鞏健，樊慶魯

（1.淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，山東淄博 255314；2.山東省曲霉應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，山東淄博 255314）

紅曲菌主要代謝產(chǎn)物檢測方法研究進(jìn)展

鞏健1，2，樊慶魯1，2

（1.淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，山東淄博 255314；2.山東省曲霉應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，山東淄博 255314）

紅曲菌能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物大多具有一定的生理活性，而桔霉素是一種真菌毒素。文章對紅曲菌主要代謝產(chǎn)物Monascolins K、紅曲色素、麥角甾醇、γ-氨基丁酸和桔霉素的檢測方法進(jìn)行歸納總結(jié)，以期對紅曲菌代謝產(chǎn)物的研究開發(fā)提供參考。

紅曲菌；次級代謝產(chǎn)物；檢測方法；綜述

紅曲菌（Monascus）是一種絲狀真菌，屬真菌門、子囊菌亞門、不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科，該科僅有一屬，即紅曲菌屬［1］。紅曲菌能產(chǎn)生Monascolins類物質(zhì)、紅曲色素、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、桔霉素以及多種酶類等次級代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物大多數(shù)具有生理活性。Monascolin K能有效地抑制膽固醇生物合成過程中的關(guān)鍵酶HMG-CoA（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase）還原酶的活性，發(fā)揮降低人體膽固醇含量的作用［2］。紅曲色素是由紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然色素，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。γ-氨基丁酸有降血壓的作用［3］。麥角甾醇作為維生素D2的重要前體，在紫外光照的條件下能夠立即轉(zhuǎn)化為維生素D2

［4］。桔霉素是一種真菌毒素，必須對其含量進(jìn)行控制。本文對上述5種代謝產(chǎn)物的檢測方法進(jìn)行綜述，以期為紅曲菌代謝產(chǎn)物的研究開發(fā)提供參考。

1 Monascolin K

Monascolin K即洛伐他汀，是Monascolins類物質(zhì)中最常見的一種，在溶液中洛伐他汀有兩種形式：酸式和內(nèi)酯式，在紅曲中主要以酸式結(jié)構(gòu)為主。目前，Monacolin K的檢測方法主要有：薄層色譜法（thin-layerchromatography，TLC）、紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等，現(xiàn)在檢測Monascolin K最常用的方法是HPLC（238nm）。

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是一種快速、簡便、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用廣泛的色譜分析方法，此方法屬于經(jīng)典傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法，適合于定性、半定量檢測［5］。楊麗等［6］采用TLC法，以60%乙腈溶液作為提取劑，氯仿∶甲醇∶氨水為25∶3∶1（體積比）作為展開劑，以10%硫酸-乙醇溶液顯色，紫外檢測波長為365nm，可同步檢測酸型和內(nèi)酯型Monascolin K。該法適用于任何含Monascolin K樣品的檢測，特別適用于大批量經(jīng)常性的定性或半定量檢測。

1.2 紫外分光光度法

湯衛(wèi)華等［7］用紫外分光光度法檢測Monascolin K的含量，用70%乙醇萃取試樣，處理時(shí)間是8～10h，Monascolin K乙醇溶液的最大吸收波長為236nm。這種方法的準(zhǔn)確度較高，操作簡單快捷。文鏡等［8］用雙波長（246，254nm）紫外分光光度法測定紅曲中洛伐他汀的含量，采用75%乙醇超聲提取20min，離心后用中性氧化鋁柱層析吸附上清液中的色素。該法能夠排除樣品經(jīng)吸附層析分離后殘存色素的干擾，具有良好的實(shí)用性，適用于中小企業(yè)對洛伐他汀產(chǎn)品的科研開發(fā)及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1.3 毛細(xì)管電泳法

張慶慶等［9］用毛細(xì)管電泳法測定了紅曲膠囊中洛伐他汀含量，該方法簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于紅曲膠囊中洛伐他汀含量的檢測。Nigovic等［10］建立了用毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定紅曲菌保健品中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀和桔霉素的方法，洛伐他汀和桔霉素在2min內(nèi)成功地實(shí)行了分離，分析條件如下：分離電壓25kV，柱溫25℃，洛伐他汀的檢測波長為237nm，桔霉素的檢查波長為216nm，背景電解質(zhì)（BGE）為20mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）和30mmol/L SDS。

