楊凱蒂，賀雨，曾本華，肖灑，艾青，魏泓，余加林

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒中心，重慶 400014； 2.深圳大學總醫(yī)院兒科，深圳 518055； 3.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014； 4.兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶 400014； 5.兒科學重慶重點實驗室，重慶 410014； 6.第三軍醫(yī)大學基礎部實驗動物學教研室，重慶 400038)

研究進展

新生兒壞死性小腸結腸炎動物模型研究進展

楊凱蒂1,3,4,5，賀雨1,3,4,5，曾本華6，肖灑1,3,4,5，艾青1,3,4,5，魏泓6，余加林1,2,3,4,5*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒中心，重慶 400014； 2.深圳大學總醫(yī)院兒科，深圳 518055； 3.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014； 4.兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶 400014； 5.兒科學重慶重點實驗室，重慶 410014； 6.第三軍醫(yī)大學基礎部實驗動物學教研室，重慶 400038)

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是新生兒時期嚴重的胃腸道疾病,病死率高，多見于早產兒，極低出生體重兒，但確切病因及發(fā)病機制尚未闡明。積極探尋其發(fā)病機制，需建立可靠的動物模型以助于對該病的病因、發(fā)病機制及防治等各方面進行深入研究，以改善NEC患兒預后有重要意義。

壞死性小腸結腸炎；動物模型；新生兒

新生兒壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒重癥監(jiān)護病房常見的胃腸道急癥，病死率20%～40%，需手術治療的NEC患兒病死率高于50%[1,2]。在美國，每年治療NEC的財政投入達10億美元。然而目前NEC確切的病因及發(fā)病機制尚未闡明，大量研究發(fā)現(xiàn)，早產、高滲性的人工喂養(yǎng)、缺氧及腸道菌群紊亂是NEC發(fā)病的重要危險因素[3]。因此，建立可靠、高效、高重復性的NEC動物模型對深入研究疾病的發(fā)生、發(fā)展及早期干預尤為重要。本文就近年來NEC動物模型建立研究進展作一綜述。

1 NEC建模常用動物種類

NEC建模的主要動物種類有豬、大鼠和小鼠。豬是較早運用于NEC建模的動物。研究發(fā)現(xiàn)，早產豬與早產新生兒在呼吸系統(tǒng)、代謝及心血管疾病方面有很大的相似性，生后及喂養(yǎng)后均易發(fā)生NEC[4]。用于NEC建模的小型豬，其體重、內臟器官的形態(tài)學及發(fā)育過程與人類過程相似且新生豬的體積較大，可操作性強，其建模成功率在55%～65%左右[5]。但由于豬的孕期及生長周期較長，價格也相對昂貴，近年來并不是NEC建模的首選動物[4]。目前更常用于NEC建模的為嚙齒類動物大鼠及小鼠。大鼠最早于1974年被運用于NEC疾病模型的建立。建模后病理變化、臨床表現(xiàn)及生化反應與人類較為接近，且新生鼠體積較大，操作性較強，目前仍較多用于NEC動物模型的建立[6]。但隨著人工喂養(yǎng)技術的改善，免疫學及基因學研究的深入，越來越多的NEC模型建立是基于小鼠進行的。其品系穩(wěn)定，繁殖迅速。較大鼠而言，小鼠在腸道發(fā)育、解剖結構和生理特性方面和人更接近，且遺傳背景清晰，其基因與人類有極高的相似度，適合做基因學方面的研究。常用的小鼠種類有KM小鼠、BALB/c以及C57BL小鼠等。一項對KM小鼠及C57BL小鼠人源菌群模型建立的研究表明，在與人的相似性方面，C57BL小鼠顯著高于KM小鼠[7]。C57BL小鼠目前多用于腸道菌群與NEC發(fā)病機制的研究。

2 NEC建模常用方法進展

因NEC與早產、高滲喂養(yǎng)、缺氧等因素有關，因此早期研究采用了單因素建模法，主要有缺氧-復氧、缺血-再灌注以及單純注射炎性介質。早期研究發(fā)現(xiàn)，腸道的缺血壞死與缺氧時間及復氧濃度呈正相關性。長時間的缺氧及高濃度的復氧更易出現(xiàn)腸壁囊樣積氣表現(xiàn)，這與高氧產生的氧自由基導致腸道微循環(huán)障礙加重有關[8]。目前國內外尚無統(tǒng)一的缺氧窒息時間，多數(shù)文獻推薦10 min，甚至更長[9]。而缺血時血液首先供應心腦腎等主要器官，由于供血減少，腸道出現(xiàn)不同程度的出血壞死[10]。單純注射炎性介質(如LPS，PAF，TNF-α)可造成腸道確切損傷，且程度較重，動物多出現(xiàn)腹脹、腹瀉及便血的胃腸道表現(xiàn)[11]。但經反復研究證實，上述的三種單因素方法都有缺陷，建模后的癥狀及病理變化與典型NEC表現(xiàn)不符，且不能重復出臨床NEC的復雜病因，故目前已很少使用[12,13]。為了更進一步模擬臨床上NEC的多種致病因素，一些新型的多因素建模方法被廣泛利用。包括的主要因素有早產、人工喂養(yǎng)、缺氧、冷刺激、生物介質灌胃以及糞菌移植等。這些方法的綜合運用，使建模重復性提高，建模后臨床表現(xiàn)及病理變化更為典型，更加貼近NEC患兒的自然發(fā)病過程。以下就目前NEC多因素建模方法的進展進行闡述。

