張鳳春，費英敏

(1.鐵力市四寶生物科技有限公司，黑龍江鐵力152500；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150066)

林蛙皮抗菌肽研究進(jìn)展

張鳳春1，費英敏2

(1.鐵力市四寶生物科技有限公司，黑龍江鐵力152500；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150066)

近年來外源性病原體的侵襲日益加重，急切需要從多種生物體中搜尋新的具有抗菌活性的藥物，目前研究發(fā)現(xiàn)兩棲類的生態(tài)類型多種多樣且復(fù)雜多變，能夠分泌出大量具有特殊結(jié)構(gòu)、功能特殊的抗菌肽類物質(zhì)，這種物質(zhì)耐熱性好、廣譜抗菌活性強(qiáng)，能夠為篩選抗菌藥物提供重要研究信息。通過林蛙皮膚分泌物中的抗菌肽生物活性、抑菌機(jī)制、應(yīng)用現(xiàn)狀和研究價值等進(jìn)行綜述，為抗菌肽的深入研究提供重要的理論依據(jù)。

林蛙皮膚；抗菌肽；應(yīng)用價值

抗菌肽(antibacterial peptides)又被稱為抗微生物肽、抗肽生素，其由10～50個氨基酸殘基部分組成，是帶有正電荷和廣譜抗菌活性的小肽。動物中的兩棲類具有皮膚光潤、濕滑的特點，這為大量微生物提供了舒適的生存環(huán)境[1]。但是歷經(jīng)生物的歷史進(jìn)化它們的皮膚形成了能夠抵抗微生物入侵的保護(hù)機(jī)制，尤其是腹部、背部分泌的一些物質(zhì)足以避免有害分子的入侵。蛙類相對于其他生物來說是皮膚含有數(shù)量最多的，而且含有種類更多的抗菌肽，其生態(tài)地位也是最高的，有驚人的種類和數(shù)量。

兩棲類代表物種林蛙廣譜性特點強(qiáng)，能夠有效抑制真菌、革蘭氏陰性菌、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)菌；還具有選擇性毒性和在很低濃度就能夠抑制微生物生長的高效性，同時還具備很強(qiáng)的活性，并且具有快速殺滅微生物能力[2]。目前，國內(nèi)有很多公司正在研發(fā)長白山林蛙的藥用價值，并獲得了提取抗菌肽的國家專利，該項專利在國際可替代抗菌素的純生物抗菌肽上添上了新的一筆。

蛙類皮膚抗菌肽目前已有很多報道。已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究熱點之一。本文結(jié)合最新研究進(jìn)展講述林蛙和抗菌肽結(jié)合對于對抗病毒生物活性，阻斷病毒感染起到積極指導(dǎo)作用。

1 林蛙簡介

林蛙(RanadybowskiiGuenther)，俗稱田雞、哈什蟆，屬于兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬(Rana)[3]。我國境內(nèi)珍稀兩棲類動物居多，這種珍稀動物能夠藥用、食補(bǔ)還具有良好的生態(tài)價值[4]。人們在研究中發(fā)現(xiàn)林蛙皮膚中含有特殊的分子結(jié)構(gòu)和生理功能的活性物質(zhì)較多，且破損后不易感染、自愈修復(fù)速度快等優(yōu)點[5]。馬濤等對分子生物學(xué)深入研究發(fā)現(xiàn)林蛙皮膚分泌液中含有的抗菌肽具有廣譜高效的抗菌活性，同時還具有抗真菌的防御功能。中國林蛙是珍貴的藥用、食用性動物，還能產(chǎn)生副產(chǎn)品林蛙油，對其深入的研究開發(fā)能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益且具備廣闊的發(fā)展前景。時至今日，國際上大量研究了兩棲類動物皮膚分泌物，但國內(nèi)對其研究還處于初級階段。Mohamed等[6]在2000年將一種抗菌肽從蛙類皮膚中成功的提取了出來，且重新更名“Dermatoxin”，能夠抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌。Kim2001年在林蛙中提取的Brevinin-2Gub，具有促胰島素釋放作用[7]。而國內(nèi)較早的研究是在醫(yī)藥方面，2002年田曉樂等[8]對制備林蛙抗菌肽噴霧劑及凝膠劑的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2 抗菌肽簡介

