王玉娣，章建國，劉益飛

(1.高郵市婦幼保健院，江蘇 揚州 225600；2.南通大學附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

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shSASH1基因對卵巢癌細胞SKOV3生物學功能的影響

王玉娣1，章建國2，劉益飛2

(1.高郵市婦幼保健院，江蘇 揚州 225600；2.南通大學附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

目的 探討SASH1對卵巢癌細胞SKOV3的增殖、凋亡與侵襲方面的影響。方法 標本組織來源于婦產(chǎn)科手術收集的50例卵巢癌組織。通過建立重組質粒pcDNA3.1-SASH1，并借助于脂質體2000轉染到SKOV3，采用流式細胞計(FCM)分析實驗和細胞侵襲實驗，來探索SASH1對卵巢癌細胞SKOV3在細胞擴散、凋亡和侵襲中的影響。結果 pcDNA3.1-SASH1轉染組中的S期細胞分值(%)低于正常(未轉染的)對照組(χ2=26.78，P<0.01)或空載組(pcDNA3.1)(χ2=25.12，P<0.01)。與空載組和正常(未轉染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉染組中的SKOV3明顯降低了癌細胞的生長、增殖和侵襲的能力(χ2=31.25，P<0.01)，然而在空載組和正常(未轉染的)對照組中沒有明顯的差異；pcDNA3.1-SASH1細胞組顯示更多的凋亡細胞(χ2=36.58，P<0.01)。結論 SASH1可抑制卵巢癌細胞SKOV3的生長、增殖和侵襲能力，并促進其凋亡。

SASH1基因；卵巢癌細胞SKOV3；增殖；凋亡；侵襲

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤之一，是婦科腫瘤死亡的主要原因[1-2]。卵巢癌通過多基因發(fā)展變化，目前還未明確這些信號道路是如何發(fā)揮作用的。新的致癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)仍是了解此病發(fā)病機制的重要途徑[3-4]。SASH1(SAM- and SH3-domain containing 1, SASH1)基因，是一種新的候選抑癌基因，是SLY(SH3-domain containing expressed in lymphocytes, SLY)基因家族中的一種信號銜接蛋白[5]，在人體多種正常組織中廣泛表達。隨著對SASH1基因的研究，發(fā)現(xiàn)SASH1基因在多種腫瘤組織中表達下降，如結腸癌、黑色素瘤、肺癌、骨肉瘤、食管鱗癌等；并對腫瘤的侵襲性生長、轉移灶的形成及預后產(chǎn)生影響[6]。但至今國內(nèi)外仍未見SASH1基因與卵巢癌細胞之間關系的研究報道。本研究主要探討SASH1基因對卵巢癌細胞SKOV3生物學功能方面的影響，在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，是否能成為卵巢癌獨立預后的指標之一。

1資料與方法

1.1研究對象

新鮮卵巢癌組織切除樣本來自2011年1月至2013年12月南通大學附屬醫(yī)院50名卵巢癌患者。樣本取出后立即放入液氮中，然后置于-80℃冰箱中保存，按照倫理和法律標準，所有患者匿名。所有卵巢癌患者術前均未做任何治療，均無其他相關炎癥性疾病。手術切除的50例卵巢癌組織均被病理診斷核實，并且有完整的臨床資料。

1.2方法

1.2.1質粒構建

基因SASH1開放側面引物和限制性內(nèi)切酶的設計采用Primer Premier 5軟件實施。正向引物：5′-CG GGATCC ATG GAG GAC GCG GGA GCA GC-3′，包含BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點；反向引物：5′-CC CTCGAG CAT GGC CTC AGG GCC TGG CG-3′，包含XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點。cDNA第1條鏈由來自SKOV3細胞的mRNA的模板合成，PCR用基因SASH1的引物來引導。PCR產(chǎn)品被克隆成pGEM-T空載。經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶裂解和識別后，校正的重組質粒被序列化?？蛰dpcDNA3.1和重組質粒pGEM-SASH1 同時被限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I裂解，目標片段被分別收集，并通過T4 DNA連接酶連接，重組質粒pGEM-SASH1被轉換為DH5α感應細胞。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染

