劉偉 葉永鋒 天津市濱海新區(qū)塘沽傳染病醫(yī)院 （天津 300454）

結(jié)核菌快速檢測技術(shù)進(jìn)展

劉偉 葉永鋒 天津市濱海新區(qū)塘沽傳染病醫(yī)院 （天津 300454）

結(jié)核菌都是利用傳統(tǒng)涂片鏡檢方法來予以檢測，存在著較大的問題：培養(yǎng)時(shí)間需要60～90d，且檢出率不到35%，給結(jié)核菌的診斷與治療帶來了較大的困難，因此，醫(yī)學(xué)界亟待出現(xiàn)結(jié)核菌快速檢測技術(shù)，本文分別從液體培養(yǎng)技術(shù)、固體培養(yǎng)技術(shù)、硝酸鹽還原酶測定（NRA）技術(shù)等方面深入探討了結(jié)核菌快速檢測技術(shù)進(jìn)展，具有一定的參考價(jià)值。

結(jié)核菌 快速檢測 技術(shù)

1.前言

從目前來看，結(jié)核病的發(fā)病率在最近幾年內(nèi)呈現(xiàn)出較為明顯的上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來看，全球有超過20億人不同程度感染了結(jié)核，并且每年還會出現(xiàn)890萬新發(fā)結(jié)核菌病例，還有160萬結(jié)核菌患者死亡[1]。我國也是結(jié)核病高發(fā)國，發(fā)病人數(shù)居于全球第二，僅次于印度，每年會出現(xiàn)145萬新發(fā)結(jié)核菌病例，還有20萬結(jié)核菌患者死亡[2]。通常而言，結(jié)核菌都是利用傳統(tǒng)涂片鏡檢方法來予以檢測，存在著較大的問題：培養(yǎng)時(shí)間需要60～90d，且檢出率不到35%[3]，給結(jié)核菌的診斷與治療帶來了較大的困難。國外內(nèi)醫(yī)學(xué)界已經(jīng)越來越重視結(jié)核菌快速檢測技術(shù)，希望能夠通過結(jié)核菌快速檢測技術(shù)來提高結(jié)核菌的診斷率，以此達(dá)到盡快治療的效果。本文就結(jié)核菌快速檢測技術(shù)進(jìn)行進(jìn)展。

2.液體培養(yǎng)技術(shù)

在液體培養(yǎng)基中，結(jié)核桿菌的生長速度較快，且液體培養(yǎng)僅需要簡單的操作設(shè)備即可，方法原理簡單，世界衛(wèi)生組織大量鼓勵(lì)全球中低收入國家采用液體培養(yǎng)方法。

（1）分枝桿菌快速手工培養(yǎng)技術(shù)

將熒光指示器鑲嵌在肉湯培養(yǎng)基試管底部，若指示器發(fā)出橙色熒光，那么就說明存在著結(jié)核菌，通過對比含抗結(jié)核藥管與生長對照管的熒光情況就可獲得細(xì)菌藥敏情況與生長情況。分枝桿菌快速手工培養(yǎng)技術(shù)檢測精確（檢出率高于90%），方法有效、簡單，只需7～14d就可得到檢測結(jié)果[4]。

（2）The BACTEC MGIT960自動培養(yǎng)技術(shù)

The BACTEC MGIT960自動培養(yǎng)技術(shù)的檢測原理與分枝桿菌快速手工培養(yǎng)技術(shù)相似，但需要由儀器來自動控制熒光信號的讀取，但是其最大的問題在于：一次性設(shè)備投入較大，應(yīng)用面較窄[5]。

（3）The Bac T/Alert 3D系統(tǒng)技術(shù)

The Bac T/Alert 3D系統(tǒng)技術(shù)采用改良7H9 Middlebrook肉湯培養(yǎng)基，將比色傳感器鑲嵌在試管底部，試管對二氧化碳（由細(xì)菌代謝產(chǎn)生）的檢測靈敏度較高，試管顏色的變化可通過The Bac T/Alert 3D系統(tǒng)技術(shù)來予以24h實(shí)時(shí)持續(xù)檢測，待試管的顏色變?yōu)辄S色之后，那么說明確實(shí)存在著結(jié)核菌。The Bac T/Alert 3D系統(tǒng)技術(shù)的檢測特異度與檢測靈敏度均較佳，尤其適用于快速培養(yǎng)結(jié)核菌的過程中，但對二線藥敏試驗(yàn)報(bào)道不足。

（4）The Versa TREK系統(tǒng)技術(shù)

The Versa TREK系統(tǒng)技術(shù)采用7H9 Middlebrook肉湯培養(yǎng)基，通過培養(yǎng)容器內(nèi)部的壓力變化情況來對細(xì)菌的生長情況予以實(shí)時(shí)掌握，無論是檢測過程，還是培養(yǎng)過程，均在同一培養(yǎng)容器中完成，但是目前國內(nèi)外對于The Versa TREK系統(tǒng)技術(shù)的應(yīng)用報(bào)道較少，還有待于在臨床上深入評估其實(shí)用性[6]。

（5）載玻片培養(yǎng)技術(shù)