2.1 抗菌肽分類

按結(jié)構(gòu)抗菌肽可分為四類：α-螺旋型抗菌肽，是質(zhì)膜相互作用插入細(xì)胞膜形成孔洞改變細(xì)胞膜通透性的作用機(jī)制，代表類型為爪蟾抗菌肽[9]；β-折疊型抗菌肽是不形成孔洞前提下使多肽分子穿過磷脂雙分子層來破壞磷脂分子有序排列的機(jī)制[10-11]；還有一種可以抑制DNA合成的無規(guī)則型的抗菌肽[12]；對細(xì)菌和真菌具有殺傷作用機(jī)理的最強(qiáng)小分子的LOOP型抗菌肽。

2.2 抗菌肽的抑菌機(jī)理

2.2.1 膜裂解機(jī)理。主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)的膜裂解作用在細(xì)菌細(xì)胞膜上，破壞了脂層的完整性而且造成穿孔，增大了膜的通透性造成細(xì)菌細(xì)胞膜的破裂并最終溶解了細(xì)胞壁，使內(nèi)容物滲出達(dá)到細(xì)胞死亡的目的[13]。蛙類抗菌肽的氨基酸殘基數(shù)在21～27個，具有堿性酸性的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)，也容易與酸性細(xì)胞膜結(jié)合，這樣的特點形成了跨膜離子通道并加強(qiáng)了導(dǎo)膜抗菌的裂解。

這種抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素抗菌體質(zhì)不同，它是以物理方式在生物細(xì)菌細(xì)胞膜上作用的，對臨床耐藥性有很大的影響。此外，抗菌肽不會殺死正常的真核生物細(xì)胞，也不會損傷正常哺乳動物的細(xì)胞，但能有效的抑制殺滅細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、原核細(xì)胞、病變的真核細(xì)胞等[14]。具有獨特作用機(jī)制特點的抗菌肽具有抗菌譜不易產(chǎn)生耐藥性和抗藥性，促使醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒖咕淖鳛闊狳c積極開展研究。

2.2.2 膜不裂解機(jī)理。這種抗菌肽沒有α-螺旋肽結(jié)構(gòu)，但是能抑制細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)的合成，作用在DNA、RNA，并且不破壞細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)，還能夠穿過細(xì)胞膜和核膜來攻擊線粒體。還有一種機(jī)制是以細(xì)菌包內(nèi)酶為靶向目標(biāo)的，這種抗菌肽使細(xì)胞信號過程被影響從而達(dá)到抑菌目的效果，在電子顯微鏡觀察下發(fā)現(xiàn)，非洲爪蟾中的抗菌多肽Magainin2可以使細(xì)胞內(nèi)外抗微生物菌作用增強(qiáng)[15]。

2.3 抗菌肽的生物活性

抗菌肽的抗菌譜能夠抑制40多個革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，還能殺傷和滅活很多真菌并具備抗病毒的作用，劉紅玉等發(fā)現(xiàn)大蹼鈴蟾中含有的抗菌多肽Maximin3能夠抑制艾滋病病毒活性[16-17]。這對于抗艾滋病來說是飛躍性的發(fā)現(xiàn)[18]。同時經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，非洲爪蟾的抗菌多肽在微摩爾濃度下還具有抗腫瘤作用，可以殺死腫瘤細(xì)胞且這種機(jī)制比殺傷細(xì)菌要復(fù)雜很多[19-20]。但抗菌肽中的部分抗菌肽還具有較高的溶血活性，即引起動物血細(xì)胞的溶解，這將限制其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，這種抗菌肽溶血性高、疏水性高、兩親性高，有高度螺旋性結(jié)構(gòu)，會對哺乳動物的細(xì)胞膜產(chǎn)生很強(qiáng)的毒性。

