王 政，張大偉

（青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島266061）

抗生素替代技術(shù)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

王 政*，張大偉

（青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島266061）

抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥菌問題嚴重制約著畜牧業(yè)的健康發(fā)展，如今急需研發(fā)抑制多重耐藥菌的新型抗菌物質(zhì)。本文主要針對抗生素替代技術(shù)進行探討，其中包括疫苗、抗菌肽、噬菌體、植物精油和外排泵抑制劑，以期控制由多重耐藥菌帶來的感染。

畜牧業(yè)；耐藥菌；抗生素替代

The potential threat to animal husbandry results from inappropriate antibiotic use is significant.It is urgent to explore new technology that could one day replace the use of antibiotics in livestock.In this pater，the next-generation technologies of antibiotic alternatives were discussed，including vaccines，antimicrobial peptides，bacteriophages，essential oils and efflux pump inhibitors to control the infections caused by multi-drug-resistant pathogens.

animal husbandry；antibiotic-resistant bacteria；antibiotic alternatives

抗生素能有效治療畜禽動物的腸道疾病和其他感染，對肉雞的大腸桿菌病、傷風(fēng)、禽霍亂、支原體病和沙門氏菌感染都有效果，但是抗生素不正確的使用方式會導(dǎo)致致病菌的抗性水平不斷升高，目前耐藥菌問題已經(jīng)引起社會廣泛關(guān)注。美國和日本陸續(xù)出臺了畜禽養(yǎng)殖中限用和禁用抗生素的相關(guān)法規(guī)，合理使用抗生素、積極應(yīng)對耐藥菌感染也成為我國高度重視的問題，本文主要對下一代抗生素替代技術(shù)，比如疫苗、抗菌肽、噬菌體、植物精油和外排泵抑制劑進行了探討，以期有效控制由多重耐藥菌引起的感染。

1 抗性機制

細菌產(chǎn)生抗性通常是由于抗菌藥物使用不當(dāng)對細菌產(chǎn)生選擇壓力造成的，在持續(xù)的選擇壓力下，細菌對抗生素產(chǎn)生抗性并將抗性基因傳播給其他細菌（Levy 和 Marshall，2004）?？剐詸C制一般分為四類：第一類是抗生素被蛋白酶水解失活；第二類是抗生素作用的靶點被修飾；第三類是細菌細胞壁發(fā)生改變使抗菌物質(zhì)不能與細菌靶點相結(jié)合；第四類是細菌通過外排泵泵出抗菌物質(zhì)，使藥物在細胞內(nèi)的蓄積減少。外排泵又分為五個家族：MFS家族（促進因子超家族）、MATE家族（與多重耐藥和有毒化合物排出機制相關(guān)）、RND（與耐藥結(jié)節(jié)細胞分化機制相關(guān)）超家族、SMR家族 （與多重耐藥機制相關(guān)）和ABC（與ATP結(jié)合機制相關(guān)）轉(zhuǎn)移因子家族（Spellberg等，2013；Eda等，2011），這些抗菌機制使臨床上抗生素的效用大幅降低。

2 抗生素替代技術(shù)

2.1 抗菌肽 抗菌肽是多種生物的第一道防線，其中包括植物 （Mandal等，2013；Roy 等，2013）、人、昆蟲和其他無脊椎動物、兩棲動物、鳥類、魚類和哺乳動物（Wang 等，2004；Martin 等，1995）。 自然界中大多數(shù)抗菌肽都比較短（＜100個氨基酸殘基），為陽離子肽，通常具有兩親特性。這使得抗菌肽能夠結(jié)合并插入到細胞膜脂質(zhì)雙分子層中，并在細胞膜上形成孔洞。研究表明，抗菌肽還可以與核酸結(jié)合，抑制細菌合成核酸，破壞蛋白質(zhì)合成，或抑制細菌酶活。這些特點使得抗菌肽能夠與傳統(tǒng)的抗生素治療形成互補 （Hancock和 Sahl，2006；Jenssen 等，2006）。

有研究表明，抗菌肽能夠有效促進肉仔雞生長和腸道健康，但是在預(yù)防疾病方面抗菌肽的效果差異很大 （European Medicines Agency，2017）。Wang 等（2016、2015）認為，雞上使用抗菌肽可以使其日增重最高提高7個百分點 （Choi等，2013），體外試驗也證明，肉仔雞和豬使用抗菌肽可以改善其腸道健康，抑制有害菌并促進有益菌的生長，降低肉仔雞腸道內(nèi)的致病菌。此外，抗菌肽能提高豬的體重并有效預(yù)防疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比仔豬斷奶后使用抗菌肽體重顯著增加，使用抗菌肽與使用抗生素的仔豬體增重相近（Wu等，2012）。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，奶牛使用抗菌肽，可顯著提高其生長性能，并有效預(yù)防和治療乳房疾?。―iez-Gonzalez，2010）。 實際上當(dāng)奶牛不能正常產(chǎn)奶時有一種特殊的抗菌肽——尼生素可用于治療和預(yù)防乳房感染，在奶牛擠奶前用此類產(chǎn)品對乳房進行消毒也能顯著降低乳房上的致病菌數(shù)量，但目前還只是在實驗室條件下的研究（Pieterse 和 Todorov，2010）。

