,The First Affiliated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310003,China； 2.Ganzhou People’s Hospital,Ganzhou 341000)

Intestine and liver have very closely relationship due to the gut-liver axis,intestinal disease can affect the liver function,and the liver disease may also induce intestinal disorders.The germ-free animals have no living bacteria,fungi,viruses and parasites.The appearance of germ-free animals provides a powerful experimental tool for studying the interaction between the host and the intestinal microorganisms.At the same time,due to the characteristics of lacking normal intestinal flora,germ-free animals play a great role in promoting the study of gut-liver axis.In this paper,we will briefly review the application prospects of germ-free animals in the research of gut-liver axis.

Germ-free animal; Gut-liver axis; Intestinal microflora

DIAO Hong-yan.E-Mail: diaohy@zju.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81571953)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目省部共建計(jì)劃(No.2015118507)；浙江省自然基金面上項(xiàng)目(No.LY16H190002)。

魏應(yīng)鳳(1988-)，男，博士，主要從事肝病及腸病的免疫發(fā)病機(jī)制研究。Email：wyf1988@aliyun.com

刁宏燕，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝病的免疫發(fā)病機(jī)制研究。Email：diaohy@zju.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0671-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.016

2017-10-09