茅燕勇，李文謙，王朝宇，時(shí) 號

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

油脂化工

固定化脂肪酶催化桐油制備生物柴油的研究

茅燕勇，李文謙，王朝宇，時(shí) 號

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

對磁性Fe3O4納米粒固定化脂肪酶催化桐油制備生物柴油進(jìn)行了研究，分步探討了硼酸鹽緩沖液用量、固定化酶用量、醇油摩爾比、反應(yīng)溫度、固定化酶清洗與否對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響，以及固定化酶的操作穩(wěn)定性。結(jié)果表明：將正己烷與桐油體積比定為2∶1，然后加入與桐油等摩爾的甲醇、桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液及7.5 mg/mL(以桐油體積計(jì))固定化酶，反應(yīng)5 h和12 h各加入與桐油等摩爾的甲醇(總的醇油摩爾比3∶1)，并每次添加甲醇前用丙酮清洗固定化酶，45℃、200 r/min 反應(yīng)26 h后，甲酯轉(zhuǎn)化率可達(dá)91.2%。該固定化脂肪酶連續(xù)催化10批次反應(yīng)后，甲酯轉(zhuǎn)化率仍然可達(dá)84.1%，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

磁性Fe3O4納米粒；固定化脂肪酶；桐油；生物柴油；轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

生物柴油是一類可再生、能替代石化柴油的能源，其化學(xué)組成為長鏈脂肪酸單酯，可用酸、堿或酶催化油脂與短鏈醇發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備[1]。酶催化法較酸、堿催化法而言，具有條件溫和、醇用量小、轉(zhuǎn)酯率高、污染小等優(yōu)勢，近年來得到廣泛研究。其中，固定化脂肪酶催化法既克服了游離脂肪酶催化時(shí)存在的易結(jié)塊、不易回收、產(chǎn)品分離困難等缺點(diǎn)[2]，又具有較好的操作穩(wěn)定性[3]，因而得到了更多的關(guān)注。

目前，世界各國多使用產(chǎn)量占優(yōu)的油脂作為生物柴油原料，美國、歐洲、東南亞國家分別使用大豆油、菜籽油、棕櫚油作為生物柴油的主原料[1,4-5]。油桐(Aleuritesfordii)是我國四大木本油料植物之一，廣泛種植于我國10多個(gè)省區(qū)[6]，種植面積和桐油產(chǎn)量占世界總量80%以上[4]。桐油各組分平均相對分子質(zhì)量894.55、平均碳數(shù)18[7]，以此制備的生物柴油能滿足石化柴油平均碳數(shù)15～22的要求。研究表明，以桐油為原料制備的生物柴油符合國家生物柴油標(biāo)準(zhǔn)[8]，按一定比例添加于0#石化柴油可提升動(dòng)力性能并減輕排放污染[9-10]。因此，我國若以桐油為原料發(fā)展生物柴油，可減少桐油低端產(chǎn)品出口量、提升桐油經(jīng)濟(jì)價(jià)值、促進(jìn)能源經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

本文對磁性Fe3O4納米粒固定化脂肪酶催化桐油制備生物柴油的工藝條件進(jìn)行研究，為實(shí)現(xiàn)以桐油為原料酶法制備生物柴油提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

市售四川綿陽產(chǎn)脫膠桐油，市售分析純甲醇、丙酮、正己烷、硼酸、硼酸鈉、2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES，Sigma)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，Sigma)、碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl，Sigma)，脂肪酶(來自Candidarugosa，2 U/mg，Sigma)，自制羧基化磁性Fe3O4納米粒(Mr為2 000 Da的雙末端羧基聚乙二醇PEG修飾)。

JJ-1B恒速攪拌器，HH-2水浴鍋，DHZ-C恒溫?fù)u床，XPE-105天平，島津GC-14B氣相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化脂肪酶的制備

取含鐵5 mg/mL羧基化磁性Fe3O4納米粒水溶液50 mL，磁分離并用98 mL MES緩沖液分散，先后加入現(xiàn)配的等濃度(2.8×10-2mmol/mL)EDCl-MES和NHS-MES各1 mL，25℃、120 r/min活化25 min，磁分離純水洗3次，硼酸鹽緩沖液(pH 8.0，0.02 mol/L，下同)復(fù)溶至100 mL，然后迅速加入到含350 mg脂肪酶的100 mL硼酸鹽緩沖液中，25℃、150 r/min反應(yīng)1 h，磁分離收集沉淀，立即與25 mL純水混勻后凍干備用，橄欖油乳化法[11]測表觀比酶活約1.0 U/mg。

