王 凱，東保住，張 貴，張 鍵，張園園，周洪友，趙 君

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

GFP標(biāo)記的馬鈴薯大麗輪枝菌生物學(xué)特性研究

王 凱，東保住，張 貴，張 鍵，張園園，周洪友，趙 君

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

為了研究馬鈴薯黃萎病菌的侵染機(jī)制，將綠色熒光蛋白基因(GFP)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入馬鈴薯黃萎病菌VD012中，經(jīng)過潮霉素選擇性培養(yǎng)基的篩選和分子鑒定，獲得了47株有綠色熒光信號(hào)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取8株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以野生型菌株為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、菌絲的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、粗毒素含量和致病力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，8株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中有3株微菌核產(chǎn)生的數(shù)量明顯高于野生型，1株轉(zhuǎn)化子微菌核產(chǎn)生量低于野生型菌株；各陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速率和野生型菌株差異不顯著；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量與對(duì)照相比，有2株差異不顯著。其余均有不同程度的降低。保濕培養(yǎng)8 h，所有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的平均萌發(fā)率低于野生型菌株。相比對(duì)照，粗毒素的含量表現(xiàn)為升高趨勢(shì)的轉(zhuǎn)化子有7株，1株表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。致病力測(cè)定的結(jié)果表明，致病力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子有1株，2株轉(zhuǎn)化子的致病力呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

馬鈴薯黃萎??；大麗輪枝菌；GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化子；生物學(xué)特性

馬鈴薯黃萎病是嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的一種土傳維管束病害。自從1916年馬鈴薯黃萎病在美國(guó)明尼蘇達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)后，在美國(guó)愛達(dá)荷州76%的馬鈴薯地塊都發(fā)生了不同程度的黃萎病，導(dǎo)致馬鈴薯大量減產(chǎn)[1]。我國(guó)在1944年由戴倫焰[2]首次報(bào)道馬鈴薯黃萎病在四川發(fā)生；隨后，河北、貴州、新疆地區(qū)的馬鈴薯地塊中也相繼發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯黃萎病。輕者單位面積產(chǎn)量損失20%～30%，重者能達(dá)到50%以上[3]。目前的研究結(jié)果顯示，引起該病的病原菌主要有大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)和黑白輪枝菌(Verticilliumalboatrum)。在發(fā)病初期，微菌核在地下萌發(fā)成菌絲體侵染寄主根部，進(jìn)入寄主維管組織，下部葉片表現(xiàn)變褐干枯癥狀，但不卷曲，不脫落，隨著植物的蒸騰作用向上擴(kuò)展，最終導(dǎo)致全株萎蔫的癥狀[4-5]。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是目前研究最多、技術(shù)方法最成熟的一種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。首次用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的是1995 年Bundock等[6]對(duì)酵母菌實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，到目前為止已經(jīng)有100多種真菌獲得了成功轉(zhuǎn)化的例子。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化已有報(bào)道，如趙鳳軒[5]、Zhao等[7]把GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)入棉花和擬南芥的大麗輪枝菌中，對(duì)病原菌侵染過程進(jìn)行了觀察。國(guó)外已有對(duì)從萵苣[8]、菠菜[9]等分離出的大麗輪枝菌進(jìn)行了熒光標(biāo)記并開展不同侵染階段的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)馬鈴薯黃萎病株分離到的大麗輪枝菌分生孢子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過抗性標(biāo)記的篩選以及PCR鑒定，獲得47株穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的馬鈴薯大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子。以野生型菌株為對(duì)照，選出8株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，研究這些菌株的生物學(xué)特性以及致病力。這一研究結(jié)果將為后續(xù)進(jìn)一步研究大麗輪枝菌侵染馬鈴薯的過程以及確定馬鈴薯種子或者塊莖帶菌傳播奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種：將內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存的馬鈴薯品種云薯301的塊莖播種于滅菌的營(yíng)養(yǎng)土基質(zhì)中，待長(zhǎng)出4～6片葉片時(shí)用于接菌鑒定。

供試菌株和質(zhì)粒：采自內(nèi)蒙古武川縣的馬鈴薯大麗輪枝孢菌株VD012由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植病教研室周洪友教授提供。根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCH-sGFP質(zhì)粒由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張保龍教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒的報(bào)告基因?yàn)槌泵顾乜剐詷?biāo)記和綠色熒光蛋白GFP。質(zhì)粒以凍融法轉(zhuǎn)入LBA4404中備用。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化