1.4 高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法

目前，高效液相色譜法是紅曲菌中洛伐他汀檢測和定量常用的方法，洛伐他汀的內(nèi)酯式和酸式都可以用C18反相柱分離和定量。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）也成功地應(yīng)用于紅曲菌中洛伐他汀的檢測和定量，并逐漸發(fā)展成為常規(guī)技術(shù)。

Friedrich等［11］用HPLC法測定了紅曲菌（M.rubber）發(fā)酵液提取物中酸式的洛伐他汀。Su等［12］用HPLC法檢查了添加硝酸鈉固態(tài)發(fā)酵紅曲菌（M.purpureus）CCRC31615中Monascolin K的含量為378mg/kg。Lee等［13］建立了同時(shí)快速測定內(nèi)酯式和酸式Monascolin K和桔霉素的HPLC法，Lee等同時(shí)用LC-MS進(jìn)行了檢測。Ajdari等［14］用LC/PDA和LC/PDA/MS檢測了紅曲菌（M.purpureus）FTC5391發(fā)酵產(chǎn)物中的Monascolin。Song等［15］用FI-MS/MS和LC-MS/MS方法對紅曲菌保健品進(jìn)行了檢測和半定量分析，這種方法能夠快速檢測紅曲菌中的洛伐他汀，也可以用于洛伐他汀的半定量。

2 桔霉素

桔霉素是一種真菌毒素，嚴(yán)重威脅紅曲產(chǎn)品的安全，建立桔霉素有效的檢測方法顯得越來越重要。目前，桔霉素的檢測方法主要有抑菌圈法、分光光度法、薄層層析法、酶聯(lián)免疫吸附法和高效液相色譜法。

2.1 抑菌圈法

陳奇等［16］利用桔霉素的抑菌作用，借助枯草桿菌作為指示菌，考察了紅曲米產(chǎn)品的抗菌性。結(jié)果表明：紅曲米產(chǎn)品中桔霉素含量越高，抑菌圈越大。因此，用枯草桿菌作為指示菌，通過濾紙片擴(kuò)散法考察紅曲米產(chǎn)品中桔霉素含量高低是可行的，該方法重復(fù)性好，效果明顯，操作快速、方便、廉價(jià)，且以乙醇作為桔霉素的萃取劑安全性好，比較適合企業(yè)用來考察其紅曲產(chǎn)品中桔霉素含量的高低。

2.2 分光光度法

桔霉素分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)共軛結(jié)構(gòu)，賦予了桔霉素?zé)晒馕盏奶匦?，因而可以通過熒光分光光度法測定桔霉素。Zhou等［17］研究了桔霉素的熒光特性，研究發(fā)現(xiàn)pH、β-環(huán)糊精和有機(jī)溶劑對桔霉素?zé)晒鈴?qiáng)度有影響，發(fā)現(xiàn)低pH、乙腈、乙酸和β-糊精能增強(qiáng)桔霉素?zé)晒鈴?qiáng)度，而乙醇和水會(huì)降低其熒光強(qiáng)度。熒光分光光度法操作簡便，檢測速度快捷，溶劑使用量少，成本較低，適用于大批量的樣品檢測。

2.3 薄層層析法

宮慧梅等［18］采用雙向展開TLC法檢測紅曲中的桔霉素，第一相分離紅曲中除桔霉素外的其他成分，第二相主要分離桔霉素。最小檢出量為0.1μg，可檢測出紅曲中的桔霉素，方法簡單易行，容易掌握。胡曉清等［19］以酸性水溶液作為提取劑，以苯∶乙酸乙酯∶甲酸（6∶3∶1）為展開劑，桔霉素的分離檢測效果較好。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

1995年，Abramson等［20］首先報(bào)道了采用間接競爭ELISA檢測紅曲中的桔霉素，檢測范圍為0.1～300ng/mL。陳福生等［21］用卵蛋白-桔霉素連接物免疫小白鼠，間接ELISA測小鼠抗血清效價(jià)，建立競爭ELISA檢測紅曲樣品中桔霉素含量的方法，結(jié)果表明此法具有較高的特異性和加標(biāo)回收能力，桔霉素的測定濃度范圍為5.0～200ng/mL，回收率為97%～104%。相對TLC法，ELISA具有靈敏度高、檢測范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。汪媛媛等［22］以1，4-丁二醇二縮水甘油醚（雙環(huán)氧試劑）為偶聯(lián)劑，合成桔霉素-蛋白質(zhì)偶聯(lián)抗原CIT-BSA，通過免疫BALB/C小鼠獲得抗桔霉素多克隆抗體，效價(jià)達(dá)到1.1×105，桔霉素的最低檢測濃度為10μg/L，其線性范圍為10～250μg/L，IC50為100μg/L。酶聯(lián)免疫檢測法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測時(shí)間短等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種霉菌毒素的檢測。

