孫靜，杜蕾，丁玉春，吳夢(mèng)，羅林，楊松全，黃勇，曹浩然，鐘浩，劉作華*，葛良鵬*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460； 3.重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460； 4.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460； 5.重慶百斯達(dá)生物科技有限公司，重慶 402460)

研究進(jìn)展

無(wú)菌豬的制備與微生物質(zhì)量控制

孫靜1,2,3，杜蕾1,4，丁玉春1,2,3，吳夢(mèng)1,2,3，羅林1,2,3，楊松全1,2,3，黃勇1,2,3，曹浩然1,2,3，鐘浩5，劉作華1,2,3*，葛良鵬1,2,3*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460； 3.重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460； 4.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460； 5.重慶百斯達(dá)生物科技有限公司，重慶 402460)

菌群與宿主相互關(guān)系等熱點(diǎn)研究促進(jìn)了對(duì)無(wú)菌動(dòng)物需求的迅猛發(fā)展。無(wú)菌豬作為一種特殊的模式動(dòng)物，其在科學(xué)研究中不僅排除了背景微生物因素的影響，而且與常用的無(wú)菌小鼠相比，其在解剖、生理、代謝等方面與人更為相似，因此在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文結(jié)合現(xiàn)有國(guó)外無(wú)菌豬研究進(jìn)展和本實(shí)驗(yàn)室在無(wú)菌豬研究積累，就無(wú)菌豬的制備與微生物質(zhì)量控制進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。

無(wú)菌豬；屏障環(huán)境；飼養(yǎng)隔離器；微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

隨著菌群與宿主相互作用研究的深入，菌群與健康的關(guān)系越來(lái)越受到大家的關(guān)注，客觀上促進(jìn)了科學(xué)研究對(duì)高等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需求，無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)動(dòng)物已不能滿足當(dāng)前菌群與宿主相互作用的研究需求。無(wú)菌(germ-free,GF)動(dòng)物由于不攜帶任何可檢測(cè)的微生物，可排除背景微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，獲得高重復(fù)性、高敏感度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相較常用的無(wú)菌小鼠，無(wú)菌豬由于在腸道組織結(jié)構(gòu)、消化特性、以及解剖和生理代謝等方面與人類更為近似，特別是人腸道中的雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和梭菌屬的一些菌種，無(wú)法在無(wú)菌小鼠中定植，卻可以在無(wú)菌豬中定植[1]，因此利用無(wú)菌豬制備人源化腸道菌群動(dòng)物模型，其重現(xiàn)度更高[2]。無(wú)菌豬的應(yīng)用，已從最早用于畜牧生產(chǎn)重大疫病凈化，逐漸擴(kuò)展為用于腸道微生物與生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生關(guān)系研究，以及兒童疫苗、嬰幼兒奶粉等質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[3,4]。此外，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)和豬的無(wú)菌凈化技術(shù)，未來(lái)有望將豬作為人類自體器官培養(yǎng)的工廠，有效解決器官移植供體不足和安全性問(wèn)題[5]。

微生物質(zhì)量控制是無(wú)菌豬培育的核心質(zhì)量指標(biāo)，本文結(jié)合現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外無(wú)菌動(dòng)物培育技術(shù)[6]和課題組前期階段性工作[7]，對(duì)無(wú)菌豬培育及微生物質(zhì)量控制技術(shù)體系進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。

1 無(wú)菌豬的制備過(guò)程

1.1 妊娠母豬的篩選

妊娠豬應(yīng)在良好的飼養(yǎng)管理下，且從豬病少的豬場(chǎng)中選擇。不宜選擇初產(chǎn)和第6胎次以上的，且臨床上排除經(jīng)胎盤垂直傳播的四種疾病，即豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、細(xì)小病毒病的妊娠豬。

四種疾病均為陰性的妊娠豬，在實(shí)施手術(shù)當(dāng)天移動(dòng)到動(dòng)物清潔間。移動(dòng)時(shí)應(yīng)在3～4 h內(nèi)完成，盡可能減少母豬應(yīng)激。一般在預(yù)定分娩日的前3 d內(nèi)進(jìn)行，早于該時(shí)間新生仔豬存活困難。妊娠末期應(yīng)積極觀察母豬行為，減少因提前分娩而終止手術(shù)的事件發(fā)生。手術(shù)需與子宮剝離器、動(dòng)物無(wú)菌運(yùn)輸器的配合完成。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境與條件的準(zhǔn)備