大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化步驟參照Dobinson等[10]的方法。

1.3 馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的分子鑒定

用無菌水對(duì)野生型及轉(zhuǎn)化子菌株分生孢子進(jìn)行梯度稀釋，均勻涂布在含有 50 mg/mL 潮霉素的 PDA 平板上，培養(yǎng) 4～5 d后，挑取單菌落獲得純培養(yǎng)。采用CTAB法提取野生型及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株DNA。用gfp引物(GFP-F：GACGTAAACGGCCAC AAGTT，GFP-R：GAACTCCAGCAGGACCATGT)以原始質(zhì)粒和野生型菌株的DNA分別作為正對(duì)照和負(fù)對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳鑒定。PCR采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火58 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌絲體和分生孢子，在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光信號(hào)，并拍照記錄。

1.4 菌落形態(tài)觀察和生長(zhǎng)速度的測(cè)定

將表達(dá)有GFP的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株VD012菌株接種于 PDA 培養(yǎng)基上，在 25 ℃培養(yǎng)14 d后用直徑約為8 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅至新的PDA 培養(yǎng)基中，用十字交叉法測(cè)量培養(yǎng)5，10，20 d的菌落直徑。同時(shí)觀察野生型和轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)，拍照記錄，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)[11]。

1.5 產(chǎn)孢量和萌發(fā)率的測(cè)定

菌株培養(yǎng)15 d后，用20 mL無菌水沖洗，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分生孢子數(shù)目。用瓊膠玻片法測(cè)定孢子萌發(fā)率，將分生孢子液濃度稀釋為 30～40 個(gè)孢子/視野，涂布在水瓊脂玻片上，分別記錄在8，16，24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)100個(gè)分生孢子萌發(fā)情況，每個(gè)菌株重復(fù)3次[12]。

1.6 粗毒素含量和致病力測(cè)定

參照甘莉等[13]方法測(cè)定粗毒素的分泌量。毒素粗濾液采用紫外分光光度法測(cè)定OD280值，以牛血清蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的曲線方程估測(cè)樣品粗毒素的含量(單位是mg/mL)。

表1 黃萎病的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The criteria of potato yellow wilt disease index

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

將在潮霉素培養(yǎng)基上篩選到的47個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，依次命名為Vdgfp1～Vdgfp47(圖1)。2.2 大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子的分子鑒定及GFP熒光觀察

經(jīng)潮霉素篩選后，隨機(jī)選取8株轉(zhuǎn)化子，在無潮霉素抗性選擇壓力下連續(xù)培養(yǎng)5代，轉(zhuǎn)接后都能在含潮霉素抗性的培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)，重新命名為G1～G8，確定是穩(wěn)定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子[16]。gfp引物分子鑒定的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR擴(kuò)增后都獲得與正對(duì)照條帶大小一致的片段，而野生型菌株即負(fù)對(duì)照未見條帶出現(xiàn)(圖2-A)。8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子熒光觀察結(jié)果見圖2-B。菌絲體、分生孢子梗和分生孢子均可以觀察到GFP熒光，表明gfp基因已經(jīng)整合到了大麗輪枝菌的基因組中并能夠正常表達(dá)。

圖1 潮霉素培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子Fig.1 The screening of transformants on the selection medium contained，hygromycin B 50 μg/mL

A.馬鈴薯大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定:M.D2000；+.正對(duì)照PCH-sGFP質(zhì)粒；-.野生型菌株；G1～G8.轉(zhuǎn)化子；B.表達(dá)GFP的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌絲體和分生孢子。A.PCR identification the transformants of Verticillium dahliae:M.D2000；+.Positive control plasmid pCH-sGFP；-.Wild type；G1-G8.Transformants；B.The GFP labeled hyphae and conidia of positive transformant.

