■文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國 謝金文 李 峰 沈志強(qiáng)

非洲豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

■文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國 謝金文 李 峰 沈志強(qiáng)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨床癥狀與豬瘟極其相似。本病已在非洲、歐洲和美洲等幾十個(gè)國家暴發(fā)。雖然我國尚未發(fā)生，但防控其傳入的形勢(shì)也非常嚴(yán)峻。本文綜述了非洲豬瘟病毒最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為我國開展非洲豬瘟的監(jiān)測(cè)及綜合防控提供技術(shù)參考。

非洲豬瘟；非洲豬瘟病毒；檢測(cè)；研究進(jìn)展

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是我國一類動(dòng)物疫病和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，受到世界各國的高度重視。本病是唯一以節(jié)肢動(dòng)物作為傳播媒介的DNA病毒。迄今為止，ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個(gè)國家暴發(fā)。雖然我國尚未發(fā)生，但防控ASF傳入的形勢(shì)非常嚴(yán)峻。目前，本病尚無有效的預(yù)防疫苗和治療藥物，防止疫情擴(kuò)大的唯一有效措施就是撲殺。因此事先建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的ASFV檢測(cè)方法顯得十分必要。本文綜述了ASFV最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為我國開展ASF的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)參考。

1 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA應(yīng)用于血清抗體的檢測(cè)，具有操作方便、特異性較好、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于大批量樣品的檢測(cè)，OIE將ELISA作為診斷ASF的首選血清學(xué)方法。ASFV含有約150種蛋白，目前國內(nèi)外常用作檢測(cè)抗原的蛋 白 有 VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等[1](1979)首次建立了間接ELISA方法檢測(cè)ASFV抗體，具有較好的敏感性和特異性。Pastor等[2](1990)分別以ASFV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP73和病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中高特異胞質(zhì)可溶性抗原(CS-P)建立了兩種間接ELISA方法，兩種方法特異性均較高，但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d檢測(cè)出ASFV抗體。Vidal等[3](1997)用VP73單抗建立的固相ELISA，能夠檢測(cè)到濃度為0.5μg/mL的VP73抗原和2.3×102pfu/mL的全病毒顆粒。Hutchings等[4](2006)比較了用全病毒多抗血清和針對(duì)VP73蛋白的單抗進(jìn)行間接夾心ELISA檢測(cè)ASFV，顯示多抗血清的敏感性高于單抗。Perez等[5](2006)以昆蟲細(xì)胞表達(dá)的P30重組蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)ASFV抗體的間接ELISA方法，敏感性高，可用于ASFV特異性抗體的早期檢測(cè)。Gallardo等[6](2009)利用重組蛋白 pK205R、pB602L、p104R和 P54建立的ELISA檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性。蔣正軍等[7](2000)以桿狀病毒表達(dá)的ASFV VP72蛋白為抗原，研究和組裝了間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，具有反應(yīng)體系小、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)，且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇華磊[8](2006)采用大腸桿菌表達(dá)的GST-VP72融合蛋白為包被抗原，建立了間接ELISA。朱紅[9](2007)成功獲得5株分泌抗ASFV VP72蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株，也建立了間接ELISA方法。李秋霞[10](2010)以大腸桿菌表達(dá)的ASFV pET32a-VP73L重組蛋白作為包被原，也建立了間接ELISA方法。曾少靈等[11](2013)利用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的ASFV的VP73重組蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了間接ELISA方法。靳雯雯[12](2014)以VP73純化蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，與商品化的阻斷ELISA相比，其具有較好的敏感性和特異性。董志珍等[13](2012)針對(duì)ASFV P54蛋白建立了單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)法ELISA并構(gòu)建了檢測(cè)試劑盒，靈敏度高于間接免疫熒光(IFA)方法。梁云浩等[14](2014)利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的ASFV P54重組蛋白作為檢測(cè)抗原建立了間接ELISA方法。鄔旭龍等[15](2016)以原核表達(dá)的ASFV pK205R蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA檢測(cè)方法。張倩等[16](2012)采用瑞典Svanova ASFV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)遼寧綏靖、內(nèi)蒙古赤峰、大連東港共計(jì)92份豬血清進(jìn)行了ASFV抗體的檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性。鄧飛等[17](2016)采用西班牙Ingenasa ASFV阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)來源于四川省內(nèi)的92份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，92份血清樣本均為ASFV抗體陰性。

