文/ 賈麗 王小亮 王靜波 徐立蒲 曹歡 王姝 張文

2016年北京市魚類致病菌對抗菌藥物的感受性監(jiān)測分析

文/ 賈麗 王小亮 王靜波 徐立蒲 曹歡 王姝 張文

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊專欄

2016年8月，河北省淶源縣一家鱘魚養(yǎng)殖場突發(fā)疾病，且出現(xiàn)大量死亡。為確定病原，從具有典型癥狀的患病魚的肝、腎和脾中進行病原菌分離鑒定。經(jīng)28℃培養(yǎng)后，上述三個組織中均分離獲得大量形態(tài)一致菌落。肝、腎和脾分離的病原菌分別編號為LY160816L、LY160816K、LY160816S，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化鑒定以及16S rDNA基因序列比對，鑒定結果為海豚鏈球菌。結合臨床癥狀，綜合判斷，導致該場鱘魚暴發(fā)性死亡的病因是感染了海豚鏈球菌。

為落實全國水產(chǎn)技術推廣總站聯(lián)合我站實施的“主要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原微生物耐藥性普查”項目。我站于2016年4月～10月，分別在北京市金魚和虹鱒魚主養(yǎng)殖區(qū)選擇示范點，對其患病魚定期進行分離病原菌，并測定其對水產(chǎn)用抗菌素類藥物的敏感性。具體分析情況如下。

一、材料和方法

1.供試藥物

選用我國現(xiàn)在允許使用的水產(chǎn)用抗菌類藥物。氨芐西林鈉、紅霉素、新霉素、鹽酸土霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、甲砜霉素、鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、新諾明。

2.供試菌株

2016年4月～2016年10月，從北京市通州區(qū)3家金魚養(yǎng)殖場和懷柔區(qū)2家虹鱒魚養(yǎng)殖場病魚體內(nèi)，分離病原菌。從金魚體內(nèi)分離氣單胞菌38株，其中嗜水氣單胞菌11株、溫和氣單胞菌27株。從虹鱒魚體內(nèi)為分離出氣單胞菌。具體的菌株詳細信息見附錄1。

3.供試菌株最小抑菌濃度的測定

采用MIC常規(guī)測定方法。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

為便于數(shù)據(jù)分析，我們界定了濃度梯度稀釋法檢測值的耐藥線。新霉素、紅霉素、鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考設定為≥12.5g/ mL，氨芐西林鈉、鹽酸土霉素、甲砜霉素設定為≥25g/mL，磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶鈉、磺胺間甲氧嘧啶鈉、新諾明設定為≥500g/mL。加權平均MIC（WMMIC）=∑（菌株數(shù)×對應的MIC值）/菌株總數(shù)，MIC90值采用SPSS統(tǒng)計。

二、結果

1.養(yǎng)殖場病害、藥物使用和損失情況

在監(jiān)測期間， 金魚發(fā)生的主要病害種類有車輪蟲病、爛鰓病、掉眼病和金魚造血器官壞死病，其中爛鰓病主要集中在6月至8月，車輪蟲病和掉眼病在監(jiān)測期間每月均有發(fā)生，掉眼病的年病死率約5%～10%。金魚造血器官壞死病發(fā)生在6月和7月，造成的死亡率約30%。養(yǎng)殖場采用的藥物種類有車輪凈、聚維酮碘、溴碘、戊二醛、二氧化氯、三黃粉、中草藥和恩諾沙星粉。

虹鱒魚發(fā)生的主要病害種類有傳染性造血器官壞死病、水霉病、細菌性爛鰓病，其中傳染性造血器官壞死病造成的經(jīng)濟損失最為嚴重，苗種死亡率達80%以上，爛鰓病主要發(fā)生在6月齡以上魚種，造成的死亡率約5%。養(yǎng)殖場采用的藥物種類和總用量如下：聚維酮碘、鹽酸土霉素、氟苯尼考、鹽酸恩諾沙星、三黃粉等。

2.北京市金魚源氣單胞菌耐藥性總體情況

總體上，北京市金魚源氣單胞菌100%耐受氨芐西林鈉，其次對磺胺類藥物耐藥率最高，均在94%以上，耐藥濃度在500g/mL以上；對新霉素和鹽酸土霉素，耐藥率在23%~32%之間。耐藥率低于10%的藥物種類為紅霉素、鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考和甲砜霉素，耐藥率分別為7.89%、0%、0%、2.63%、0%和0%。詳見表1。

3.不同種類病原菌的抗菌藥物耐藥性

2016年監(jiān)測中共分離出嗜水氣單胞菌11株、溫和氣單胞菌27株。按菌株種類統(tǒng)計其對所檢測藥物的耐藥率和加權平均MIC值，結果見表2。從表上可以看出兩種氣單胞菌對氨芐西林鈉、鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、甲砜霉素、新諾明和磺胺間甲氧嘧啶鈉的耐藥率完全相同，或100%耐藥或100%敏感；其加權平均MIC值在100%耐藥種類上相同，而在100%敏感種類上不同。兩種菌對新霉素、紅霉素、磺胺二甲氧嘧啶鈉和磺胺嘧啶鈉的耐藥率差異在7%以下，加權平均MIC值前兩者有所差異，后兩者差異在5%以下。兩種菌對多西環(huán)素和鹽酸土霉素的耐藥率差異在9.09%～19.2%,加權平均MIC值多西環(huán)素上有較大差異，而在鹽酸土霉素上差異在5%以下。耐藥率差異直觀圖見圖1。