2.3 大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度

培養(yǎng)20 d后，所有供試的轉(zhuǎn)化子與野生型一樣不僅能夠產(chǎn)生白色氣生菌絲，而且在培養(yǎng)基中形成微菌核。轉(zhuǎn)化子G6、G7和G8微菌核產(chǎn)生量高于野生型；轉(zhuǎn)化子G2微菌核少于對(duì)照。而轉(zhuǎn)化子G1、G3、G4和G5微菌核形成數(shù)量和野生型大致相同(圖3)。

從培養(yǎng)5，10，20 d的菌落直徑大小可以看出，各轉(zhuǎn)化子的菌落直徑與野生型差異不明顯(圖4)。表明gfp基因的插入對(duì)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)速度影響較小。

圖3 野生型菌株與馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)Fig.3 The colony morphology of wild type and Verticillium dahliae positive transformants

圖4 野生型菌株與馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落直徑的測(cè)定Fig.4 The colony diameter of wild type and Verticillium dahliae positive transformants

2.4 大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率的測(cè)定

結(jié)果如圖5所示，除了G3和G5轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量和野生菌株(3.83×108個(gè)/mL)沒有顯著差異外，其余的6個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量均顯著降低，其中轉(zhuǎn)化子G1和G2的產(chǎn)孢量較低，分別為1.21×108，1.08×108個(gè)/mL。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；在P<0.05水平差異顯著性用不同字母標(biāo)出。圖6-8同。Data in the figure represents the mean±SD；The significant difference at P<0.05 level was indicated with different letters.The same as Fig.6-8.

所有分生孢子在培養(yǎng)8 h后均開始萌發(fā)，萌發(fā)率都低于野生型，但以轉(zhuǎn)化子G7和G8分生孢子萌發(fā)率較低，分別為22%和21%，顯著低于野生型菌株的萌發(fā)率52%。培養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)化子G7的萌發(fā)率為最低68%，顯著低于野生型菌株萌發(fā)率82%；而轉(zhuǎn)化子G1和G2的孢子萌發(fā)率分別為96%和94%，顯著高于野生型菌株。培養(yǎng)24 h后各菌株萌發(fā)率都達(dá)到100%，無顯著差異(圖6)。

圖6 野生型菌株與馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子萌發(fā)率的測(cè)定Fig.6 The comparation of spores germination rate between wild type and Verticillium dahliae positive transformants

2.5 大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子粗毒素含量和致病力的測(cè)定

由圖7所示，轉(zhuǎn)化子G1、G7和G8的粗毒素蛋白濃度顯著高于野生型(0.131 mg/mL)，分別為0.186，0.258，0.255 mg/mL；而轉(zhuǎn)化子G6的粗毒素含量顯著低于野生型菌株，其蛋白濃度僅為0.072

圖7 野生型菌株和馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子粗毒素分泌量的測(cè)定Fig.7 The comparation of crude toxin between wild type and Verticillium dahliae positive transformants

圖8 野生型菌株和馬鈴薯大麗輪枝菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子致病力比較Fig.8 The comparison of the wilting capability between wild type and Verticillium dahliae positive transformants

mg/mL；轉(zhuǎn)化子G2、G3、G4和G5的粗毒素含量略高于野生型菌株，但均未達(dá)到顯著水平。

各菌株的致病力測(cè)定結(jié)果見圖8。其中接種轉(zhuǎn)化子G7孢子液的馬鈴薯植株病情指數(shù)為73.33，高于野生型的病情指數(shù)(53.33)；而轉(zhuǎn)化子G6和G8侵染馬鈴薯后的病情指數(shù)(40.00，33.33)低于野生型菌株。部分馬鈴薯發(fā)病癥狀見圖9。

圖9 大麗輪枝菌接種馬鈴薯后的癥狀Fig.9 The symptom of potato after inoculated with Verticillium dahliae

