常煜胤，路 明，盧太苓，丁 潔

川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞纖維化的影響

常煜胤，路 明，盧太苓，丁 潔

目的 探討川芎嗪(ligustrazine)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞纖維化的機(jī)制及影響。方法 體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠CFs，實(shí)驗(yàn)分為5組，A組(對照組)：培養(yǎng)時(shí)不加干預(yù)藥物；B組(AngⅡ組)：加AngⅡ10-6mol/L；C組(川芎嗪低劑量組)：AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D組(川芎嗪中劑量組)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 10 mg/L；E組(川芎嗪高劑量組)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 20 mg/L，干預(yù)48 h后，采用RT-PCR法測定α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基Aβ亞型(CnAβ)mRNA的表達(dá)情況；Western Blot法檢測α-SMA及活化T細(xì)胞核因子3(NFAT3)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與A組比較，B組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白的表達(dá)也顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、CnAβ的mRNA表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 在一定濃度范圍，川芎嗪以劑量依賴方式抑制AngⅡ誘導(dǎo)的SD大鼠CFs心肌纖維化過程，其機(jī)制可能與心臟成纖組細(xì)胞纖組化川芎嗪抑制CFs的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)信號通路有關(guān)。

心臟成纖維細(xì)胞纖維化；川芎嗪；血管緊張素Ⅱ；α-平滑肌肌動蛋白；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基Aβ亞型；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路；活化T細(xì)胞核因子3；SD大鼠

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活是誘發(fā)及引起心肌發(fā)生纖維化的主要發(fā)病機(jī)制，其中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是重要的活性成分，能誘發(fā)一系列生理病理過程，最終導(dǎo)致心肌纖維化[1]。川芎嗪(ligustrazine)是中藥川芎的主要成分，是我國臨床廣泛應(yīng)用的中藥，具有鈣離子拮抗、抗血小板聚集、改善微循環(huán)和活血化瘀等作用，臨床已廣泛用于急性心腦損傷、脊髓損傷等治療[2-3]。但其在心肌纖維化過程中的作用研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞(CFs)心肌纖維化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期對臨床中西醫(yī)結(jié)合改善心功能、預(yù)防及治療心肌纖維化等方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠乳鼠購買于徐州醫(yī)學(xué)院動物中心。試劑和藥物：鹽酸川芎嗪(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基含雙抗(南京凱基生物有限公司)；胰酶細(xì)胞消化液(碧云天生物科技研究所)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗大鼠波形蛋白單克隆抗體(武漢博奧森公司)；血管緊張素Ⅱ(美國sigma公司)；總RNA提取試劑(Trizol)(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；Rabbit Anti-NFAT3(北京博奧森公司)，Rabbit Anti-alpha smooth muscle Actin(北京博奧森公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs培養(yǎng)與鑒定

1.2.1.1 CFs的分離、培養(yǎng) 取1 d～3 d鼠齡的SD大鼠乳鼠，在無菌條件下開胸剪取心臟，剪去大血管，去心包膜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗數(shù)次，剪碎。0.125%胰蛋白酶在37 ℃水浴下反復(fù)消化(每5 min收集一次細(xì)胞懸液)，1 200 r/min離心5 min，將所得細(xì)胞置于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90 min。采用差速貼壁法去除心肌細(xì)胞，每48 h后更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，以1∶2傳代，采用第2代～4代細(xì)胞。

1.2.1.2 CFs的鑒定 待細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時(shí)，無菌條件下，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后用PBS反復(fù)沖洗細(xì)胞3次，最后在培養(yǎng)瓶中加入2 mL PBS，用顯微鏡觀察及獲取照片，免疫熒光波形蛋白染色鑒定CFs。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與樣品培養(yǎng)液制備 待第4代細(xì)胞生長之亞融合狀態(tài)后，換用含5%新生牛血清的DMEM無酚紅培養(yǎng)液預(yù)適應(yīng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分為5組，A組(正常對照組)：培養(yǎng)時(shí)不加干預(yù)藥物；B組(Ang組)：加入AngⅡ10-6mol/L；C組(AngⅡ+川芎嗪低劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D組(AngⅡ+川芎嗪中劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪10 mg/L；E組(AngⅡ+川芎嗪高劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪20 mg/L。分別放入培養(yǎng)箱孵育48 h后觀察各個指標(biāo)變化情況，觀察各組在實(shí)驗(yàn)特定時(shí)間相應(yīng)指標(biāo)的變化情況。