1.2.2 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

在50 mL三口圓底燒瓶中加入10 mL桐油及20 mL正己烷，同時(shí)加入一定量的甲醇后，置于水浴鍋中加熱至反應(yīng)溫度并保溫，200 r/min攪拌，然后加入適量固定化脂肪酶和硼酸鹽緩沖液，反應(yīng)一定時(shí)間并適時(shí)取樣分析。

1.2.3 脂肪酸甲酯的測定

參照文獻(xiàn)[7]方法并調(diào)整：樣品磁分離除酶，正十三烷作內(nèi)標(biāo)，氣相色譜儀檢測。氣相色譜條件：Rtx-1毛細(xì)管石英柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度300℃，汽化室溫度290℃，高純氮?dú)庾鬏d氣，氫氣流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，氮?dú)饬髁?5 mL/min；柱溫為初溫140℃保持1 min，然后以10℃/min升溫至280℃；分流比50∶1，進(jìn)樣量2 μL。

甲酯轉(zhuǎn)化率=已生成脂肪酸甲酯的質(zhì)量/桐油全部轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯的質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 硼酸鹽緩沖液用量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

在燒瓶中加入0.45 mL甲醇和10 mL桐油(醇油摩爾比1∶1)及20 mL正己烷，開啟攪拌，加入3.0 mg/mL(以桐油體積計(jì)，下同)固定化酶凍干粉，分別加入桐油體積0%～10%的硼酸鹽緩沖液，200 r/min、45℃反應(yīng)24 h，每2 h時(shí)取100 μL上清測定甲酯轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖1。

圖1 硼酸鹽緩沖液用量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

由圖1可知，反應(yīng)體系中加入桐油體積2%～8%的硼酸鹽緩沖液，對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)產(chǎn)生促進(jìn)作用，這可能與硼酸鹽緩沖液提供給固定化酶所必需的適當(dāng)pH及微量水分有關(guān)。添加桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液時(shí)，甲酯轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)33%左右；而加入桐油體積10%的硼酸鹽緩沖液時(shí)，則對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，甲酯轉(zhuǎn)化率僅有17.73%。同時(shí)，不添加硼酸鹽緩沖液時(shí)甲酯轉(zhuǎn)化率也可達(dá)30.35%。這可能是因?yàn)楣潭ɑ钢杏H水性PEG在凍干過程中保留了微量水分，從而能在反應(yīng)時(shí)給予脂肪酶一定量的“必需水”以保持較高的酶活；同時(shí)，在一定的含水率范圍內(nèi)，該雙末端羧基PEG鏈狀分子可能通過鏈的收縮與伸展，使脂肪酶始終處于油水界面上而獲得較高的催化效率。從獲得較高的甲酯轉(zhuǎn)化率方面考慮，硼酸鹽緩沖液用量為桐油體積的6%為佳。

2.2 固定化酶用量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

酶反應(yīng)時(shí)，在一定范圍內(nèi)提高酶的濃度，可增加酶與底物的接觸概率，從而獲得高反應(yīng)速率并快速達(dá)到平衡；酶的濃度相對于底物達(dá)到飽和時(shí)，再提高酶的濃度無益于反應(yīng)速率的提高。在加入桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液時(shí)，改變固定化酶用量，其他條件不變，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，測定甲酯轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖2。

圖2 固定化酶用量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)達(dá)到平衡的快慢與加入的固定化酶量呈正相關(guān)。在固定化酶用量為3.0 mg/mL時(shí)，達(dá)到平衡約需20 h；隨著固定化酶用量的增加，達(dá)到平衡所需的時(shí)間越來越短，當(dāng)固定化酶用量超過7.5 mg/mL 以后，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)僅需6 h即能接近平衡。因此，基于固定化酶能重復(fù)使用的特點(diǎn)，并考慮獲取較高的反應(yīng)效率，選擇固定化酶用量為7.5 mg/mL。

2.3 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

在一定范圍內(nèi)提高溫度可加速酶催化反應(yīng)，但溫度過高時(shí)又會(huì)加速酶的失活并增加能耗。因此，酶反應(yīng)的溫度應(yīng)控制在合適范圍內(nèi)。在反應(yīng)體系中加入桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液和7.5 mg/mL的固定化酶，改變反應(yīng)溫度，其他條件不變，反應(yīng)10 h，測試不同條件下的甲酯轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