1.2 膠體金免疫層析(GICA)試紙條

張?chǎng)斡畹萚18](2014)用原核表達(dá)的ASFV P54重組蛋白制備了ASFV抗體快速檢測(cè)膠體金試紙條，通過對(duì)ASFV不同感染時(shí)期141份豬血清樣品進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，顯示該試紙條在感染早期的符合率高于OIE推薦的ELISA檢測(cè)方法。劉波[19](2014)也運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)和膠體金免疫層析技術(shù)，對(duì)ASFV快速檢測(cè)試紙條的技術(shù)進(jìn)行了研究。吳海濤[20](2015)運(yùn)用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標(biāo)抗體，制備了用于檢測(cè)ASFV的膠體金免疫層析試紙條。

1.3 其他血清學(xué)方法

熒光抗體試驗(yàn)(FAT)可用于檢測(cè)野外可疑豬或?qū)嶒?yàn)室接種豬的脾、淋巴結(jié)等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，但需要專業(yè)試驗(yàn)人員，同時(shí)需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測(cè)方法。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)可用于檢測(cè)感染ASFV的豬血清樣品。該方法的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)ELISA檢測(cè)結(jié)果不確定或制備抗原困難或復(fù)雜時(shí)，可選用此法。Malmquist等[21](1960)提出并建立了血細(xì)胞吸附試驗(yàn)方法，血細(xì)胞吸附是指豬的紅細(xì)胞附著在感染ASFV的單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞的表面。絕大多數(shù)從非洲分離的ASFV毒株以及最初從歐洲國家分離的ASFV毒株均產(chǎn)生豬紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。Pan等[22](1978)應(yīng)用免疫過氧化物酶噬斑染色技術(shù)，對(duì)接種ASFV的Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，3d后觀察到噬斑?？蓪?duì)ASFV進(jìn)行抗原定量分析。此方法快速、特異，不用借助其他儀器，肉眼便可觀察結(jié)果。Pastor等[23](1992)用細(xì)胞質(zhì)可溶性抗原CS-P，建立了斑點(diǎn)免疫(DIA)檢測(cè)方法，敏感性與OIE推薦的ELISA方法相當(dāng)。Marco等[24](2007)建立了免疫組化法，用來檢測(cè)急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學(xué)變化，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染ASFV豬有出血、單核細(xì)胞增多現(xiàn)象。免疫組化法是通用的檢測(cè)方法之一，但對(duì)于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測(cè)方法。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 PCR

PCR具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前ASFV最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。Aguero等[25](2003)和曾少靈等[26](2009)先后根據(jù)ASFV VP72基因設(shè)計(jì)引物，建立了ASFV的PCR檢測(cè)方法，均具有良好的敏感性和特異性，可以檢測(cè)出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。Aguero等[27](2004)和張倩[28](2010)先后建立了一步法多重RT-PCR方法，能夠鑒別診斷豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)和ASFV，可以從臨床樣品(如抗凝全血、細(xì)胞培養(yǎng)物和組織)中檢測(cè)到病毒，這為早期快速、特異性診斷非洲豬瘟和豬瘟提供了可靠的方法。Basto等[29](2006)建立了檢測(cè)蜱ASFV的套式PCR方法，敏感性高于OIE推薦的PCR檢測(cè)方法。Giammarioli等[30](2008)建立了檢測(cè)CSFV、ASFV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬細(xì)小病毒(PPV)5種病毒的多重PCR檢測(cè)方法，可以用于這5種病毒感染的鑒別診斷。崔尚金等[31](2012)建立了ASFV的高效納米PCR檢測(cè)方法，該方法采用納米金顆粒作為熱導(dǎo)介子，提高了PCR反應(yīng)效率。敏感性試驗(yàn)表明，納米PCR是常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)敏感性的1,000倍以上，最低核酸拷貝數(shù)檢出量可以達(dá)到10個(gè)拷貝。采用該方法對(duì)黑龍江、吉林和河南3個(gè)省份臨床送檢的69份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明該地區(qū)均無ASFV感染情況。

2.2 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品。King等[32](2003)、李維彬等[33](2007)、張泉等[34](2007)、黃萍等[35](2010)、Tignon等[36](2011)、李洪利等[37](2012)先后根據(jù)ASFV VP72基因，曾少靈等[38](2010)根據(jù)VP73基因，董志珍等[39](2009)根據(jù)P54基因各自設(shè)計(jì)引物和探針，建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。McKillen等[40](2007)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子信標(biāo)(molecular beacon)技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏性和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。該檢測(cè)方法可快速鑒別PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等[41](2010)根據(jù)ASFV K205R基因序列設(shè)計(jì)合成引物及TaqMan探針，建立了基于K205R基因的ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。McKillen等[42](2010)根據(jù)9GL基因建立了MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低可以檢測(cè)到20拷貝標(biāo)準(zhǔn)DNA。該方法檢測(cè)臨床樣品中的ASFV，敏感性與OIE推薦TaqMan熒光定量PCR方法相當(dāng)。Fernandez等[43](2013)利用通用探針庫建立了ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。陳靜靜等[44](2012)建立了雙重?zé)晒舛縋CR，可同時(shí)檢測(cè)CSFV和ASFV，只需一步即可完成，可作為鑒別兩種病毒的診斷方法。王建華等[45](2016)根據(jù)ASFV CP530R基因和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)NSP2基因?yàn)榘行蛄?，分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立了一種可同時(shí)鑒別檢測(cè)ASFV和HPPRRSV的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)