1.2.3 α-平清肌肌動蛋白(α-SMA)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基Aβ亞型(CnAβ)mRNA表達(dá)的檢測 RT-PCR試劑盒購買于天根生化科技有限公司。各分組細(xì)胞培育48 h后，收集細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物各2 μL，分別加入各自上下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)溫度設(shè)置為94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，如此循環(huán)35次，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫，以GAPDH作為內(nèi)參，內(nèi)參上游引物為：5’-AGG CCG GTG CTG AGT ATG TC-3’，下游引物為5’-TGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3’，產(chǎn)物大小為530 bp；α-SMA上游引物為5’-GGG AGT AAT GGT TGG AAT-3’，下游引物為5’-TCA AAC ATA ATC TGG GTC A-3’，產(chǎn)物大小為252 bp，CnAβ上游引物5’-ACG GCA GAC CCT ACA AAG-3’，下游引物為5’-CCC TCA AAG CCT CCA TCC-3’，產(chǎn)物大小為391 bp。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，紫外燈下拍照。

1.2.4 α-SMA及T細(xì)胞核因子(NFAT3)蛋白表達(dá)的檢測 Western Blot各種試劑盒購于碧云天生物科技研究所。各分組細(xì)胞培育48 h后，收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，后將細(xì)胞碎片和裂解液移到1.5 mL離心管中，4 ℃，12 000 r/min，離心25 min，取上清，酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，配平濃度后，加上樣緩沖液，煮沸5 min，裝入EP管中-80 ℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：經(jīng)電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉液封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜。復(fù)溫后，洗膜每次10 min，共3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜每次10 min，共3次，用堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 CFs鑒定 倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形或多角形，胞體及細(xì)胞核較大，呈橢圓形，細(xì)胞之間排列緊密，但不易聚集成團(tuán)，無自發(fā)搏動，形態(tài)特征，詳見圖1?？共ㄐ缘鞍讍慰寺】贵w免疫熒光染色為陽性，其中紅色為波形蛋白，藍(lán)色為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，詳見圖2。

圖1 分離培養(yǎng)的CFs光鏡細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2 CFs波形蛋白免疫熒光染色(×400)

2.2 各組α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表達(dá)比較 以GAPDH為內(nèi)參對照，結(jié)果以α-SMA/GAPDH、CnAβ/GAPDH條帶灰度值比值表示。RT-PCR結(jié)果顯示，與A組比較，B組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、CnAβ的mRNA的表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖3。

表1 各組α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表達(dá)比較

圖3 α-SMA及CnAβ mRNA的表達(dá)

2.3 各組α-SMA及NFAT3蛋白表達(dá)比較 以GAPDH為內(nèi)參對照，結(jié)果以α-SMA/GAPDH、NFAT3/GAPDH條帶灰度值的比值表示。Western Blot結(jié)果顯示，A組比較，B組α-SMA、NFAT3蛋白表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMA、NFAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、NFAT3蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖4。

表2 各組α-SMA 及NFAT3蛋白表達(dá)量比較

圖4 各組α-SMA 及NFAT3蛋白表達(dá)量的變化

3 討 論

心肌纖維化是心功能衰竭、心律失常的重要病理基礎(chǔ)。CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其可支持心肌細(xì)胞作用，還有自分泌及旁分泌功能，能分泌多種生物活性物質(zhì)影響心臟的結(jié)構(gòu)及功能[5-6]。在細(xì)胞水平上，已經(jīng)證明CFs向心臟肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是啟動心肌纖維化的核心[7]，其標(biāo)志是α-SMA表達(dá)明顯增加，同時(shí)通過自分泌、旁分泌活性因子促進(jìn)基質(zhì)合成，促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)程[8-10]。因此α-SMA可作為心肌纖維化進(jìn)程中可靠的標(biāo)志性抗原。典型的CFs形態(tài)呈梭形或多角形，胞體及細(xì)胞核較大，呈橢圓形，胞質(zhì)透明，細(xì)胞之間排列緊密，但不易聚集成團(tuán)，無自發(fā)搏動，本實(shí)驗(yàn)通過酶消化差速貼壁法獲得CFs形態(tài)典型，通過免疫熒光染色鑒定，純度較高，均質(zhì)性好，適合用于實(shí)驗(yàn)。