為克服肽類藥物在藥理學(xué)、生物活性及毒性方面存在的缺陷 （Devocelle，2012；Haney 等，2012b；Cole 等，2003）， 目前已經(jīng)應(yīng)用了多種技術(shù)，比如縮短肽鏈的長度及優(yōu)化肽鏈組成，使其具有選擇性的抗菌能力；改變肽類藥物表面特性；對肽鏈上的氨基酸殘基進行有針對性的取代；利用計算機協(xié)助設(shè)計抗菌肽能夠準確預(yù)知肽段結(jié)構(gòu)及其生物活性（Fjell等，2012）。由于某些人工構(gòu)建的抗菌肽不受蛋白酶酶解作用的影響，因此利用多肽模擬技術(shù)能夠改善抗菌肽的藥物動力學(xué)特性。此外還有一些技術(shù)被用于抗菌肽的構(gòu)建，有研究將常用的抗生素連接到抗菌肽上，合成藥物對致病菌的選擇性增強，并且殺菌能力成倍增加 （Arnusch 等，2012；Pokrovskaya 和Baasov，2010）。 此外， 抗菌肽前體藥物（Desgranges等，2012）以及納米包被技術(shù)也備受關(guān)注?？咕牡募{米包被材料有脂質(zhì)體、多聚物、水凝膠、樹枝狀聚合物、碳納米管和DNA籠。這些技術(shù)的應(yīng)用使抗菌肽的抗菌活性升高、負作用減小，并且對蛋白酶降解具有明確的保護作用（Roy等，2013；Urbán 等，2012）。

由于抗菌肽合成和篩選的成本較高，具有一定的毒性，容易被蛋白酶酶解，且具有致敏作用，這都是臨床應(yīng)用的障礙。但是抗菌肽作用機制多樣、抗菌譜廣、能夠快速殺滅致病菌，而誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性的可能性較低，這是殺滅多重耐藥菌比較有前途的技術(shù)之一。人們對這些化合物進行了深入研究，試圖通過人工構(gòu)建合成抗菌肽。陽離子抗菌肽如多黏菌素、短桿菌肽S、桿菌肽和尼生素的使用效果已經(jīng)在臨床上得到證明，并得到廣泛應(yīng)用（Laverty等，2010）。然而不當(dāng)使用抗菌肽仍有可能促使微生物產(chǎn)生抗性，如何規(guī)避此類問題是當(dāng)前研究的重點。

2.2 噬菌體 使用噬菌體治療細菌感染也是一種潛在的治療方式，噬菌體是細菌病毒，即細菌的致病菌。在感染的最后階段噬菌體可特異性攻擊和殺滅宿主細菌。根據(jù)對宿主菌的作用方式不同，噬菌體一般分為兩大類：溫和型噬菌體和烈性噬菌體。烈性噬菌體侵染宿主菌后在宿主細胞中大量繁殖，并導(dǎo)致細菌裂解，在最后階段可以釋放出新形成的噬菌體顆粒。溫和型噬菌體則是通過溶原途徑將自身的基因組整合到宿主基因組中，其以休眠的狀態(tài)隨著宿主細胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制而復(fù)制，當(dāng)宿主細菌遇到不利環(huán)境時休眠狀態(tài)的噬菌體就會被激活，進入裂解模式。最后階段新生成的噬菌體顆粒會從裂解的細胞中釋放出來。

與抗生素相比，細菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的可能性較低，此外，噬菌體還具有抗生素不具備的一些優(yōu)勢，當(dāng)宿主重復(fù)使用抗生素時，抗生素的殺菌效果會由于細菌的代謝或外排泵的排出而降低。對于噬菌體而言，在不同階段只需要提高噬菌體使用滴度即可，不需要重復(fù)使用。并且由于噬菌體的高度特異性不會對宿主微生物區(qū)系造成影響。盡管噬菌體可能攜帶有毒力因子，但是通過對噬菌體基因序列的全面了解將有助于在實際應(yīng)用中克服這個問題（Skurnika 和 Strauch，2006），具有特異性殺菌能力、無毒力因子的噬菌體將來可能被廣泛用于治療致病菌的感染。