由圖3可知，反應(yīng)溫度為45℃或50℃時(shí)，均可在反應(yīng)6 h左右接近平衡；反應(yīng)溫度為40℃或55℃時(shí)，需反應(yīng)8～10 h才能達(dá)到平衡。另外，反應(yīng)溫度為55℃時(shí)，雖然在反應(yīng)開始2 h內(nèi)反應(yīng)速率是最高的，但此后反應(yīng)速率卻有所降低，最終導(dǎo)致達(dá)到平衡的時(shí)間延長，這可能由于高溫引起部分酶失活引起的。因此，選擇以45℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

2.4 醇油摩爾比對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

在上述研究中，以醇油摩爾比1∶1探討了緩沖液用量、固定化酶用量、反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響。轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油時(shí)，甲醇和油脂完全反應(yīng)的理論摩爾比是3∶1。因此，需考慮醇油摩爾比對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響。

在反應(yīng)體系中加入桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液和7.5 mg/mL的固定化酶，設(shè)定反應(yīng)溫度為45℃，改變甲醇加入量以控制不同的醇油摩爾比，其他條件不變，反應(yīng)24 h，測試不同條件下的甲酯轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖4。

圖4 醇油摩爾比對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

由圖4可知，醇油摩爾比1.5∶1時(shí)，雖然反應(yīng)8 h后獲得的甲酯轉(zhuǎn)化率是最高的，但這可能是因?yàn)榧状剂肯鄬^高引起的。醇油摩爾比較高時(shí)，實(shí)際甲酯轉(zhuǎn)化率低于理論值，其原因可能是：雖然親水性載體能通過“吸水”供給脂肪酶“必需水”，但又因?yàn)椤拔睂?dǎo)致甲醇更易在固定化酶上富集，最終引起酶的失活。因此，酶催化桐油和甲醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)時(shí)，添加甲醇須采用分批或流加方式。本研究中，反應(yīng)體積較小，因而選擇分批方式加入甲醇：即0 h加入甲醇(0.45 mL)至醇油摩爾比1∶1；甲醇轉(zhuǎn)化90%以上時(shí)補(bǔ)加甲醇(0.45 mL)至醇油摩爾比2∶1；甲醇再次轉(zhuǎn)化90%以上時(shí)補(bǔ)加甲醇(0.45 mL)至總的醇油摩爾比3∶1。

2.5 固定化酶用丙酮清洗與否對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

有研究[12]認(rèn)為，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物甘油會(huì)粘附在固定化酶表面并影響酶的活性，而使用丙酮對固定化酶進(jìn)行清洗可恢復(fù)酶的活性。在反應(yīng)體系中加入20 mL正己烷和10 mL桐油，并添加桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液和7.5 mg/mL的固定化酶，按2.4中的分批方式添加甲醇，45℃、200 r/min反應(yīng)26 h，每次添加甲醇前用丙酮對固定化酶進(jìn)行清洗，同時(shí)以不清洗固定化酶作為對照，研究固定化酶用丙酮清洗與否對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 固定化酶用丙酮清洗與否對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)固定化酶用丙酮清洗的體系，甲醇首次和再次轉(zhuǎn)化達(dá)到90%的時(shí)間分別是5 h和12 h；而不清洗的體系，甲醇首次轉(zhuǎn)化達(dá)到90%的時(shí)間與前者相同，但再次轉(zhuǎn)化達(dá)到90%的時(shí)間則延遲到15 h；并且，兩者的甲酯轉(zhuǎn)化率在12 h以后差異顯著。由圖5可知，反應(yīng)26 h后，固定化酶用丙酮清洗的體系中甲酯轉(zhuǎn)化率達(dá)91.2%，遠(yuǎn)高于未清洗體系64.1%的甲酯轉(zhuǎn)化率。這說明，分批添加甲醇并同時(shí)用丙酮對固定化酶進(jìn)行清洗，可促進(jìn)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。

2.6 多批次反應(yīng)時(shí)固定化酶的反應(yīng)穩(wěn)定性

在以上優(yōu)化的條件下使用固定化脂肪酶進(jìn)行10批次反應(yīng)，每次反應(yīng)26 h，以甲酯轉(zhuǎn)化率考察該固定化酶的反應(yīng)穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。

表1 固定化脂肪酶的反應(yīng)批次及對應(yīng)的甲酯轉(zhuǎn)化率

由表1可知，該固定化脂肪酶反應(yīng)穩(wěn)定性較好，反應(yīng)10批次后，甲酯轉(zhuǎn)化率能保持84.1%，這可能與脂肪酶被共價(jià)固定化后，構(gòu)象得到加固，穩(wěn)定性得到增強(qiáng)有關(guān)。