已知多種細(xì)胞因子能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的纖維化，表達(dá)其特異性的標(biāo)記物α-SMA，從而促進(jìn)心肌纖維化，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-13等。在眾多致心肌纖維化的因素中，RAAS過度激活在心肌纖維化中發(fā)揮的重要作用已得到公認(rèn)，AngⅡ是其主要的效應(yīng)分子[11]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是體內(nèi)唯一的 Ca2+/鈣調(diào)素依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，介導(dǎo)Ca2+依賴的細(xì)胞增殖、肥大、凋亡、分泌等多種功能的信號通路。近年來發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路是調(diào)控心室肥大的重要通路[12-13]。NFAT是CaN重要的下游靶點(diǎn)，活化的NFAT3在心肌纖維化中起著重要的作用，同時(shí)其還可與其他因子結(jié)合參與調(diào)節(jié)心房利鈉因子(AVF)和心肌肌球蛋白重鏈(MHC)等基因的表達(dá)，從而影響心肌功能[14]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AngⅡ在體外作用于心臟CFs，避免其他生物活性物質(zhì)和血流動力學(xué)的影響，在干預(yù)CFs 48 h后，發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)明顯增加，提示AngⅡ可直接作用于CFs，促進(jìn)其纖維化的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)AngⅡ參與心肌纖維化發(fā)病過程，與以前文獻(xiàn)研究相一致。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，用AngⅡ干預(yù)CFs 48 h后，在α-SMA表達(dá)明顯升高的同時(shí)，CnAβ mRNA及下游活化信號分子NFAT3蛋白的表達(dá)均明顯增加，提示AngⅡ促CFs表型轉(zhuǎn)化作用可能與CaN信號通路有關(guān)。

川芎嗪是活血化瘀中藥川芎的主要成分，具有抑制炎癥細(xì)胞激活、減少促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)物、抗氧化、抗凋亡等作用，臨床已廣泛用于急性心腦損傷、脊髓損傷等治療[15-17]。在心血管疾病治療中，川芎嗪被證實(shí)具有抗缺血-再灌注損傷及抗氧化等保護(hù)作用[18-19]。川芎嗪對心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化作用的研究相對較少，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度川芎嗪+特定濃度AngⅡ刺激CFs，與單純用相同濃度AngⅡ刺激組比較發(fā)現(xiàn)，在特定濃度范圍內(nèi)川芎嗪可按劑量依賴方式抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs α-SMA的表達(dá)，提示其可直接作用于CFs，具有抑制CFs的心肌纖維化作用。本實(shí)驗(yàn)還觀察到加用川芎嗪后，在抑制CFs纖維化進(jìn)程的同時(shí)，對UⅡ誘導(dǎo)的CFs CnAβ mRNA及下游活化信號分子NFAT3蛋白的表達(dá)也受到抑制，這提示川芎嗪抑制CFs纖維化進(jìn)程的機(jī)制可能與其阻滯CaN信號通路有關(guān)。這為川芎嗪在臨床預(yù)防治療心肌纖維化的進(jìn)展，改善心功能等方面提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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(本文編輯薛妮)

The Influence of Ligustrazine on Cardiac Fibroblasts Fibrosis Induced by Angiotensin Ⅱin Rats

Chang Yuyin,Lu Ming,Lu Tailing,Ding Jie

The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of ligustrazine on angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiac fibroblasts(CFs) fibrosis and its mechanisms.Methods The CFs of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats were isolated with the method of trypsin digestion and differential anchoring velocity,then cultured in vitro.The generation 2-4 of CFs were used for the experiment and randomly divided into 5 groups which were control group cultured without AngⅡ or ligustrazine(group A) ,AngⅡ group cultured with AngⅡ 10-6mol/L(group B),and ligustrazine groups(group C,group D,group E) cultured with AngⅡ 10-6mol/L and ligustrazine 5,10,20 mg/L,respectively.CFs were cultured for 48 h and the smooth muscle alpha-actin (α-SMA),beta isoform of calcineurin (CnAβ) mRNA expression were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),the α-SMA,nuclear factor of activated T-lymphocyte-3 (NFAT3) protein expression by western blot analyses.Results Compared with group A,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein were upregulated in group B(allP<0.05).Compared with group B,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein in group D and group E were obviously decreased(allP<0.05).Conclusion Within a given concentration range,ligustrazine can inhibit the expression of α-SMA in a dose-dependent manner to delay the differentiation of CFs induced by AngⅡ.Ligustrazine can inhibit the expression of CaN and downstream signaling molecules NFAT3,which indicates that the inhibition of CFs fibrosis process may be related to the CaN signaling pathway.

ligustrazine； angiotensinⅡ；smooth muscle alpha-actin；beta isoform of calcineurin；CaN signaling pathway；nuclear factor of activated T-lymphocyte-3；cardiac fibroblasts； Sprague-Dawley rats

徐州醫(yī)學(xué)院(江蘇徐州 221000)，E-mail：787013497@qq.com

引用信息：常煜胤，路明，盧太苓，等.川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞纖維化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(23)：2758-2761.

R322.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.012

1672-1349(2016)23-2758-04

2016-04-28)