2.4 抗菌肽的應(yīng)用價值

2.4.1 臨床醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用。國內(nèi)研究通過兩棲類動物例如中華蟾蜍皮膚上的研究，廣泛的應(yīng)用在中藥和民族區(qū)域藥上。例如美國費城制藥公司在1990年對10種以上抗菌肽研究，通過青蛙皮膚的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計，試驗出了抗腫瘤的新藥的多肽分子，并完成了III期應(yīng)用在口腔潰瘍、腳趾潰爛等的臨床試驗上[22]。蛙類的抗菌肽廣譜抗菌活性大，5min內(nèi)就能快速殺菌，還能夠避免細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生毒素形成的膿毒癥，不會造成致畸作用且愈合傷口快速的特點。

2.4.2 食品保鮮防腐研究應(yīng)用。市面上防腐劑有苯甲酸鈉、亞硝酸鈉等都是具有毒性的保鮮劑，Zasloff M等研究發(fā)現(xiàn)，東北林蛙中的抗菌肽FSE31.5可作為食品保鮮的防腐劑，并且安全無毒天然可食用，在水果蔬菜和肉制品保鮮方面有很好的效果[24]。

2.4.3 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的研究應(yīng)用。我國是農(nóng)業(yè)大國，抗菌肽轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)獲得很大成功，例如應(yīng)用在馬鈴薯和西紅柿2種作物上已經(jīng)取得了巨大的經(jīng)濟(jì)收益。王雅麗研究將非洲爪蟾抗菌肽基因移植到煙草中，可以提高煙草對抗感染力[25]。

3 抗菌肽研究進(jìn)展

國內(nèi)學(xué)者對于林蛙的研究方向主要集中在林蛙油的研究，包括林蛙油的組份及功能性質(zhì)等方面，進(jìn)行了初步分離和純化林蛙皮膚分泌物中的抗菌肽[26]。通過間斷性穩(wěn)壓電刺激等分離純化方法，能分離出新的一種具備抑菌活性的抗菌肽，并命名為 AMP-1，這種抗菌肽能夠殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和耐藥性強(qiáng)的菌株。進(jìn)行試驗發(fā)現(xiàn)這種抗菌肽溶血活性只有1.108%，這種低溶血性能夠更好的對抗腫瘤。白冰等[27]分離純化了蟾蜍皮膚分泌物中的抗菌肽，分析對比兩種活性肽的量及抑制細(xì)菌效果，發(fā)現(xiàn)蟾蜍中的抗菌肽的殺菌效果比林蛙類強(qiáng)。

很多其他國家進(jìn)行40多年，對500多種蛙類皮膚分泌物進(jìn)行了研究，Jadvinder Goraya等[28]，從北美蛙類：Ranaluterventris、Ranaberlandiieri、Ranapipiens皮膚中分離得到一系列抗菌肽，因結(jié)構(gòu)不同被分成8個不同家族，這些家族能夠很好的抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的活性。白冰等[29]研究發(fā)現(xiàn)具有廣譜抗菌活性強(qiáng)溶血活性良好的蛙類皮膚分泌物中的一種抗菌肽Drevinin IE。

4 抗菌肽研究現(xiàn)狀

抗菌肽的分子量大，使得來源困難，通過化學(xué)合成獲得，又使得生產(chǎn)成本高、無法大量生產(chǎn)等很多問題，導(dǎo)致不能應(yīng)用在臨床研究上；研究至今仍不能全面了解其毒性和人體疼痛忍受程度，所以在濃度上不好把控，穩(wěn)定性無法確定；抗菌肽在身體內(nèi)很容易被蛋白酶水解，表達(dá)基因水平較低，只能通過化學(xué)修飾來進(jìn)行包埋，但是分離純化小分子相當(dāng)困難，就目前而言這種分子結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系急需進(jìn)一步的探究；現(xiàn)在基因工程雖然可以融合蛋白，但是在微生物中抗菌肽的基因表達(dá)存在不能殺死微生物的問題，還造成了抗菌肽免疫反應(yīng)和穩(wěn)定性的問題。在這種抗菌肽分子改造條件下使其能產(chǎn)生不含抗原性的蛋白酶，成為了現(xiàn)今研究課題的熱點[30]。