目前使用噬菌體治療的僅有俄國和格魯吉亞，這兩國使用噬菌體治療傳統(tǒng)抗生素難以治療的細菌感染（Parfitt，2005；Karl，2004），噬菌體技術(shù)還被用于關(guān)注動物健康的獸藥領(lǐng)域，噬菌體在肉雞養(yǎng)殖中被用于預(yù)防和治療疾病，并取得了很好的效果。比如在試驗條件下用大腸桿菌攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體能保護肉雞免受呼吸道疾病的困擾（Huff等，2004）。同樣使用針對腸炎沙門氏菌的噬菌體雞尾酒療法可成功治療沙門氏菌對1日齡肉仔雞的感染（Fiorentin等，2005）。噬菌體還曾成功用于治療肉雞的大腸桿菌病，噬菌體對死亡率的降低作用與使用恩氟沙星的對照組相同（Huff等，2004）。噬菌體在仔豬和牛上也取得了很好的效果，噬菌體可顯著降低由大腸桿菌造成的腹瀉，并成功用于仔豬的治療（Johnson等，2008）?；谑删w的特性，噬菌體還被推薦應(yīng)用于食品工業(yè)，以預(yù)防食物及其表面的食物源致病菌感染（Borysowski等，2011），比如在肉和家禽制品中作為食品添加劑使用的噬菌體LMP-102，可用以預(yù)防單核增生李斯特菌的感染（Daniells，2006）。

盡管噬菌體治療有許多優(yōu)勢，但是也存在有一些問題，比如重復(fù)使用噬菌體會刺激機體產(chǎn)生抗體，宿主脾臟會快速吸收噬菌體并使其失活，在治療過程中細菌裂解產(chǎn)生的內(nèi)毒素會釋放出來，適用的宿主菌過少，細菌可能對噬菌體產(chǎn)生抗性等，因此，在將來的使用中必須對其進行嚴格審核（Lu 和 Koeris，2011）。

2.3 植物精油 精油是由植物合成的具有揮發(fā)性的芳香族類化合物，其具有抗細菌、真菌以及病毒特性，能夠驅(qū)趕草食性昆蟲和草食性動物。中草藥和香料中的芳香族類物質(zhì)有助于食品的保鮮，無論是體外試驗（Ouwehand等，2010）還是體內(nèi)試驗（Tiihonen等，2010）精油的抗菌活性都得到了廣泛的認同（Kalemba和 Kunicka，2003）。 體外試驗證明將不同的精油混合起來要比單一的精油抗菌活性更佳，這表明不同的精油之間具有協(xié)同效應(yīng)，根據(jù)協(xié)同的原理，將百里酚和肉桂醛以適當(dāng)?shù)谋壤旌?，該混合物對有害菌具有抗菌作用，而對于有益菌沒有任何影響。

植物精油囊括了一大類結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性不相同的化合物，比如肉桂醛是一種脂肪醛，而香芹酚和百里酚則為酚類化合物。由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，因此其抗菌機理也完全不一樣。一般說來，這兩類化合物都能破壞微生物細胞膜的完整性并損壞其功能（Di Pasqua等，2007），精油的抗菌功能應(yīng)該不止一種作用模式，精油獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其能夠與細胞膜上多個位點相結(jié)合，這使得精油對許多種類的微生物都具有抑制效果。

單萜酚如百里酚和香芹酚能夠通過氫鍵與微生物細胞膜發(fā)生作用，使細胞膜和線粒體通透性增加，并破壞細胞外膜的完整性，它們能抑制大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、熒光假單胞菌和熱死絲環(huán)菌的生長（Di Pasqua 等，2010、2007）。 苯基丙烷如肉桂醛通過羧基與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制微生物酶如氨基脫羧酶的活性（Burt，2004），研究表明，肉桂醛可抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌和脆弱擬桿菌的生長，但是對長雙歧桿菌或嗜酸乳酸桿菌沒有影響（Lee 和 Ahn，1998）。

有研究表明，在小麥型日糧中添加精油混合物可增加42日齡肉仔雞體重并降低死亡率（Tiihonen等，2010），在這個試驗中肉仔雞生產(chǎn)性能的改善有賴于采食量的增加以及腸道微生物區(qū)系的改善。Li等（2012）通過斷奶仔豬試驗發(fā)現(xiàn)，精油混合物可增加仔豬的采食量和體重，提高糞便中乳酸桿菌數(shù)量并減少大腸桿菌數(shù)量，在仔豬日糧中添加精油混合物可促進淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，并提高吞噬率，從而使血漿中免疫球蛋白（IgA，IgM）和補體（C3和C4）水平升高。