將卵巢癌SKOV3細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24h后，收集在對數(shù)生長期的細胞，以便實驗。建立正常(未轉染的)對照組。在常溫下，SKOV3細胞接種于6孔培養(yǎng)皿中，采用Lipofectamine 2000轉染，轉染為空帶菌者(pcDNA3.1)和重組表達質粒pcDNA3.1-SASH1。質粒被無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻；將脂質體 Lipofectamine 2000添加到RPMI-1640培養(yǎng)基中，輕度混合后，在常溫下培養(yǎng)5min后，與稀釋的質?；旌?；在常溫下培養(yǎng)20min，形成混合物，加到含有SKOV3細胞的培養(yǎng)皿中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h后，再換到含有5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。在SKOV3細胞轉染質粒pcDNA3.1-SASH1 48h后，采用Western blot分析測定SASH1表達。

1.2.3流式細胞術測定細胞周期

在常溫下，培養(yǎng)的SKOV3細胞均勻接種在6孔培養(yǎng)皿中，濃度為3×105細胞/mL。轉染后48h，收集的細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化后，在PBS中洗2次，加入預冷的70%乙醇，在-20℃下固定24h。次日，用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和PBS 洗后，再按0.1mg/mL加入RNase溶液，在37℃下靜置30min，之后加入PI溶液染色30min。細胞被保存在避光的冰上，并立即對之進行流式細胞術(FCM)分析。采用Macquit 和 FCM Cell Quest軟件來分析。試驗重復3次。

1.2.4生長曲線分析

在細胞分別轉染了24h、48h、72h和96h后，用Hoechst33342 (Beyotime公司)對SKOV3細胞株進行染色。用DME熒光顯微鏡觀察染色后的細胞形態(tài)和數(shù)量，并借助Image Pro Plus 6.0版軟件來統(tǒng)計細胞總數(shù)。從3個孔板中隨機選取10個視野統(tǒng)計細胞數(shù)量。此試驗被重復3次。

1.2.5 FCM測定細胞凋亡

在常溫下，收集培養(yǎng)的SKOV3細胞，均勻接種在6孔培養(yǎng)皿中。轉染后48h，細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化，在PBS中洗兩次，懸浮放入195μL Annexin V-FITC(Roche公司) 結合緩沖液中。加入5μL的Annexin V-FITC并輕輕地混合，SKOV3 細胞在室溫下避光染色10min，然后，將SKOV3細胞以1 000g離心5min，并輕柔地懸浮在190μL Annexin V-FITC結合緩沖液中。最后，加入10μL PI著色液，輕輕地混合，細胞被保存在避光的冰上，并立即采用Macquit 和 FCM Cell Quest軟件來分析。此試驗被重復3次。

1.2.6 Transwell侵襲實驗

將20μL基質膠均勻地覆蓋在聚碳酸脂膜(8.0μm)的表面，從而形成基質膠膜。轉染后，每一組SKOV3細胞覆蓋在無血清培養(yǎng)基的transwell小室的聚碳酸酯膜的上邊。在室溫下5%CO2培養(yǎng)48h后，觀察細胞的情況，用PBS緩沖液清洗細胞1～2次，并用Hoechst 33342染色。穿過濾過膜的癌細胞即侵襲細胞，這些細胞被隨機分為8個視野，放在Leica顯微鏡下觀察并計算數(shù)量，每一組重復試驗3次，結果取平均值。

1.3統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析采用Stata 7.0軟件，χ2檢驗，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 SASH1對卵巢癌細胞SKOV3 細胞增殖的影響

用FCM來檢測SASH1在SKOV3細胞周期中的情況。結果顯示，pcDNA3.1-SASH1轉染組中的S期細胞分值(%)低于正常(未轉染的)對照組(χ2=26.78，P<0.01)或空載組(pcDNA3.1)(χ2=25.12，P<0.01)。其S期分數(shù)在正常(未轉染的)對照組和空載組沒有明顯的區(qū)別，見圖1。通過細胞生長曲線觀察轉染了pcDNA3.1-SASH1的SKOV3的生長情況，與空載組或對照組相比，轉染了pcDNA3.1-SASH1的SKOV3細胞株的數(shù)量在轉染后的48h、72h、96h都是降低的。見圖2。提示SASH1可能會抑制卵巢癌細胞SKOV3的增殖。

注：曲線顯示pcDNA3.1-SASH1轉染組、空載組和正常(未轉染的)對照組不同時間長度的SKOV3的生長變化，在Hoechst 33342著色后通過顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)評估。pcDNA3.1-SASH1轉染組的SKOV3細胞數(shù)明顯減少(**P<0.05)