5 林蛙抗菌肽研究展望

近年來林蛙類動物皮膚分泌物中抗菌肽研究成為了熱議專題，中國和國際上的專家對合成和調(diào)控動物免疫防御系統(tǒng)分子水平上的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，加強(qiáng)其在實際應(yīng)用方面的價值，例如在醫(yī)學(xué)、臨床、食用等方面，想使其成為繼青霉素之后的更強(qiáng)的抗菌類藥物。通過對蛙類皮膚分泌物的研究發(fā)現(xiàn)，林蛙分泌的抗菌肽含量大、抑菌作用強(qiáng)，并能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益，這為研究新型多肽類抗生素及抗菌肽結(jié)構(gòu)功能關(guān)系提供了理論依據(jù)，也為研究分子生物結(jié)構(gòu)提供了良好的模型條件。隨著基因工程的研究的進(jìn)一步發(fā)展，林蛙皮膚分泌物中的抗菌肽在臨床、科研、農(nóng)業(yè)上有著更加寬廣的應(yīng)用前景。

[1]陳肖靜，抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)技服務(wù)，2012(10):1177-1178,1180.

[2]張建，柴秋泉. 林蛙抗菌肽簡介[J]. 吉林農(nóng)業(yè)，2016(22):128.

[3]肖井雷，姜大成，劉玉翠.蛤蟆油的原動物分類階元探討[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005, 21 (2):40, 64.

[4]唐興，陳連水，李江. 蜘蛛抗菌肽研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，2014(10):1090-1095.

[5]王宇，尚德靜，馮伯森.中國林蛙蛙卵營養(yǎng)成分分析[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004, 27(4):471-473.

[6]Mohamed Amiche,Aurelia A.Seon,Henri Wroblewski,et al.Isolation of dermatoxin from frog skin,an antibacterial peptides encoded by a novel member of the dermaseptin genes family[J].European Journal of Biochemistry,2000,267(14):4583-4592.

[7]Kim JB,Iwamuro S,Knoop FC,Coulon J.Antimicrobial peptides from the skin of the Japanese mountain broun frog,Rana ornativentris[J].The Journal of Peptide Research,2001,58(5):349-356.

[8]王大為，張艷榮，沙坤.中國林蛙皮多糖類天然保濕因子的提取與鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002,24(6):99-102.

[9]杜明亮，李成會. 蚯蚓抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 唐山師范學(xué)院學(xué)報，2014(2):49-51.

[10]Wu Hui., Chun, Chen Hua, Ming, Shiau, Chyuan Yuan. Free amino acids and pep tides as related to antioxidant p roperties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) [J].Food Research International, 2003, 36 (9-10):949-957.

[11]王戰(zhàn)勇，井靜，蘇婷婷. 中國林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究[J]. 食品科技，2010(6):235-238.

[12]許銀葉，褚夫江，朱家勇. 抗菌肽體內(nèi)抗炎作用的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志，2013(3):260-263.

[13]Kyung Hwa Hong,Gang Sun. Photoactive antibacterial cotton fabrics treated by 3,3’,4,4’-benzophenonetetracarboxylic dianhydride[J]. Garbohydrate Polymers，2010,84:1027-1032.

[14]李蘭洲，張爽，王娟. 林蛙抗菌肽的制備及抑菌活性研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015(3):1067-1072.