2.4 疫苗 疫苗已經(jīng)在醫(yī)藥中獲得廣泛應(yīng)用以預(yù)防由病毒或某些細菌造成的疾病，疫苗是比較有前途的抗生素替代產(chǎn)品（Oliver等，2007）。研究表明，有部分疫苗能夠有效提高動物的生長速率和生產(chǎn)性能（Schmoll等，2009）。

動物使用疫苗會刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。據(jù)報道，美國有超過70%的養(yǎng)殖場給仔豬（如哺乳階段）進行免疫以預(yù)防支原體肺炎，還有將近60%的養(yǎng)牛場給牛進行免疫以預(yù)防由氣腫疽梭菌誘發(fā)的梭菌病 （U.S.Department of Agriculture，2012）。胞內(nèi)勞森菌能誘發(fā)豬嚴重的回腸炎癥，可以給豬免疫特異性殺滅胞內(nèi)勞森菌的疫苗，研究表明，這種疫苗減少了丹麥養(yǎng)豬業(yè)對土霉素的使用（Bak 和 Rathkjen，2009），在美國估計有 26%的養(yǎng)豬場免疫了針對胞內(nèi)勞森菌的疫苗（U.S.Department of Agriculture，2012）。

但是疫苗的使用存在一些問題。比如許多疫苗需要進行注射，這將導(dǎo)致勞動成本增加，并且處理過程中造成的應(yīng)激也會刺激動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答（Marangon 和 Busani，2007），影響動物生產(chǎn)性能。并且有些疫苗抗菌譜或抗病毒譜很窄，僅對此類微生物有效，而另一些微生物仍舊會誘發(fā)疾?。–heng 等，2014）。

2.5 外排泵抑制劑 耐藥菌產(chǎn)生耐藥的機制之一是外排泵作用，細菌可以將進入細胞內(nèi)的抗生素重新泵出細胞外，與泵出機制有關(guān)的轉(zhuǎn)移因子為血漿膜轉(zhuǎn)位酶，外排泵通過藥物或質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運將進入細胞內(nèi)的抗生素重新泵出胞外，這是大腸桿菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌和金黃色葡萄球菌通用的耐藥機制（Takiff等，1996）。

為了恢復(fù)抗生素的效用，較好的方法是抑制外排泵的活性，具有抑制外排泵活性的化合物被稱為外排泵抑制劑。但是目前市場上外排泵抑制劑非常少，從自然界進行篩選或者通過人工合成的方式獲得受到極大的關(guān)注，對這些化合物結(jié)構(gòu)進行修改將提高其抑制活性，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大類隸屬于不同家族的化合物具有外排泵抑制作用 （Holler等，2012a、2012b；Brincat等，2011）。一些植物來源的 NorA EPIs及其衍生物都具備抑制作用（Kalia等，2012），Maurya等（2013）曾對跨膜肽進行人工構(gòu)建，可以作為拮抗劑選擇性的阻塞藥物外排泵，并抑制臨床上對chemosensitize azole產(chǎn)生耐藥的白色念珠菌（Maurya等，2013）。外排泵抑制劑的最大優(yōu)勢是能夠減緩抗性基因的發(fā)展趨勢，但也存在很多缺陷，比如結(jié)構(gòu)龐大難以化學(xué)合成、存在可溶性和滲透性問題、需要較高的使用劑量、由于空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致活性降低等，為了克服這些缺陷，需要對這些化合物進行認真的設(shè)計和合理的構(gòu)建。

3 小結(jié)

人們對耐藥菌的關(guān)注推進了對現(xiàn)有抗生素的改進以及新型抗菌物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，尋找新型抗菌物質(zhì)的方式有：從自然環(huán)境中尋找抗菌物質(zhì)，人工合成抗菌物質(zhì)。來自自然環(huán)境（如抗菌肽、植物精油、外排泵抑制劑）的抗菌物質(zhì)在分離和提純過程中存在缺陷，從環(huán)境中篩選到抗菌化合物后再進行人工合成將是降低生產(chǎn)成本的方法，這可能是將來提供抗菌物質(zhì)的主要方式。

目前所面臨的最主要挑戰(zhàn)是找到高效分離和純化技術(shù)，開發(fā)出能有效應(yīng)對多重耐藥菌的安全、新型抗菌物質(zhì)。對已有抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和作用機制深入了解將有助于人們合理設(shè)計出更多的新型藥物，并且抗菌物質(zhì)和抗生素進行聯(lián)用也有可能成為將來的選項之一。

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S816.3

A

1004-3314（2017）24-0030-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172407

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