首先，在滅菌載玻片一端放置十個(gè)樣品涂片，然后，再縱向切割玻片為兩半，分別放入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內(nèi)，其中將3瓶不含抗結(jié)核藥的培養(yǎng)瓶作為對照組，將含抗結(jié)核藥的培養(yǎng)瓶作為藥敏試驗(yàn)組，培養(yǎng)24h候后再去除對載玻片進(jìn)行固定干燥。只要有菌落出現(xiàn)在藥敏組中，那么就可以將其視為耐藥。載玻片培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)果明確，培養(yǎng)原理簡單，但是安全性較差、操作繁雜。

3.固體培養(yǎng)技術(shù)

（1）TK培養(yǎng)基結(jié)核菌快速培養(yǎng)技術(shù)

培養(yǎng)基顏色會隨著結(jié)核桿菌的代謝活動予以變化，可基于培養(yǎng)基的顏色來判斷分枝桿菌是否生長。比常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)相比，TK培養(yǎng)基結(jié)核菌快速培養(yǎng)技術(shù)的檢測時(shí)間會縮短10d，并且還能夠?qū)⒊Ｒ姷募?xì)菌污染予以排除，經(jīng)濟(jì)可靠、原理簡單。

（2）噬菌體法檢測結(jié)核桿菌技術(shù)

噬菌體法檢測結(jié)核桿菌技術(shù)的檢測過程只需要3d，與涂片染色相比，其診斷敏感性略高一些，但是診斷敏感性比不上傳統(tǒng)培養(yǎng)法，可將其用于休眠期結(jié)核桿菌、活動期結(jié)核桿菌的檢測。

4.硝酸鹽還原酶測定(NRA)技術(shù)

檢測原理：硝酸鹽在結(jié)核桿菌的作用下會轉(zhuǎn)變成為亞硝酸鹽，這樣一來，就會導(dǎo)致試劑的顏色出現(xiàn)變化。硝酸鹽還原酶測定（NRA）技術(shù)是一種快速藥敏試驗(yàn)方法，不僅價(jià)格便宜，而且還可用于檢測痰標(biāo)本，測試?yán)Ｆ降拿舾卸葹?4%～100%，特異度為94%～100%；測試異煙肼的敏感度大于92%，特異度也大于92%；測試鏈霉素的敏感度為100%，特異度為100%；測試乙胺丁醇的敏感度為93%，特異度為100%，檢測時(shí)間最長為23 d。

E實(shí)驗(yàn)：E實(shí)驗(yàn)是一種快速藥敏實(shí)驗(yàn)方法，能夠?qū)Χ喾N藥物進(jìn)行同時(shí)測試，但容易受到其他因素的污染和影響，較易出現(xiàn)較高的陰性率與假陽性率，會導(dǎo)致檢測費(fèi)用大幅度增加，技術(shù)有待改進(jìn)。

5.核酸擴(kuò)增技術(shù)

臨床上對分枝桿菌種類進(jìn)行鑒定的主要方法一直以來都是生化方法，不僅費(fèi)時(shí)繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且還很難得到較為精確的檢驗(yàn)結(jié)果。而后出現(xiàn)的Accuprobe試劑盒能夠?qū)εR床標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定，能夠利用DNA探針來對堪薩斯分枝桿菌、復(fù)合結(jié)核桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥結(jié)核分枝桿菌、戈登氏分枝桿菌等進(jìn)行直接辨別，安全可靠。

6.GeneXpert技術(shù)

Gene Xpert屬于快速PCR檢測方法，主要優(yōu)點(diǎn)在于診斷試劑盒和檢測系統(tǒng)的獨(dú)特設(shè)計(jì)以及兩者之間完美結(jié)合。工作人員只須按照配比將痰標(biāo)本與處理液混合，靜置10min，然后再將混合液體滴入反應(yīng)盒，再放入檢測模塊中，即完成手工操作過程。等待大約2h，檢測報(bào)告就可以打印出來。與傳統(tǒng)意義上的PCR設(shè)計(jì)不同，Gene Xpert采用的是geneXpert全封閉、全自動化的PCR檢測平臺，采取獨(dú)特的模塊設(shè)計(jì)，每個(gè)模塊都集成有獨(dú)立的檢測系統(tǒng)。

[1] 趙建宏, 李雅靜, 溫海楠, 等. 非結(jié)核分枝桿菌感染的分子診斷研究進(jìn)展[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2012,18(3):120-125.

[2] 代旭磊, 柳愛華, 寶福凱, 等. 結(jié)核分支桿菌的分子檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012,19(8):110-114.

[3] 張朝寶, 王洪海, 張舒林. 結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度測定方法及臨界值設(shè)置研究進(jìn)展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012,30(5):130-135.

[4] 陳曼, 胡啟飛, 祝絢, 等. 肺結(jié)核快速檢測技術(shù)對肺結(jié)核的早期診斷[J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志, 2010,18(3):141-146.

[5] Devasia1 RA, Blackman A, May C, et al. Fluoroquinolone resistancein Mycobacterium tuberculosis:an assessment of MGIT 960,MODSand nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross-resistance[J]. J Antimicrob Chemother, 2009,63(6):1173-1178.

[6] Bwanga F, Haile M, Joloba ML, et al. Direct nitrate reductase assayversus microscopic observation drug susceptibility test for rapid detec-tion of MDR-TB in Uganda[J]. Plos One, 2011,50(3):109-115.

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