●路則寶

絲狀真菌基因敲除的研究現(xiàn)狀

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基因敲除又稱目標(biāo)基因破壞或目標(biāo)基因替換（Targeted gene replacement, TGR）。本文主要對近年來基因敲除在絲狀真菌基因功能研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點作簡要綜述，以期為科研工作者提供一定參考。

基因敲除；同源重組；RNA干擾

基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因,從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除或取代，通過分析突變體表型而明確基因功能的方法。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。在DNA同源重組（homologous recombination, HR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的這種TGR技術(shù),在酵母與哺乳動物細(xì)胞中已有廣泛應(yīng)用。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用。

1 基因的插入突變

基因的插入突變主要是利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞[1]，根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于動植物細(xì)胞的插入；對于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用。

2 RNA干擾（RNA interference, RNAi）

RNAi引起的基因敲除則是因為少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中，所以RNAi的反應(yīng)過程也可以用于基因敲除，近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡單方便的方法。

3 絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化

目前應(yīng)用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化的方法有很多，常用的轉(zhuǎn)化方法主要有：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、電擊法、基因槍法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、微注射法等。

3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

近年來,AtMT成為絲狀真菌轉(zhuǎn)化發(fā)展趨勢[2]，在適宜的條件下，A.tumefaciens可將外源DNA導(dǎo)入多種真菌和真菌組織，一些其他體系難于轉(zhuǎn)化的真菌也可以通過AtMT轉(zhuǎn)化，與基因槍法相比，AtMT效率更高，而且產(chǎn)生復(fù)雜轉(zhuǎn)化子的數(shù)量少，AtMT轉(zhuǎn)化相對簡單，不需要制備原生質(zhì)體既可以用于隨機(jī)插入突變也可以進(jìn)行TGR[3]。

3.2 CaCl2/聚乙二醇法

通常是在室溫下，將原生質(zhì)體置于10～50 mmol/L的CaCl2與高濃度的聚乙二醇中10～30 min。

3.3 電擊轉(zhuǎn)化

通常是將原生質(zhì)體（有時用萌發(fā)的孢子）置于短暫的高電壓之下,使細(xì)胞膜通透性增加，更易于攝取外源DNA。

3.4 基因槍法

在尚未建立原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或?qū)τ诩?xì)胞壁成分缺乏了解的真菌，基因槍法是一種有效的轉(zhuǎn)化方法；另外，對于大麥白粉病菌（Erysiphe graminis, DC）等無法分離培養(yǎng)的專性寄生菌，可以通過與感染的寄主葉片同時轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

4 各種方法特點比較分析

CaCl2/聚乙二醇法、電擊轉(zhuǎn)化在真菌中有廣泛應(yīng)用，但都存在一個局限,就是需要制備原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備[4]是一個復(fù)雜的過程，不同真菌細(xì)胞壁成分不同，原生質(zhì)體制備所適用的酶的種類及用量都不同，因此很難用統(tǒng)一的體系來實現(xiàn)?；驑尫ㄊ菍NA包裹在金屬或鎢粒子的表面來轟擊完整的真菌組織，與原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相比, 基因槍法具有相同或者更高的轉(zhuǎn)化效率、整和度及遺傳穩(wěn)定性；可用于基因槍法轉(zhuǎn)化的真菌組織相對較多，而能夠用于制備原生質(zhì)體的真菌組織是有限的，因此基因槍法具有優(yōu)勢，

綜上所述，各種轉(zhuǎn)化方法都能實現(xiàn)絲狀真菌的TGR，目前，對上述方法進(jìn)行直接比較的研究很少，一般認(rèn)為AtMT和基因槍法更適合于TGR，其中AtMT效率相對更高。第一個被轉(zhuǎn)化的絲狀真菌是粗糙鏈孢霉，目前為止已有上百種絲狀真菌轉(zhuǎn)化成功，其中有許多種類可被具有不同選擇標(biāo)記的多種載體所轉(zhuǎn)化。已轉(zhuǎn)化成功的絲狀真菌中有工業(yè)真菌（如黑曲霉、米曲霉等）、醫(yī)用真菌（如產(chǎn)黃青霉、頂頭孢霉）、植物病原真菌（如玉米黑粉菌、小麥全蝕菌等）、殺蟲真菌（如白僵菌、綠僵菌）、真菌上寄生真菌（如哈氏木霉）、食用真菌（如裂褶菌、鬼傘等）、菌根真菌（如卷邊樁菇、漆蠟?zāi)⒌龋┑萚5]。

（作者單位：楚雄醫(yī)藥高等專科學(xué)校）

[1]陳其軍,肖玉梅,王學(xué)臣,周海夢.植物功能組研究中的基因敲除技術(shù)[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40:121-126.

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[3] Michielse CB, Arentshorst M, Ram AF, Hondel CA.Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement efficiency in Aspergillus awamori [J]. Fungal Genetics and Biology, 2005,(42):9-19.

[4]宋愛環(huán),李紅葉,劉小紅.指狀青霉(Penicillum digitatum)原生質(zhì)體制備和再生條件[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2004,(2):197-201.

[5]許楊,涂追.絲狀真菌基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2007,26(1):120-126.

路則寶(1980～)，男，碩士研究生，講師，研究方向為微生物與免疫學(xué)與教學(xué)。