2.5 高效液相色譜法

HPLC法在桔霉素的檢測中應(yīng)用得越來越多。其中，反相HPLC是應(yīng)用較為廣泛的一種，選用草酸作為流動(dòng)相，采用熒光或紫外檢測器檢測，還可將HPLC與其他設(shè)備聯(lián)用，建立新的檢測技術(shù)。

許贛榮等［23］用乙腈作萃取劑，經(jīng)薄板層析初步分離后，采用紫外檢測器用HPLC方法檢測了紅曲米樣品中的桔霉素。文鏡等［24］使用HPLC法檢測了紅曲醋中的桔霉素。陳蘊(yùn)等［25］對高效液相色譜測定紅曲桔霉素的方法進(jìn)行優(yōu)化，比較不同色譜柱及流動(dòng)相組成對分離效果的影響，確立了采用色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為乙睛∶水（pH 2.5）為35∶65的最佳分析條件下，標(biāo)準(zhǔn)桔霉素HPLC的最低檢測質(zhì)量濃度為0.05mg/mL。李志強(qiáng)等［26］以HPLC法測定了紅曲菌AS3.531桔霉素的含量。

2.6 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）在20世紀(jì)70年代早期就開始應(yīng)用于桔霉素的檢測中。氣質(zhì)聯(lián)用儀以氣體為流動(dòng)相，分辨率較好，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，在生物代謝物和藥物的定性和定量檢測中得到了廣泛應(yīng)用。在分離柱溫度范圍內(nèi)，桔霉素可揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為可揮發(fā)物質(zhì)，從而使氣相色譜可用于桔霉素的測定。Liu等［27］采用GC-MS方法測定了紅曲中的桔霉素。質(zhì)譜中離子監(jiān)控器檢測質(zhì)荷比分別為220，205，177，105，91的一系列離子峰，方法檢測限為1μg/mL，保留時(shí)間為10.89min，該法測定得到6種紅曲樣品中桔霉素的含量范圍為4.2～25.1mg/kg。

2.7 高效毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法具有高分辨率、高靈敏度、高分析速度、分離模式多、應(yīng)用范圍廣、試劑使用量少、儀器簡單、操作成本低、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。Nigovic等在對紅曲中洛伐他汀和桔霉素的檢測方法研究中，以20nm的磷酸鹽溶液和30nm的十二烷基硫酸鈉溶液作為電泳緩沖液，工作電壓為25kV，建立了膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法，實(shí)驗(yàn)表明桔霉素的檢出限為0.08μg/kg。陳軍等［28］采用復(fù)合提取劑提取紅曲樣品，建立了高效毛細(xì)管電泳法測定紅曲中桔霉素的方法。

3 紅曲色素

紅曲色素是紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然食用色素。紅曲色素具有較強(qiáng)的耐熱性，對酸、堿、氧化劑、還原劑均較穩(wěn)定，但光穩(wěn)定性差。紅曲色素的檢測方法主要有薄層色譜法、分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。

3.1 薄層色譜法

GB/T 5009.150－2003《食品中紅曲色素的測定》以硅膠GF-254為固定相，用兩種不同的展開劑進(jìn)行展開，均在UV 254nm下觀察。甘純璣等［29］以硅膠GF-254為固定相，以乙醚∶苯∶乙醇∶水（20∶22∶40∶15）為展開劑，分離出7個(gè)斑點(diǎn)，其中1個(gè)黃色斑點(diǎn)，1個(gè)具有熒光性質(zhì)的無色斑點(diǎn)和5個(gè)紅色斑點(diǎn)。并針對展開劑組分用量的選擇、點(diǎn)樣量及點(diǎn)樣濃度對測定結(jié)果的影響和重現(xiàn)性進(jìn)行了探討。薄層色譜方法只能對樣品中紅曲色素粗略定性。