1.2.1 隔離裝置及準(zhǔn)備

豬的無(wú)菌獲取與維持離不開子宮剝離器、動(dòng)物無(wú)菌運(yùn)輸器和飼養(yǎng)隔離器的配合使用。此三類隔離裝置都為耐腐蝕、密封性能好，具有獨(dú)立的空氣過(guò)濾系統(tǒng)、操作橡膠手套、觀察窗和移動(dòng)滾輪。

裝置內(nèi)，采用2%過(guò)氧乙酸噴霧滅菌，1～2 h后送風(fēng)，經(jīng)微生物檢測(cè)合格，持續(xù)空轉(zhuǎn)備用。手術(shù)前1 d，將子宮剝離器和動(dòng)物滅菌運(yùn)輸器用PVC套筒連接，2%過(guò)氧乙酸噴霧滅菌套筒，1 h后送風(fēng)過(guò)夜，排除設(shè)備內(nèi)殘余消毒液，備用。

1.2.2 屏障環(huán)境的維持

上述三種裝置始終在屏障設(shè)施下使用。需嚴(yán)格執(zhí)行屏障設(shè)施的操作規(guī)范。凈化豬舍的潔凈區(qū)各房間，采用1.5%～2%過(guò)氧乙酸噴霧消毒，一般每天1次。若實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)出次數(shù)增加，應(yīng)適當(dāng)增加消毒次數(shù)。

1.3 無(wú)菌仔豬的獲取

1.3.1 妊娠母豬術(shù)前準(zhǔn)備

動(dòng)物清潔間內(nèi)，母豬限位于移動(dòng)欄中，以溫水沖洗母豬體表，擦干；移動(dòng)至手術(shù)準(zhǔn)備間，用海綿刷子將母豬胸腹部全部涂抹碘伏；再將妊娠豬移至手術(shù)間，進(jìn)行異氟烷呼吸麻醉、綁定于手術(shù)床上。

1.3.2 剖腹產(chǎn)手術(shù)

待妊娠豬不動(dòng)時(shí)，對(duì)其整個(gè)腹部再次進(jìn)行碘伏消毒。之后，立即切開腹部，將整個(gè)子宮拉出，對(duì)子宮頸部結(jié)扎、割斷，將子宮浸入子宮剝離器的滅菌渡槽內(nèi)消毒10～20 s。接著兩名手術(shù)人員將子宮從渡槽拖出到剝離器內(nèi)的操作平臺(tái)上，從妊娠子宮中取出胎仔、擦干羊水、切斷臍帶。

1.3.3 仔豬的轉(zhuǎn)移

將取出的胎豬通過(guò)滅菌的PVC套筒，快速移至動(dòng)物無(wú)菌運(yùn)輸器中，密封運(yùn)輸器傳遞口上內(nèi)外密封罩，以盡量降低消毒液對(duì)仔豬的刺激?？衫秒姞t加熱運(yùn)輸器底部，保持在37℃左右，防止仔豬受凍。如有必要，對(duì)仔豬進(jìn)行人工輔助呼吸。以上手術(shù)操作時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)完成。

1.4 無(wú)菌仔豬的飼養(yǎng)

1.4.1 代乳料

飼喂無(wú)菌仔豬，采用60Co輻照、經(jīng)微生物檢測(cè)合格后的牛乳，加入維生素劑，制成無(wú)菌代乳料。考慮到市售豬用奶粉中添加有抗生素，推薦用無(wú)抗菌素的人用牛乳進(jìn)行制作。輻照代乳料應(yīng)按批次定期抽檢，對(duì)微生物檢測(cè)不合格的當(dāng)批次代乳料全部不予使用，并及時(shí)移出潔凈存放間。

1.4.2 人工哺乳與保溫

無(wú)菌仔豬在飼養(yǎng)隔離器內(nèi)哺乳。一般，新生仔豬取出后數(shù)小時(shí)內(nèi)第1次哺乳。仔豬無(wú)需奶瓶等強(qiáng)制授乳，只需將滅菌牛乳倒入隔離器內(nèi)各食槽即可。最初可將仔豬嘴部輕按入食槽，仔豬基本即可自行采食。3日齡前，每天早晚兩次給料，每次約200 mL；4日齡后逐漸增加給料量，每次250～500 mL。不必給水。3周齡后，可補(bǔ)充適量輻照米粉。