3 討論

GFP 熒光標(biāo)記可以實(shí)時(shí)觀察病原菌與寄主植物的互作，結(jié)合其他研究手段可以對(duì)病原菌的侵染過程和致病機(jī)理作出全方位的、立體的分析和判斷[17]。以ATMT轉(zhuǎn)化法獲得的8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為本試驗(yàn)研究對(duì)象，對(duì)其菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率、粗毒素產(chǎn)量以及致病力與野生型菌株進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，1個(gè)轉(zhuǎn)化子(G2)的微菌核形成低于野生型菌株，3個(gè)轉(zhuǎn)化子(G6、G7和G8)的生成量高于野生型菌株，各菌株表型沒有差異，原因可能是由于質(zhì)粒DNA整合到與微菌核形成有關(guān)的某個(gè)基因位點(diǎn)中，對(duì)微菌核的形成有影響。這一結(jié)果和Klimes 等[18]的研究類似，即T-DNA的插入使調(diào)控微菌核產(chǎn)量有關(guān)的基因大量表達(dá)，從而影響微菌核的形成。在產(chǎn)孢量方面，轉(zhuǎn)化子G3和G5與野生型沒有顯著差異，其余轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量均顯著低于野生型菌株(3.83×108個(gè)/mL)；而不同轉(zhuǎn)化子分生孢子的萌發(fā)率由于外源基因的插入也受到了不同程度影響，這一結(jié)果也說明外源gfp整合到大麗輪枝菌基因組中，能夠不同程度地影響分生孢子的形成和萌發(fā)。這與徐榮旗等[19]的研究結(jié)果即轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量隨著插入位點(diǎn)的不同而變化結(jié)果相吻合。轉(zhuǎn)化子粗毒素含量測(cè)定的結(jié)果表明，G7和G8轉(zhuǎn)化子的粗毒素含量顯著高于野生型菌株，而G6轉(zhuǎn)化子產(chǎn)毒能力最弱。采用蘸根法對(duì)馬鈴薯幼苗進(jìn)行人工接種，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子G6和G7在接種49 d后馬鈴薯的病情指數(shù)分別低于或者高于對(duì)照，說明外源gfp基因在大麗輪枝菌基因組中整合對(duì)其致病力會(huì)產(chǎn)生影響[20]。

此外，47 個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均能發(fā)出綠色熒光，但其信號(hào)強(qiáng)度不均一，這可能是由外源基因在大麗輪枝菌基因組上的插入拷貝數(shù)不同引起。其GFP熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，而液泡部分信號(hào)較弱，這種現(xiàn)象與Freitag等[21]研究結(jié)果相同。而趙鳳軒[5]的研究結(jié)果即通常幼齡菌絲具有強(qiáng)的熒光信號(hào)，老齡菌絲的信號(hào)強(qiáng)度變?nèi)醯默F(xiàn)象在本試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)。今后還需在菌絲生長(zhǎng)不同階段觀察熒光信號(hào)從而確定GFP熒光信號(hào)的強(qiáng)度是否與菌齡有一定相關(guān)性。本試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，將gfp通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入馬鈴薯大麗輪枝菌中后，與野生型相比較一些陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性和致病力在外源基因整合后沒有發(fā)生顯著變化，獲得了菌落形態(tài)、致病性和野生型大致相同的轉(zhuǎn)化子。因此，未來馬鈴薯黃萎病侵染過程的研究，應(yīng)該首先選用的是生物學(xué)特性和致病力與野生型菌株沒有顯著差異的，表達(dá)有GFP熒光的轉(zhuǎn)化子來觀察大麗輪枝菌侵染馬鈴薯的過程以及馬鈴薯種子和塊莖帶菌的可能性。

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The Study on Biological Characteristics of GFP Labeled Potato Verticillium dahliae

WANG Kai，DONG Baozhu，ZHANG Gui，ZHANG Jian，ZHANG Yuanyuan，ZHOU Hongyou，ZHAO Jun

(Agricultural College，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

In order to unravel the infection mechanism ofV.dahliaeto potato，a binary construct containedGFPgene was transferred viaAgrobacteriumtumefaciens-mediated system intoV.dahliaeisolate VD012.47 positive transformants were obtained by hygromycin B selection and molecular verification.Eight tansformants were randomly selected to characterize the colony morphology，growth rate，conidia production，toxin production and pathogenicity.The results showed that three transformants could produce more microsclerotia compared with the wild type strain；whereas，one transforment produced less microsclerotia.The significant difference on the growth rate of eight transformants. The conidia production ability of the transformants were decreased to certain degree.except two among them were not remarkable overall.The average germination rate of all the tested transformants was lower than that of the wild strain after 8 h germination.Regarding to the toxin production，seven transformants showed increased tendency，while only one decreased compared with the wild type.The pathogencity results showed that，compared with wild strain，only one transformant showed increased tendency，the left two strains showed decreased pattern.

Potato wilt；Verticilliumdahliae；GFP labelled transformants；Biological characteristics

2016-04-28

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(201503109)

王 凱(1989-)，男，遼寧遼陽(yáng)人，在讀碩士，主要從事分子植物病理研究。

趙 君(1969-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事分子植物病理研究。

S435.32

A

1000-7091(2016)06-0088-06

10.7668/hbnxb.2016.06.014