3.2 分光光度法

GB 15961－2005《食品添加劑紅曲紅》中分光光度計(jì)波長在（495±10）nm處，試樣溶液的濃度應(yīng)使測出的吸光度在0.2～0.7范圍內(nèi)為最佳，GB 4926－2008《食品添加劑紅曲米》和GB 1886.19－2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》中波長為505nm，最終稀釋液吸光度為0.3～0.6。王偉民等［30］根據(jù)溶液中色素含量的多少與OD值成正比的原理用分光光度法測定了紅曲色素。傅亮等［31］用分光光度法測定了MF107菌株的色價(jià)可達(dá)410.04U/mL。毛瑞豐［32］用分光光度法測定了11株紅曲菌純培養(yǎng)，色價(jià)最高的為131.55U/mL。孫艷君等［33］按照GB 4926－2008的方法用分光光度法測定了9株紅曲菌的紅曲色素，最高的色價(jià)為1532.69U/g，符合GB 4926－2008中對食品添加劑紅曲米（粉）產(chǎn)品的色價(jià)（U/g）≥1000的要求。分光光度法以色價(jià)為指標(biāo)反映紅曲混合色素的總量，而色價(jià)只能從一定程度上反映色素含量的高低和產(chǎn)品著色能力的強(qiáng)弱，該方法不能對紅曲色素各組分進(jìn)行定性定量分析。

3.3 高效液相色譜法

由于紅曲色素單一組分的標(biāo)準(zhǔn)品不容易得到，HPLC法多用于分析紅曲色素的組成。

鐘立人等［34］用HPLC法分析了經(jīng)各種有機(jī)溶劑萃取的紅曲色素樣品溶液，分類得到20余種組分，除了6種脂溶性色素外，還有紅色的水溶性色素成分。張慧娟等［35］利用薄層層析的方法從紅曲色素中分離精制出了多種紅曲素，重點(diǎn)對紅斑紅曲素的HPLC定性定量檢測方法進(jìn)行了研究，在紅斑紅曲素最大吸收波長（465nm）處可以靈敏快速地對紅斑紅曲素進(jìn)行定性定量的檢測。崔莉等［36］用HPLC法同時(shí)測定紅曲色素中的紅曲素和安卡紅曲黃素。胡麗芳等［37］建立了同時(shí)測定食品中5種紅曲色素的高效液相色譜檢測方法。儲(chǔ)怡士等［38］發(fā)明了一種用HPLC法對紅曲色素各組分進(jìn)行定性定量分析的檢測肉制品中紅曲色素的方法，該方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)。Sonia Campoy等［39］采用HPLC法檢測了一突變菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黃色素（紅曲素和安卡紅曲黃素）、橙色素（紅斑紅曲素和紅曲玉紅素）、紅色素（紅斑紅曲胺和紅曲玉紅胺）（色素標(biāo)準(zhǔn)品由Coca Cola Co.，Atlanta，GA提供）。

3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

Teng等［40］用LC-MS的方法對6種紅曲色素進(jìn)行了分離，通過比較分子量、分子式和碎片模式確定了每種色素。以自制的黃色素（紅曲素和安卡紅曲黃素的混合物）、橙色素（紅斑紅曲素和紅曲玉紅素的混合物）為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了HPLC定量分析，由于沒有紅色素（紅斑紅曲胺和紅曲玉紅胺）的標(biāo)準(zhǔn)品，只進(jìn)行了定性分析。馬書民等［41］采用LC-MS法測定了食品中紅曲紅胺、紅曲紅素、紅曲素、紅曲黃素的含量，并選擇離子檢測進(jìn)行陽性確證。

3.5 近紅外光譜法

張曉偉等［42］采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法構(gòu)建紅曲米中紅曲橙色素、紅曲紅色素、紅曲黃色素的預(yù)測模型。分別采用多元線性回歸、偏最小二乘回歸、主成分回歸構(gòu)建所有色素組分的數(shù)學(xué)模型，以相關(guān)系數(shù)、校正均方根誤差、預(yù)測均方根誤差、預(yù)測相對分析偏差值來評價(jià)模型的綜合性能。結(jié)果顯示：多元散射校正技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)歸一化方法能夠消除紅曲米粉顆粒不均對光譜的散射影響；導(dǎo)數(shù)處理消除了基線漂移；對于紅曲橙色素、紅曲黃色素、紅曲紅色素3種模型均具有良好的穩(wěn)定性；利用3種模型對未知紅曲樣品預(yù)測時(shí)，預(yù)測結(jié)果具有較高的線性，預(yù)測性能較好，可用于準(zhǔn)確定量預(yù)測。近紅外光譜技術(shù)可用于紅曲色素的快速無損測定，為紅曲米質(zhì)量的智能化控制提供了新的途徑。