（1）嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

檢測了11株嗜水氣單胞菌對各抗菌藥物的感受性,分布情況見表3。從表上可看出，嗜水氣單胞菌對新霉素的MIC集中在3.13g/mL～25g/mL，對紅霉素的MIC主要集中在3.13g/mL～6.25g/mL，對鹽酸諾氟沙星和諾氟沙星的MIC主要集中在1.56g/mL～3.13g/mL，對多西環(huán)素的MIC主要集中在0.39g/mL～0.78g/mL和3.13g/ mL～6.25g/mL兩個區(qū)間，對鹽酸土霉素的MIC主要集中在6.25g/mL～25g/mL，對氟苯尼考的MIC主要集中在0.39g/mL～1.56g/mL，對甲砜霉素的MIC主要集中在0.78g/mL～3.13g/mL，對氨芐西林鈉和磺胺類藥物的耐藥濃度幾乎均在最高測試濃度上限。

（2）溫和氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

檢測了27株溫和氣單胞菌對抗菌藥物的感受性,分布情況見表4。從表上可看出，溫和氣單胞菌對新霉素的MIC集中在3.13g/mL～12.5g/mL，對紅霉素的MIC主要集中在3.13g/mL～6.25g/mL，對鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素的MIC從≤0.2g/mL到6.25g/mL均有分布，對鹽酸土霉素的MIC主要集中在6.25g/ mL～25g/mL，對氟苯尼考的MIC主要集中在0.39g/mL～1.56g/mL，對甲砜霉素的MIC主要集中在0.78g/mL～1.56g/mL，對氨芐西林鈉和磺胺類藥物的耐藥濃度幾乎均在最高測試濃度上限。

4.病原菌對抗菌藥物感受性的年度變化

針對金魚源氣單胞菌對抗菌藥物的加權平均MIC值和耐藥率，按年份進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結果見表5。從表上可以看出，氣單胞菌對新霉素的加權平均MIC值和耐藥率大幅上升，這可能與不同年份采用新霉素或其硫酸鹽不同有關；對鹽酸諾氟沙星的MIC值有小幅上升，但都在耐藥線之下，這可能與養(yǎng)殖場2016年使用了同類藥物恩諾沙星制劑有關；對多西環(huán)素、氟苯尼考和甲砜霉素的加權平均MIC值和耐藥率都呈現(xiàn)下降趨勢，調查顯示2016年該養(yǎng)殖場未使用過這三種藥物，耐藥率和耐藥濃度下降可能與菌株耐藥性的自然消失有關。

三、分析與建議

上述數(shù)據(jù)表明：①氣單胞菌對氨芐西林鈉呈現(xiàn)100%耐藥，耐受濃度高于100g/mL。有關資料表明該菌對青霉素類藥物天然耐藥，而氨芐西林屬于半合成青霉素類藥物，理論上解釋了本文中該菌對氨芐西林鈉耐藥結果，同時意味著今后進行耐藥普查時，無需檢測氣單胞菌對青霉素類藥物的感受性。②氣單胞菌對磺胺類藥物呈現(xiàn)較高的耐受率，均在90%以上。磺胺類藥物在北京地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖上已使用約30年，可能是導致氣單胞菌呈現(xiàn)高耐藥率的主要原因。但是，檢測中發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物高濃度管的渾濁度低于低濃度的渾濁度，資料顯示磺胺類藥物是抑菌藥，因此，目前采用濃度梯度稀釋法檢測磺胺類藥物的感受性是否合適有待商榷。③金魚源氣單胞菌總體上對鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考和甲砜霉素100%不耐藥，對多西環(huán)素的耐藥率也低于5%。因此，當養(yǎng)殖場發(fā)生細菌性疾病時，可優(yōu)選同屬氟喹諾酮類的嗯諾沙星或者多西環(huán)素。而氟苯尼考和甲砜霉素在使用過程中，容易使病原菌短時間產(chǎn)生較高的耐藥性，同時這兩種藥物屬于劑量依賴型藥物，因此，應慎用，如需使用，需要一次給足劑量，并延長該藥物的使用間隔時間。④往年監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)不同養(yǎng)殖場、不同魚類、不同病原菌種類、甚至同種病原菌的不同菌株對抗菌藥物的感受性不同。然而，對生產(chǎn)方式和用藥方式相同的2家～3家金魚養(yǎng)殖場連續(xù)2年監(jiān)測表明，嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌對藥物感受性，總體上呈現(xiàn)相似的特征，如對紅霉素、氟苯尼考和甲砜霉素等敏感區(qū)間相同。對鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素等敏感區(qū)間相似，對氨芐西林鈉和磺胺類藥物均呈現(xiàn)高耐藥性。這些特征提示我們繼續(xù)進行耐藥普查時，可減少梯度范圍。同時，可依據(jù)這個特性，分區(qū)域進行病原菌耐藥普查，以避免監(jiān)測時分離不到目標病原菌的情況。

表1 北京市金魚源氣單胞菌的藥物感受性分布表（n=38）

表2 不同種類病原菌的加權平均MIC值和耐藥率

圖1 不同病原菌種類對抗菌藥物的耐藥率

表3 嗜水氣單胞菌對各抗菌藥物的感受性分布表（n=11）

表4 溫和氣單胞菌對各抗菌藥物的感受性分布表（n=27）

表5 金魚源氣單胞菌對抗菌藥物的加權平均MIC值和耐藥率的年份變化

作者單位：北京市水產(chǎn)技術推廣站