新生無(wú)菌仔豬必須注意保溫。從子宮滅菌用的消毒液，胎仔的取出、新生仔豬的無(wú)菌運(yùn)輸以及隔離飼養(yǎng)過(guò)程都需要加強(qiáng)保溫措施。3日齡內(nèi)，飼養(yǎng)隔離器內(nèi)溫度應(yīng)保持在35～37℃，可采用電爐從隔離器底部加熱；1周齡內(nèi)，隔離器內(nèi)溫度應(yīng)維持在32～35℃；此后逐漸降低，3周齡時(shí)隔離器內(nèi)溫度不宜低于25℃。

2 無(wú)菌豬培育的微生物學(xué)質(zhì)量控制

2.1 飼養(yǎng)環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)

2.1.1 屏障設(shè)施

無(wú)菌豬獲取與飼養(yǎng)設(shè)備都必須在屏障設(shè)施內(nèi)，屏障設(shè)施必須依據(jù)GB 14925-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》中無(wú)菌動(dòng)物生產(chǎn)間和實(shí)驗(yàn)間的環(huán)境技術(shù)指標(biāo)要求，設(shè)計(jì)、裝修、運(yùn)行以及日常監(jiān)測(cè)。

2.1.2 隔離器

隔離器用于獲取、運(yùn)輸和飼養(yǎng)無(wú)菌豬。根據(jù)GB 14925-2010的要求，潔凈度應(yīng)達(dá)到5級(jí)，空氣沉降菌檢測(cè)應(yīng)無(wú)檢出。

2.2 飼料和飲水的微生物檢測(cè)

無(wú)菌豬用的飲水、飼料標(biāo)本微生物學(xué)檢測(cè)方法參見(jiàn)GB/T 14926.41-2001。標(biāo)本采集后，分別用腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鈉肉湯富集，在需氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)7 d以上，再轉(zhuǎn)接到血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下24 h后觀察是否存在細(xì)菌生長(zhǎng)；同時(shí)，涂片與革蘭染色，顯微鏡檢查，最終判斷是否存在細(xì)菌污染。

2.3 妊娠母豬的質(zhì)量監(jiān)測(cè)

宜根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的豬種：當(dāng)以畜牧研究為主或短期實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇榮昌豬、太湖豬等地方品種或約克夏等大型品種；若以醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究為主或長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇巴馬小型豬等品種。

妊娠豬要求未注射PRRS弱毒疫苗，應(yīng)外觀健康、無(wú)異常；應(yīng)在良好的飼養(yǎng)管理下，且從豬病少的豬場(chǎng)中選擇。不宜選擇初產(chǎn)和第六胎次以上的，且臨床上排除經(jīng)胎盤垂直傳播的四種疾病，即豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、細(xì)小病毒病。本實(shí)驗(yàn)室病原篩查方法參照GB/T16551、GB/T18641、NY/T679和NY/T2840執(zhí)行。

2.4 無(wú)菌豬微生物質(zhì)量監(jiān)測(cè)

無(wú)菌動(dòng)物的微生物檢測(cè)范圍基本一致，都涉及細(xì)菌、病毒、真菌的檢測(cè)[8]。目前，我國(guó)未頒布無(wú)菌豬微生物檢測(cè)國(guó)標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室主要通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌分離與培養(yǎng)、血涂片檢測(cè)等技術(shù)，建立了一套無(wú)菌豬質(zhì)量控制的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用隨機(jī)抽樣法對(duì)隔離設(shè)施內(nèi)豬群進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

2.4.1 細(xì)菌檢測(cè)

采用最常用的病原菌分離與培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)。采集豬肛門拭子、鼻拭子或新鮮糞便樣品，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48 h及以上；同時(shí)，對(duì)樣品涂片、革蘭染色后顯微鏡檢查。

2.4.2 真菌檢測(cè)

無(wú)菌豬的真菌檢測(cè)一般采用大豆蛋白胨培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。皮膚真菌一般在25℃培養(yǎng)，深部真菌在37℃時(shí)培養(yǎng)7 d。根據(jù)培養(yǎng)基上菌落及特點(diǎn)，判斷是否存在真菌污染。有時(shí)，還需借助于生物化學(xué)反應(yīng)結(jié)果和免疫學(xué)方法進(jìn)行最后診斷。