圖1 FCM分析SASH1對卵巢癌細胞SKOV3擴散的影響，并與空載組和正常(未轉染的)對照組比較

Fig.1 Effect of SASH1 on proliferation of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by FCM and comparison with empty vector group and normal(non-transfected) control group

圖2 細胞生長曲線分析SASH1 對卵巢癌細胞SKOV3生長的影響

Fig.2 Effect of SASH1 on the growth of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by cell growth curve

2.2 SASH1對卵巢癌細胞SKOV3凋亡的影響

經(jīng)Annexin V和PI雙染后，用FCM來分析SASH1在SKOV3中的凋亡情況。FCM結果顯示，pcDNA3.1-SASH1轉染組的凋亡百分比明顯高于正常(未轉染的)對照組和空載組(χ2=36.58，P<0.01)。然而，細胞凋亡數(shù)在正常(未轉染的)對照組和空載組之間沒有明顯的區(qū)別，提示SASH1可能促進卵巢癌細胞SKOV3凋亡，見圖3。

注：與空載組和正常(未轉染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉染組細胞SKOV3凋亡明顯增多(**P<0.01)。

圖3 FCM分析SASH1在卵巢癌細胞SKOV3凋亡中的影響

Fig.3 Effect of SASH1 on the apoptosis of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by FCM

2.3 SASH1對卵巢癌細胞SKOV3侵襲的影響

通過transwell試驗來評估SKOV3的侵襲能力。與正常(未轉染的)對照組和空載組相比，pcDNA3.1-SASH1轉染組的細胞株穿過濾過膜的數(shù)量明顯降低(χ2=31.25，P<0.01)。提示SASH1的過度表達與SKOV3的侵襲能力有關，見圖4。

注：穿過聚碳酸酯膜的細胞量在Hoechst 33342著色后通過顯微鏡下計數(shù)及評估，結果顯示，與空載pcDNA3.1和正常(未轉染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉染組細胞數(shù)明顯減少(**P<0.01)。

圖4 transwell實驗分析SASH1對卵巢癌細胞SKOV3侵襲的影響

Fig.4 Effect of SASH1 on invasion of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by transwell experiment

3討論

SASH1基因通過多種途徑對細胞增殖、分化、凋亡及免疫應答實行調(diào)控，并參與腫瘤侵襲性生長、轉移灶的形成，從而參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。SASH1由22個外顯子和21個內(nèi)含子構成， 其表達產(chǎn)物包含兩個重要的結構域：SH3和SAM域[7]。兩個結構域都能調(diào)節(jié)介導蛋白對蛋白的相互作用，SH3域通過識別富含脯氨酸和疏水殘基的序列來介導蛋白之間的相互作用，而SAM域以一種更復雜的方式發(fā)揮作用-它們通過其他蛋白上SAM域中的同源和異源性寡聚化反應來介導蛋白之間的相互作用，也通過介導Smaug蛋白質和mRNAs捆綁來調(diào)整轉錄[8]。蛋白基因結構的分析揭示，SASH1是一個最近被描述為SH3/SAM適配分子家族的一員，并因此提示其參與相關信號轉導途徑[9]。在過去幾年里，SASH1一直被證實作為一個候選的腫瘤抑制基因，它廣泛表達于人體的乳腺、肺、甲狀腺、胸腺等正常組織和上皮細胞系中(淋巴細胞除外)，SASH1的減少或缺失與腫瘤的生長、浸潤、轉移及不良的預后密切相關。Zeller等[7]于2003年首先報道65例乳腺癌中，有70%的乳腺癌樣本中，出現(xiàn)SASH1mRNA的表達水平明顯降低；另30%乳腺癌樣本出現(xiàn)SASH1基因缺失。而且，在甲狀腺原發(fā)性癌中的表達也明顯降低。此外，SASH1表達的下調(diào)與不同時期的遠處轉移有關。SASH1表達的下調(diào)可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和演化過程中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是通過研究SASH1對卵巢癌細胞株SKOV3影響，從而探討其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