[15]YarboughVL,Winkle S,Herbst-Kralovelz MM .Antimicrobial peptides in the female reproductive tract:acritical component of the mucosal immune barrier with physiological and clinical implications[J].Hum REPROD update，2015May-Jun:21(3):353-77.

[16]Hwang P M，Vogel H J． Structure-function relationships of antimicrobial peptides[J]．Biochem Cell Biol，1998，76( 2-3) : 235-246．

[17]Wu M，Maier E，Banz R，et al． Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides withplanar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli[J]．Biochem，1999，38( 22) : 7235-7242．

[18]劉紅玉. 中國林蛙蛙皮肽抗癌機(jī)理的研究[C].中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第九屆年會論文摘要集.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會,2012:2.

[19]Kyung Hwa Hong,Gang Sun. Photoactive antibacterial cotton fabrics treated by 3,3’,4,4’-benzophenonetetracarboxylic dianhydride[J]. Garbohydrate Polymers，2010,84:1027-1032.

[20]Ponti D，Mignogna G，Mangoni M L，et al． Expression andactivity of cyclic and linear analogues of esculentin-1，anantimicrobial peptide from amphibian skin[J]． Eur J Bio-chem，1999，263(3) : 921-927．

[21]Lai R，Zheng Y T，Sun J H，et al． Antimierobial peptidesfrom the skin secretion of red belly toad Bombina maxima[J]． Peptides，2002，23(3):427-435．

[22]賴仞，粱建國，張云．兩棲類皮膚抗茵多肽及其應(yīng)用[J]．動物學(xué)研究，2004，25(5):465-468．

[23]邱芳萍，周杰，李向暉，等．天然食品保鮮防腐劑林蛙皮抗菌肽[J]．食品科學(xué)，2002，23(8):279-282．

[24]Zasloff M．Antimiembial peptides of multicellular organisms[J]． Nature，2002，415(6870):389-395．

[25]王雅麗.中國林蛙皮膚抗菌肽的分離純化及生物活性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[26]徐興軍,陳麗,呂建偉,等.中國林蛙和中華蟾蜍皮膚抗菌肽的分離純化及其抗菌活性[J].四川動物,2009(2):164-167.

[27]Jadvinder Goraya,Yuqi Wang,zhihong Li,et al.peptides with antimicrobial activity from four-different families isolated from the skins of the north American frogs Rana luterventris,Rana berlandieri and Rana pipiens Eur[J].J.Biochem,2000,267:894-900.

[28]Kumari VK,Nagarai R.Structure function studies on the amphibian peptide brevinine 1E:translocating the cationic scgment from the c-terminal to a central position favors selective antibacterial activity[J].peptide Res,2001,58:433-441.

[29]白冰.中國林蛙皮膚活性多肽基因表達(dá)的多樣性研究[D].沈陽：遼寧師范大學(xué)，2011.

[30]程福亮,韓文瑜,雷連成.抗菌肽生物活性及其影響因素的研究進(jìn)展[J].中國生物制品學(xué)雜志,2007(7):539-542.

Study on Research Progress of Antibacterial Peptides

Zhang Fengchun1, Fei Yingmin2

(1. Tieli City Sibao Biological Technology Co. LTD., Tieli 152500;2. Heilongjiang Vocational College for Nationalities, Harbin 150066)

Recently, The invasion of exogenous pathogens is increasing, and it is urgent to search for new antibiotics with antibiotics from various organisms. At present, it has been found that the ecological types of amphibians are diverse and complex, Structure, function of special antimicrobial peptides, this material is good heat resistance, broad spectrum antibacterial activity, can provide important research information for screening antibiotics. In this paper, the biological activity, antibacterial mechanism, application status and research value of antimicrobial peptides in skin exudates of Rana chensinensis were reviewed, which provided important theoretical basis for in-depth study of antimicrobial peptides.

Frog skin; Antibacterial peptides; Value

S966.3+5;R284.2

A

DOI.∶10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.030