2.4.3 病毒檢測(cè)

可感染豬的病毒有數(shù)百種之多，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)每一種病毒都進(jìn)行檢測(cè)是不現(xiàn)實(shí)的。我們綜合無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果，選擇四種能在豬上進(jìn)行垂直傳播病毒進(jìn)行無(wú)菌豬質(zhì)量監(jiān)控，他們是：豬瘟病毒、細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

2.4.4 微生物檢測(cè)采樣要求

動(dòng)物檢測(cè)數(shù)量根據(jù)無(wú)菌豬飼養(yǎng)群體而確定。由于本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的無(wú)菌豬隔離器內(nèi)最多可飼養(yǎng)四頭無(wú)菌豬，因此隨機(jī)取樣數(shù)量為一頭/隔離器。每2～4周檢測(cè)一次動(dòng)物的生活環(huán)境標(biāo)本和糞便標(biāo)本。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者表示該群動(dòng)物有該病原體感染的存在，必須及時(shí)淘汰整個(gè)隔離器內(nèi)所有動(dòng)物體；并對(duì)該隔離器進(jìn)行嚴(yán)格消毒滅菌處理后，再次檢查合格后使用。

3 無(wú)菌豬制備的關(guān)鍵質(zhì)量控制點(diǎn)

3.1 豬的品種選擇

培育無(wú)菌豬的目的主要是為了研究菌群和宿主的作用，而菌群的定植與宿主的遺傳背景密切相關(guān)，不同品種的豬其體內(nèi)微生物定植各不相同，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌x擇不同品種的實(shí)驗(yàn)用豬。如在畜牧業(yè)研究方面，研究菌群對(duì)某品種豬飼料消化吸收的影響，可選擇對(duì)應(yīng)品種的豬培育無(wú)菌豬。而在醫(yī)學(xué)研究方面，為保證重復(fù)性和操作方便，建議選擇封閉群或近交系小型豬，如巴馬豬等。

3.2 滅菌方法的選擇

3.2.1 物品滅菌

進(jìn)入屏障環(huán)境和無(wú)菌豬飼養(yǎng)隔離器內(nèi)的物品都必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理。一般，耐熱、耐高壓物品，如手術(shù)器械、器具，應(yīng)首選壓力蒸汽滅菌；不耐熱、不耐濕的物品，如采樣拭子、采血針等宜采用環(huán)氧乙烷等低溫滅菌方法。無(wú)菌豬生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)用大型籠具，宜采用低溫甲醛熏蒸滅菌方法。而無(wú)菌豬用袋裝輻照日糧則由紫外傳遞窗轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境，并在使用前1 d放入飼養(yǎng)隔離器上滅菌套筒內(nèi)，用2%過(guò)氧乙酸噴霧滅菌后靜置1 h以上，轉(zhuǎn)入隔離器內(nèi)，待用。

3.2.2 飲水滅菌

屏障設(shè)施內(nèi)用水為純水。純水經(jīng)裝瓶、高溫、高壓滅菌處理，冷卻后經(jīng)隔離器上滅菌套筒，用2%過(guò)氧乙酸消毒瓶子表面后靜置1 h以上，轉(zhuǎn)入隔離器內(nèi)，作為無(wú)菌豬的飲用水。

3.3 無(wú)菌豬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

無(wú)菌豬不含任何現(xiàn)有方法檢測(cè)出活的微生物。其無(wú)菌是一個(gè)相對(duì)的概念，不是一個(gè)絕對(duì)的概念。目前存在數(shù)百種可以感染豬的病毒，而沒(méi)有一種通用方法可一次檢測(cè)出是否發(fā)生病毒感染，在實(shí)際工作中同時(shí)對(duì)數(shù)百種病毒進(jìn)行檢測(cè)也不現(xiàn)實(shí)。因此在制定無(wú)菌豬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要統(tǒng)籌考慮標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性和可操作性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，采用無(wú)菌剖腹產(chǎn)獲得無(wú)菌豬，只要細(xì)菌檢測(cè)達(dá)到無(wú)菌要求，可排除外源病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，只需對(duì)四種能通過(guò)母胎屏障垂直傳播的四種病毒進(jìn)行檢測(cè)，即可保證無(wú)菌豬的質(zhì)量要求。