為了分析SASH1對卵巢癌細胞SKOV3在細胞生物學特征方面的影響，本研究構建了SASH1的重組表達空載體和pcDNA3.1-SASH1轉染組。SASH1在轉染上pcDNA3.1-SASH1的SKOV3中呈過度表達，但在空載組和正常(未轉染的)對照組，其表達水平較低。因此，成功建立了SASH1的過度表達細胞模型。通過使用細胞生長曲線或FCM分析SASH1對 SKOV3生長和增殖中的影響。FCM分析顯示，pcDNA3.1-SASH1轉染組中的S期分數(shù)(%)低于正常(未轉染的)對照組(P<0.01)或空載組(P<0.01)。與正常(未轉染的)對照組或空載組相比，SKOV3細胞數(shù)被轉染上pcDNA3.1-SASH1后48h、72h及96h均表現(xiàn)為減少。這些研究的結果提示，SASH1可能抑制卵巢癌細胞SKOV3的生長和增殖。然而，準確的作用機制仍需進一步探索。運用FCM檢測SASH1 對 SKOV3細胞凋亡的作用的過程中采用了Annexin V和PI雙染，結果，pcDNA3.1-SASH1轉染組中的凋亡細胞的百分比明顯高于正常(未轉染的)對照組和空載組(P<0.01)。實驗結果提示，SASH1作為腫瘤抑制基因，除了可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，還可以促進細胞的凋亡。

在本研究中，通過Transwell試驗即細胞侵襲實驗來研究SASH1對SKOV3的侵襲能力的影響。與正常(未轉染的)對照組和空載組相比，穿過聚碳酸酯膜pcDNA3.1-SASH1轉染組中的細胞量明顯減少(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)提示SASH1的過表達與SKOV3侵襲能力被抑制有關。原因是SASH1調(diào)節(jié)細胞骨架，并促進細胞基質的黏附作用，而黏附功能的下降是惡性腫瘤細胞發(fā)生轉移的關鍵[6]。Martini等[10]也證明了SASH1可以通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架之間的相互作用，促進細胞機制黏附，抑制癌細胞的增殖；SASH1的表達導致細胞黏附于纖維連接蛋白和層黏連蛋白增多，因而抑制了癌細胞轉移。提示SASH1可能涉及卵巢癌的浸潤和轉移，SASH1在抑制轉移過程中可能也起重要的作用。研究結果表明，SASH1參與腫瘤侵襲和轉移相關的分子途徑。

綜上所述，SASH1抑制卵巢癌細胞SKOV3的生長、增殖和侵襲能力，并促進其凋亡，提示SASH1可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中起重要作用。SASH1蛋白在卵巢癌中如何導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移的具體機制還有待今后進一步的研究，從而為卵巢癌的治療提供更新的方法。

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[專業(yè)責任編輯：張冠軍]

Effect of shSASH1 gene on biological function of ovarian cancer cell SKOV3

WANG Yu-di1, ZHANG Jian-guo2, LIU Yi-fei2

(1.Maternal and Child Health Care Hospital of Gaoyou, Jiangsu Yangzhou 225600; China;2.AffiliatedHospitalofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China)

Objective To investigate the effect of SAM- and SH3-domain containing 1 (SASH1) on cell proliferation, apoptosis and invasion of ovarian cancer cell SKOV3. Methods Sample tissues were collected from tissues of 50 cases of human ovarian cancer in gynecologic surgery. A recombinant plasmid pcDNA3.1-SASH1 was established and transfected into SKOV3 cells with help of Lipofectamine 2000. Effect of SASH1 on cell proliferation, apoptosis and invasion of ovarian cancer cell SKOV3 were explored through flow cytometry (FCM) analysis and cell invasion test. Results Cell proportion (%) at S stage in pcDNA3.1-SASH1 transfected group was lower than normal (non-transfected) control group (χ2=26.78,P<0.01) or empty vector group (pcDNA3.1) (χ2=25.12,P<0.01). Ability of growth, proliferation and invasion of cancer cells SKOV3 reduced significantly in pcDNA3.1-SASH1 transfected group compared to empty vector group and normal (non-transfected) control group (χ2=31.25，P<0.01), but there was no significant difference between the empty vector group and normal (non-transfected) control group. Significantly more apoptotic cells were found in pcDNA3.1- SASH1 group than in empty vector group and normal control group (χ2=36.58,P<0.01). Conclusion SASH1 can inhibit growth, proliferation and invasion of ovarian cancer cell SKOV3, and promote its apoptosis.

SASH1; ovarian cancer cell SKOV3; proliferation; apoptosis; invasion

2016-05-27

王玉娣(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事卵巢腫瘤臨床診療工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.015

R737.31

A

1673-5293(2016)12-1475-04