RPA是一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測(cè)技術(shù)，該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、檢測(cè)成本低、結(jié)果確實(shí)可靠，王建昌等[46](2016)基于ASFV VP72基因保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，建立了ASFV RPA等溫檢測(cè)方法，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術(shù)支持。

2.4 線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LATE-PCR)技術(shù)

LATE-PCR是不對(duì)稱PCR的一種形式，該方法用于檢測(cè)組織樣品的病毒，其敏感性可以達(dá)到大約1拷貝的病毒DNA。Ronish等[47](2011)基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法，為ASFV的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了敏感的檢測(cè)方法。

2.5 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)

LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，且不需要特殊儀器設(shè)備，具有較高的臨床實(shí)用性。江彥增等[48](2009)、王彩霞等[49](2010)、楊吉飛等[50](2011)先后根據(jù)ASFV VP72基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了快速檢測(cè)ASFV的LAMP方法，最低檢測(cè)限可達(dá)10拷貝質(zhì)粒DNA，且具有良好的特異性。鄔旭龍[51](2014)根據(jù)ASFV K205R基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP檢測(cè)方法。LAMP方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可進(jìn)行靶序列的循環(huán)擴(kuò)增，不但大大縮短了時(shí)間，且使反應(yīng)能夠在恒溫條件下進(jìn)行，無需特殊儀器設(shè)備，肉眼判讀，可以滿足基層快速診斷的需要，非常適合于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)使用。

2.6 探針雜交技術(shù)

張?chǎng)斡畹萚52](2011)針對(duì)ASFV VP72基因分別設(shè)計(jì)合成1條與保守區(qū)域互補(bǔ)的5′生物素標(biāo)記及3′烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標(biāo)記探針，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素探針及納米金標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入吸附鏈霉親和素的酶標(biāo)板，利用親和原理，捕獲雜交產(chǎn)物，銀染增強(qiáng)法對(duì)納米金標(biāo)記探針進(jìn)行信號(hào)放大，進(jìn)而建立了檢測(cè)ASFV VP72基因的納米金探針雜交方法。探針雜交技術(shù)檢測(cè)靈敏度高，能有效排除PCR檢測(cè)過程中的非特異性結(jié)果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，在酶標(biāo)板中可批量反應(yīng)，為ASFV核酸檢測(cè)方法開辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高、操作較繁瑣，對(duì)試驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高。

3 小結(jié)

近年來，隨著世界經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易全球化趨勢(shì)的發(fā)展，一些嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類健康的跨國疫病接連發(fā)生，使我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到了沉重的打擊，嚴(yán)重影響了我國的經(jīng)濟(jì)和進(jìn)出口貿(mào)易的健康發(fā)展。ASFV雖然尚未在我國發(fā)現(xiàn)，但從西非至東非、歐洲、亞洲傳播的態(tài)勢(shì)已經(jīng)形成，該病對(duì)我國潛在的威脅也越來越大，是我國貿(mào)易中監(jiān)測(cè)的重要疫病，必須保持高度警惕，嚴(yán)防該病入境。由于本病尚無有效的疫苗用于防控，因此研究并建立敏感、特異、快速的ASFV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)ASF的防控至關(guān)重要。目前，ASFV的檢測(cè)技術(shù)主要有針對(duì)病毒DNA的核酸檢測(cè)技術(shù)和基于病毒抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù)兩大類。OIE推薦檢測(cè)ASFV的方法主要有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，但抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測(cè)方法存在一定的局限性。PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP等分子生物學(xué)技術(shù)在豬感染ASFV的早期即可檢測(cè)到病毒核酸，在ASFV的早期檢測(cè)中具有重要作用?？傊珹SFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但對(duì)各種方法的檢測(cè)結(jié)果均要求準(zhǔn)確、快速、敏感，這不僅對(duì)感染ASFV的動(dòng)物治療非常重要，而且對(duì)未感染的動(dòng)物及時(shí)采取有效的預(yù)防措施同樣具有重要的意義。隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，ASFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法必將不斷完善，進(jìn)一步為我國開展ASF的監(jiān)測(cè)與綜合防控提供技術(shù)支持?！?/p>

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山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121027)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-08-17)。