4 麥角甾醇

紅曲中麥角甾醇的檢測方法主要有紫外分光光度法和HPLC法。陳松生等［43，44］用紫外分光光度法測定了紅曲菌中麥角甾醇的含量，100g干菌體中含量最高可達(dá)3g。朱效剛等［45］采HPLC方法對功能性紅曲中麥角甾醇進(jìn)行定性定量檢測，比紫外分光光度法精確、可靠。谷學(xué)新等［46］采用 HPLC法測定了功能性紅曲米粉中的麥角甾醇的含量。林杰等［47］采用HPLC法測定紅曲中麥角甾醇的含量。

5 γ-氨基丁酸

由于γ-氨基丁酸（GABA）對電化學(xué)、紫外和可見光的不靈敏性，用直接的方法對它測定比較困難［48］。目前紅曲菌中GABA的測定方法有TLC法、比色法、毛細(xì)管電泳法和HPLC法。

李利等［49］通過對紅曲中γ-氨基丁酸的提取方法、薄層色譜展開劑及其顯色斑洗脫液的比色法測定波長及范圍的研究，建立了一種簡便、快速測定紅曲中GABA含量的方法。秦江輝等［50］用Ber-thelot比色法測定了紅曲菌菌株中GABA含量，波長640nm，誘變菌株GABA的最高產(chǎn)量為5.255mg/g。張慶慶等［51］采用柱前衍生化毛細(xì)管電泳法（CE）對紅曲酒中γ-氨基丁酸含量進(jìn)行了測定。劉輝［52］采用相同的方法測定了紅曲中的γ-氨基丁酸。馬莉鋒等［53］采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）對紅曲菌發(fā)酵樣品中的γ-氨基丁酸進(jìn)行HPLC分析。丁獻(xiàn)榮等［54］用HPLC法測定紅曲酒糟發(fā)酵物中γ-氨基丁酸的含量。張圓林等［55］用HPLC法測定了紅曲菌菌株中GABA的含量。

6 結(jié)語

隨著紅曲菌代謝產(chǎn)物研究的深入，研究代謝產(chǎn)物的檢測方法顯得尤為重要。TLC檢測法是一種經(jīng)典的定性定量方法，一般實(shí)驗(yàn)室均能完成，雖經(jīng)過不斷改進(jìn)，但其抗干擾和精密度仍有缺陷。紫外分光光度法簡單、快速，儀器設(shè)備相對HPLC法便宜很多，但準(zhǔn)確度不如HPLC法。要求檢測靈敏度好、定量分析有較高準(zhǔn)確度以及選擇性高時(shí)應(yīng)該選擇HPLC法。近年來HPLC技術(shù)越來越成為一種常規(guī)技術(shù)，在紅曲菌各種代謝產(chǎn)物檢測中的應(yīng)用越來越多。GC法靈敏度高，但要求被檢測樣品能夠揮發(fā)或能轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)，目前僅在桔霉素檢測中有應(yīng)用。紅曲菌其他代謝產(chǎn)物能否用GC法檢測還有待于進(jìn)一步研究。由于質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，近年來液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也越來越多地用于紅曲菌代謝產(chǎn)物的檢測。其他的檢測方法也都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和使用范圍。隨著分離檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多先進(jìn)的儀器和分析技術(shù)（超高效液相色譜法等）將被應(yīng)用于紅曲菌代謝產(chǎn)物的檢測，從而為紅曲菌深入開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

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Research Progress on Detection Methods of Major Metabolites fromMonascus

GONG Jian1，2，F(xiàn)AN Qing-lu1，2
（1.Pharmaceutical ＆Biological Engineering Department，Zibo Vocational Institute，Zibo 255314，China；2.Shandong Provincial Engineering Center on Aspergillus Application，Zibo 255314，China）

Monascuscan produce many compounds，most of which have obvious biological activity.While citrinin is a mycotoxin.In this paper，the detection methods of major metabolites Monascolins K，Monascuspigment，ergosterol，γ-aminobutyric acid（GABA），citrinin are summarized.It can be used as a reference for related research and development of secondary metabolites fromMonascus.

Monascus；secondary metabolites；detection method；review

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.039

1000-9973（2017）03-0166-06

2016－09－16

淄博職業(yè)學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目

鞏?。?967－），女，副教授，碩士，研究方向：工業(yè)微生物。