2.1 基于早產的多因素建模法

流行病學研究表明，早產是NEC發(fā)病的危險因素。早產新生兒其胃腸道的許多正常生理屏障發(fā)育不良、腸道消化能力受損、血液循環(huán)障礙，抗炎及防御能力下降，腸道內保護因子的含量也比足月新生兒低[14]。Jensen等[15]在孕母豬106天建立早產新生豬模型，進行人乳喂養(yǎng)8～9 d，獲得NEC早產豬模型。Nguren等[16]在生后4 d對早產新生小鼠腹腔注射109CFU/kg表皮葡萄球菌，建立NEC模型。鄭曉輝等[17]將早產的新生大鼠分為三組，分別給予人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃；人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激及單獨缺氧組。建模后發(fā)現(xiàn)，人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃組大鼠NEC的發(fā)生率更高，其建模后臨床表現(xiàn)、腸道病理變化都較其他兩組更為典型，更加接近NEC的發(fā)病表現(xiàn)。

2.2 基于人工喂養(yǎng)的多因素建模法

由于配方乳中缺少分泌型IgA (SIgA)、乳鐵蛋白、溶菌酶、EGF、PAF降解酶、白細胞介素-10 (IL-10)、及益生菌等母乳中所具有的保護因子，高滲性配方乳過快喂養(yǎng)還致使腸腔膨脹、壓力增高、腸黏膜缺血而引起腸道損傷。因此高滲性配方乳大量、快速喂養(yǎng)可使腸黏膜滲透性增加，是NEC發(fā)病的危險因素之一。母乳喂養(yǎng)新生兒NEC的發(fā)病率遠低于人工喂養(yǎng)兒[18]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，人工喂養(yǎng)組新生豬NEC的發(fā)病率是母乳喂養(yǎng)組10倍[10]。目前已成功運用人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激及人工喂養(yǎng)+缺氧+LPS灌胃的方法成功建立了大鼠NEC模型[19,20]。

Leaphart等[21]在2006年采用人工喂養(yǎng)、缺氧、冷刺激等辦法已成功建立了NEC新生小鼠模型。Jung等[19]對人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激建立的大鼠NEC模型及缺血-再灌注小鼠NEC模型對比發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠回腸均出現(xiàn)不同程度絨毛壞死、腸腺破壞、腸穿孔等，但大鼠組建模后腸壁積氣更明顯，而小鼠組僅僅是出現(xiàn)腹水，腸道彈性差，腸管擴張及充血，說明大鼠對該種模型更加敏感。Liu等[22]將新生小鼠暴露于缺氧及冷刺激中，用配方奶(4次/日、4天)喂養(yǎng)，并結合缺氧及冷刺激的方法，成功建立NEC疾病模型。

2.3 基于生物介質的多因素建模法

NEC作為新生兒期嚴重的胃腸道感染性疾病，其動物模型的建立可模擬感染性疾病的發(fā)病過程。早期大量研究利用給實驗動物注射或喂養(yǎng)LPS的方法來造模。近期對成人炎癥性腸病的研究發(fā)現(xiàn)右旋糖酐硫酸酯鈉 (dextran sodium sulfate,DSS)建模引起腸道上皮血管通透性增強、炎癥因子上調及嗜中性粒細胞浸潤，其腸道炎性表現(xiàn)具有與人類相似的特征，如腹瀉，結直腸出血，體重減輕，短腸綜合征等，組織學特征多發(fā)糜爛和炎癥性黏膜變化及隱窩膿腫[23]。因此DSS可被用于成年小鼠炎癥性腸病的建模，其建模成功率高，穩(wěn)定性佳[24]。近年來，DSS也被用于NEC建模。Ginzel等[25]將3 d的新生小鼠分為LPS+缺氧+冷刺激(2次/日、3 d)及DSS+缺氧+冷刺激(2次/日、8 d)兩組，兩組建模后對比發(fā)現(xiàn)DSS灌胃組相比LPS建模小鼠體重下降更為明顯，出現(xiàn)明顯的單核巨噬細胞的聚集及NEC樣腸道損傷，炎癥因子分泌較LPS灌胃組增加，加之DSS對腸上皮細胞無毒性作用，逐漸被用于替代LPS進行NEC建模。