3 結(jié) 論

在正己烷中，使用磁性Fe3O4納米粒固定化脂肪酶可高效催化桐油制備生物柴油。具體反應(yīng)條件為：將正己烷與桐油體積比定為2∶1，然后加入與桐油等摩爾的甲醇、桐油體積6%的硼酸鹽緩沖液及7.5 mg/mL(以桐油體積計(jì))的固定化酶，反應(yīng) 5 h和 12 h 各加入與桐油等摩爾的甲醇(總的醇油摩爾比3∶1)，且每次添加甲醇前用丙酮清洗固定化酶，45℃、200 r/min反應(yīng)26 h后，甲酯轉(zhuǎn)化率可達(dá)91.2%。該固定化脂肪酶穩(wěn)定性較好，連續(xù)催化10批次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后，甲酯轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)84.1%，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[1] 周慧，黃帥，郭召智，等.桐油制備生物柴油的工藝研究[J].應(yīng)用化工，2007，36(7)：633-635.

[2] 汪勇，歐仕益，溫勇，等.酶法催化合成生物柴油的研究進(jìn)展[J].中國油脂，2006，31(1)：65-68.

[3] 劉娟，楊楠楠，姜愛莉.固定化脂肪酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].中國油脂，2013，38(1)：44-47.

[4] 周燕君，陸向紅，俞云良，等.桐油制備生物柴油的研究[J].能源工程，2008(5)：32-36.

[5] 玄偉東，張?zhí)祉?，張汝?桐油制取生物柴油的研究[J].農(nóng)機(jī)化研究，2008(11)：204-206.

[6] 中國科學(xué)院《中國植物志》編委會(huì).中國植物志：第四十四卷(第二分冊)[M].北京：科學(xué)出版社，1996：143.

[7] 王貴軍.離子液體中脂肪酶催化桐油合成生物柴油的研究[D].西安：西北大學(xué)，2009.

[8] 鄭金明，劉慧，蘇玲燕，等.桐油-地溝油生物柴油混合燃料性能改善研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2012，35(2)：30-33.

[9] SHANG Q，JIANG W，LU H F，et al.Properties of tung oil biodiesel and its blends with 0#diesel [J].Bioresour Technol，2010，101(2)：826-828.

[10] SHANG Q，LEI J，JIANG W，et al.Production of tung oil biodiesel and variation of fuel properties during storage [J].Appl Biochem Biotechnol，2012，168(1)：106-115.

[11] 李建武，蕭能庚，余瑞元，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京:北京大學(xué)出版社，2004：311-312.

[12] 吳虹，宗敏華，婁文勇.無溶劑系統(tǒng)中固定化脂肪酶催化廢油脂轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)生物柴油[J].催化學(xué)報(bào)，2004，25(11)：903-908.

Preparation of biodiesel from tung oil catalyzed by immobilized lipase

MAO Yanyong，LI Wenqian，WANG Zhaoyu，SHI Hao

(College of Life Science and Food Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003,Jiangsu，China)

The preparation of biodiesel from tung oil catalyzed by magnetic Fe3O4nano-particles containing immobilized lipase was studied, and the effects of dosage of borate buffer，dosage of enzyme，molar ratio of methanol to oil，reaction temperature and cleaning immobilized lipase or not on transesterification were investigated, and the operational stability of the immbilized lipase was studied. The results showed that under the conditions of volume ratio of hexane to tung oil 2∶1，molar ratio of methanol to oil 1∶1 at 0，5，12 h (total molar ratio of methanol to oil 3∶1)，dosage of borate buffer 6%(based on the volume of tung oil)，dosage of enzyme 7.5 mg/mL (based on the volume of tung oil) ，cleaning immobilized lipase by acetone before adding methanol，reaction temperature 45℃，reaction time 26 h and rotational speed 200 r/min，the conversion rate of methyl ester reached 91.2%.The conversion rate of methyl ester still reached 84.1% after ten batches reactions catalyzed by the immobilized lipase, and it indicated that the immobilized lipase had a certain value of industrial applications.

magnetic Fe3O4nano-particles; immobilized lipase; tung oil; biodiesel; transesterification

2016-05-06；

2016-10-27

淮安市科技支撐計(jì)劃(HAG2011005)；淮安市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(HAG2015031)；淮陰工學(xué)院科研基金(491712034)

茅燕勇(1977)，男，講師，碩士，主要從事酶工程及生物材料方面的研究工作(E-mail)maoyy@hyit.edu.cn。

TQ645;TK63

A

1003-7969(2017)01-0052-04