3.4 科學(xué)協(xié)作提高成功率

無(wú)菌豬的培育牽涉到多門學(xué)科知識(shí),環(huán)節(jié)復(fù)雜，任何一個(gè)細(xì)節(jié)的疏忽和過(guò)程銜接的失誤都會(huì)導(dǎo)致無(wú)菌豬培育的失敗。因此，需要科學(xué)合理設(shè)置崗位，制定詳細(xì)的崗位職責(zé)和操作規(guī)程，確保日常培訓(xùn)管理到位。崗位設(shè)置至少包括項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理人員、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)人員、動(dòng)物飼養(yǎng)員、環(huán)境保潔員、設(shè)備操作與維護(hù)人員等。同時(shí)，做好“空氣流”、“動(dòng)物流”、“物品流”和“人流”這四流進(jìn)出設(shè)施的凈化處理，建立和執(zhí)行完善的規(guī)章制度和操作規(guī)程，才能保障屏障設(shè)施和隔離器的規(guī)范化運(yùn)營(yíng)，培育獲得質(zhì)量合格的無(wú)菌豬。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著腸道菌群功能研究的日益深入，對(duì)無(wú)菌豬的需求也隨之日益增加，但在實(shí)際工作中,要培育獲得無(wú)菌豬并長(zhǎng)期維持無(wú)菌狀態(tài)并非易事。無(wú)菌豬的培育離不開妊娠母豬的質(zhì)量控制、飼料質(zhì)量控制、環(huán)境與設(shè)施設(shè)備質(zhì)量保證以及微生物質(zhì)量監(jiān)測(cè)，是一項(xiàng)復(fù)雜而細(xì)致的系統(tǒng)工程，與人員的管理，設(shè)備的維護(hù)、操作規(guī)程和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的制定等因素息息相關(guān)。因此需要科學(xué)合理的統(tǒng)籌安排，嚴(yán)格細(xì)致的執(zhí)行操作規(guī)程，精益求精的工作態(tài)度才能為科學(xué)研究培育出合格的無(wú)菌豬。

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Breedingandmicrobiologicalqualitycontrolofgerm-freepigs

SUN Jing1,2,3,DU Lei1,4,DING Yu-chun1,2,3,WU Meng1,2,3,LUO Lin1,2,3,YANG Song-quan1,2,3,HUANG Yong1,2,3,CAO Hao-ran1,2,3,ZHONG Hao5,LIU Zuo-hua1,2,3*,GE Liang-peng1,2,3*

(1.Chongqing Academy of Animal Husbandry Sciences,Chongqing 402460,China； 2.Key Laboratory of Pig Industry Science,Ministry of Agriculture,Chongqing 402460； 3.Chongqing Key Laboratory of Pig Industry Sciences,Chongqing 402460； 4.Chongqing BEST Bio-Technology Company Limited,Chongqing 402460)

The industry of germ-free animals has been a hot spot in research along with the rapid development of studies on the relationship between microbiota and host diseases.Because it is pathogen-free,and the high degree of similarity in anatomy,physiology,pathogenesis to humans,germ-free pig is considered a clinical relevant model to be widely used in life science research.Based on the current state of research of germ-free pig cultivation at home and abroad and the experimental studies carried out in our laboratory as well,this article gives a simple discussion on germ-free technique of domestic pigs.

Germ-free pig; Barrier environment; Rearing isolator; Microbiological control

GE Liang-peng.E-mail: geliangpeng1982@163.com; LIU Zuo-hua.E-mail: liuzuohua66@163.com

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2017YFD0501600)；重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(No.17306)；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(No.16422)；重慶市農(nóng)發(fā)資金項(xiàng)目(No.17408)。

孫靜，女，博士，研究方向：無(wú)菌豬的培育與應(yīng)用。E-mail: sunjing85026@163.com

葛良鵬，男，博士，研究方向：動(dòng)物資源創(chuàng)新開發(fā)利用。E-mail: geliangpeng1982@163.com；

劉作華，男，博士，研究方向：地方豬資源保護(hù)與利用。E-mail: liuzuohua66@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0699-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.021

2017-09-11