2.4 基于細菌定植的多因素建模法

許多研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的改變是NEC的重要致病因素。NEC患兒較正常組患兒其腸道菌群多樣性下降，菌群的構成比也發(fā)生了一定的改變[26]。Autrar等[27]運用克雷伯菌定植+人工喂養(yǎng)+缺氧的方法建立了大鼠NEC模型。Tian等[28]運用成人腸道共生菌或糞腸球菌(105CFU)灌胃定植+人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激成功建立NEC模型。有學者認為，NEC發(fā)病過程是多種細菌共同作用所致菌群改變產生，因此，直接運用患兒糞菌移植的建模方法被提出。

2.5 基于基因缺陷動物的多因素建模法

迄今為止，雖然NEC確切的病因及發(fā)病機制尚未被完全闡明，但隨著基因學及免疫學的發(fā)展，為了更好地探討NEC發(fā)病機制，越來越多的研究成功將NEC疾病模型建立于基因缺陷動物，以期闡明靶向基因在NEC中的作用?；蛉毕菪∈筝^正常小鼠存活率下降，繁殖能力減弱，因此對其進行NEC造模具有一定難度。

2.5.1 ASL缺陷小鼠NEC模型

Premkumar等[29]在2012年利用早產小鼠，采用缺氧、冷刺激，LPS灌胃的方法成功建立了精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)缺陷小鼠NEC模型。新生兒哺乳動物精氨酸的合成取決于ASL，腸細胞是精氨酸合成的主要部位，是人體內轉化生產尿素的關鍵步驟。腸細胞特異性ASL缺乏小鼠其NEC發(fā)病率及嚴重程度都較正常小鼠高，這可能與腸道凋亡增加相關炎癥有關。上述研究證明腸細胞衍生的ASL在NEC的發(fā)病機制中的保護作用。

2.5.2 SIGIRR缺陷小鼠NEC模型

早期研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4)參與了NEC的發(fā)生[30],且LPS 信號轉導主要通過TLR4進行[31]。Fawley等[32]運用人工喂養(yǎng)+缺氧+LPS灌胃的方法成功在單免疫球蛋白介素-1相關受體(single immunoglobulin interleukin-1 related receptor,SIGIRR)缺陷小鼠上建立NEC模型。上述研究闡述了SIGIRR是腸道發(fā)育中TLR4信號傳導的負調節(jié)因子，其不足可導致腸道對TLR高反應[33,34]，引起NEC的發(fā)生，進一步證明了TLR4在NEC發(fā)病中的重要作用，與Jilling及Leaphart早期研究結果一致[35,36]。

2.5.3 Rag1缺陷小鼠NEC模型

Egan等[37]運用人工喂養(yǎng)+缺氧+糞便菌群移植成功在重組激活基因1(recombination activating gene 1-deficient,Rag1-/-)缺陷小鼠上誘導出NEC模型。由于Rag1-/-小鼠體內發(fā)揮免疫效應的功能性T、B淋巴細胞的不足，建模后其腸道損害程度及促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)低于野生型小鼠(Wild Type,WT)。轉入CD4+的天然樣淋巴細胞(Naive T)于Rag1-/-小鼠體內，這些小鼠便恢復了NEC敏感性，腸道損害程度加重，IL-1β分泌增加。證實NEC發(fā)病機制中T細胞發(fā)揮主要作用。

綜上所述，理想的NEC動物模型應具有與臨床NEC發(fā)病近似匹配的在病因、病理、生化及臨床表現(xiàn)，較強的可重復性及良好的操作性與簡便易行的方法是建模成功的關鍵。仍需大量的動物實驗和臨床研究來完善建模方法，并利用好基因工程小鼠及人源化小鼠等工具，最終建立較為理想的NEC動物模型，以更好的了解NEC的病因及發(fā)病機制，達到疾病早期預防及改善NEC患兒的預后。

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Progressinresearchonanimalmodelsofneonatalnecrotizingenterocolitis

YANG Kai-di1,3,4,5,HE Yu1,3,4,5,ZENG Ben-hua6,XIAO Sa1,3,4,5， AI Qing1,3,4,5,WEI Hong6,YU Jia-lin1,2,3,4,5*

(1.Department of Neonatology,Children’s Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400014,China； 2.Shenzhen University General Hospital,Shenzhen 518055； 3.Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders,Chongqing 400014； 4.China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders,Chongqing 400014； 5.Chongqing Key Laboratory of Child Infection and Immunity,Chongqing 400014； 6.Department of Laboratory Animal Science,College of Basic Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038)

Neonatal necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe gastrointestinal disease with high mortality.Studies have suggested that NEC are associated with prematurity and very-low birth weight,but the exact etiology and pathogenesis has not been elucidated.Therefore,it is important to build an ideal NEC model to explore the pathogenesis and prevention measures of NEC to reduce the incidence and severity of NEC.

Neonatal necrotizing enterocolitis; Animal model

Yu Jia-lin.E-mail: yujialin486@126.com

楊凱蒂(1992-)，女，博士，主要從事新生兒感染性疾病研究。Email：chinaykd@sina.com

余加林(1961-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事新生兒疾病研究。Email：yujialin486@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0689-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.019

2017-10-13