邱 薇 ， 胡挺松 ， 王文博 ， 余 靜 ， 陳 剛 ， 張富強 ， 鄭 穎 ， 范泉水

(成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ， 云南 昆明 650118)

由犬細小病毒引起的犬細小病毒病是一種急性、以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬科和鼬科動物重要傳染病。CPV對外界的抵抗力強，存活時間長，故其傳染性極強，各種年齡的犬都能感染，可引起犬出血性腹瀉和心肌炎，并使白細胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高，癥狀與貓泛白細胞減少癥相似。CPV有兩種不同的血清型，即CPV-1型和CPV-2型。日本、德國和美國從自然發(fā)病的貓分離到CPV-2 a型和CPV-2 b型，這些貓都出現(xiàn)顯著的白細胞減少癥。CPV-2又分為CPV-2 a型和CPV-2 b型兩種亞型。近年來又出現(xiàn)了CPV-2 c型，每次變異都引起病毒在致病性和宿主嗜性方面的變化[1-2]。2010年，我國檢測到CPV 2 c型毒株[3]，但目前我國還是以CPV-2 a型和CPV-2 b型為主要流行毒株[4]。

CPV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2在病毒感染過程中起著極為重要的作用，缺失VP1蛋白或VP2蛋白的突變體毒株均喪失了對宿主細胞的再感染性，VP2蛋白上的幾個關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就會改變抗原特性和宿主范圍，VP1蛋白氨基酸序列包含整個VP2蛋白的氨基酸序列，且終止于共同的C端[5]。 VP1蛋白比VP2蛋白在其氨基端多出一段序列，且富含堿性氨基酸殘基[6]。VP2基因的5`端以及該基因上的蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)loop1和loop3是重要的B細胞抗原表位區(qū)，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，這些區(qū)域氨基酸殘基的變化是導(dǎo)致CPV毒株抗原漂移的主要原因，傳染性病毒粒子包含60個蛋白亞基，主要由VP2亞基、少量的VP1和VP3亞基組成[7]。有證據(jù)顯示，桿狀病毒或疫苗載體表達的僅由VP2組裝的CPV空衣殼和真正的空衣殼在抗原性上相似，說明VP1和VP2在功能上可能具有相同的作用[8]。還有研究[9,10]表明，VP1和VP2基因均可誘導(dǎo)犬產(chǎn)生中和抗體，并能保護犬抵御強毒的攻擊。

本研究從發(fā)病死亡犬的腸內(nèi)容分離到1株犬細小病毒野毒株，通過PCR獲得其VP1基因，測序后經(jīng)基因分型，該毒株屬于CPV-2 a型。利用基因免疫制備單克隆抗體的方法，構(gòu)建了該毒株VP1基因的基因疫苗，獲得了3株具有不同抗原表位及CPV中和活性的單克隆抗體，為CPV在臨床診斷及治療方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌JM109 、真核表達載體pcDNA3、貓腎F81傳代細胞和SP2/0骨髓瘤細胞由本實驗室保存。 BALB/c小鼠，購自昆明醫(yī)學院實驗動物中心。病料取自昆明某基地死亡犬腸內(nèi)容物。病毒RNA/DNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、DNA分子量標準，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒，購自上海華舜試劑有限公司；引物合成、純化及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物的合成 合成1對擴增CPV VP1全基因的引物，上游引物中含BamH I限制位點，下游引物中含NotI限制位點，用ddH2O按20 pmol/μL稀釋，-20 ℃凍存。引物序列如下：

P15′-CGGGATCCATGCTTGTGCCTCCAGGTT-3′；

P25′-GTGCGGCCGCATTTTCTAGGTGCTAGT-3′。

1.3 犬細小病毒的分離 取病犬腸內(nèi)容物，以PBS作10倍稀釋后，10 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm膜除菌后接種剛傳代的F81細胞，37 ℃吸附1 h后，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)4-5 d，每天觀察有無細胞病變。出現(xiàn)細胞病變的，待有70%左右的細胞出現(xiàn)病變時進行收毒。

1.4 CPV VP1基因的克隆及序列分析 用試劑盒抽提CPV總DNA，配制PCR反應(yīng)體系50 μL：模板CPV DNA 2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，無菌蒸餾水31.5 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃ 3 min，(96 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。電泳回收VP1蛋白基因片段并與用BamH I和NotⅠ雙酶切后回收的pcDNA3載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，應(yīng)用DNAMAN軟件進行序列分析。

1.5 細胞融合及陽性雜交瘤細胞的篩選 選擇8～12周齡BALB/c小鼠，每只鼠兩后肢脛前肌各注射50 μL乳化好的基因疫苗，兩周后同樣劑量加強免疫，融合前10 d最后1次免疫。第1次免疫后第3周和第5周分別采血，測定抗體水平。將免疫鼠的脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞的(SP2/0)融合并將融合細胞加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔50 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用1∶100稀釋的CPV為抗原，1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗，經(jīng)間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞并進行3～4次克隆純化。

1.6 腹水的制備 將0.5 mL高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，1周后注入1×106個雜交瘤細胞于小鼠腹腔。7～10 d后當小鼠腹部極度膨脹時，抽取腹水，1 500 r/min離心10 min，取上清，加等體積的滅菌甘油，混勻，放-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 雜交瘤細胞上清與腹水效價的測定 將雜交瘤細胞上清用PBS分別從4倍至256倍做2倍稀釋，正常SP2/0細胞培養(yǎng)上清作陰性對照；制備的腹水用PBS從6.4×102至2.048×104做2倍稀釋，正常小鼠腹水作陰性對照，分別做間接ELISA檢測，每個細胞株、腹水2孔重復(fù)，取其平均OD值，OD值超過陰性對照1倍即判為陽性，其最大稀釋度為抗體效價。

1.8 單克隆抗體特異性鑒定 用犬細小病毒、犬瘟熱病毒、貓細小病毒、流感病毒、犬腺病毒以及F81細胞上清分別包被酶標板，加入1∶2 000稀釋的腹水，進行間接ELISA，檢測制備的單抗的特異性。

1.9 單克隆抗體體外中和試驗 用營養(yǎng)液將CPV的細胞培養(yǎng)物稀釋成200 TCID50/0.1 mL，將各單抗分別用營養(yǎng)液從64倍至2 056倍做2倍稀釋，取每個稀釋度的腹水0.1 mL加入0.1 mL病毒液，37 ℃置1 h，然后同步接種Vero細胞，每稀釋度重復(fù)4孔，于37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長情況。同時設(shè)立病毒、陽性血清、陰性血清(正常BALB/c小鼠血清)、腹水和營養(yǎng)液對照。

2 結(jié)果

2.1 VP1基因擴增 經(jīng)PCR擴增得到大小約為2 200 bp的片段，與預(yù)期值相符，見圖1。

圖1 細小病毒VP1基因PCR擴增

M:Marker DL-2 000 ; 1. 陽性對照 ； 2. 樣品DNA PCR產(chǎn)物

2.2 pcDNA3-VP1重組質(zhì)粒的鑒定 獲得的重組質(zhì)粒用PCR方法和BamHⅠ及NotⅠ雙酶切鑒定，PCR結(jié)果為陽性，酶切結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有2.2 Kb的片段，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定

M: Marker DL-15 000 ； 1: 重組質(zhì)粒PCR鑒定 ；2: 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 VP1基因序列測定及分析 基因測序結(jié)果與標準菌株BR8155-00(CPV-2 a型)株的VP1全基因序列和氨基酸序列相比較，核苷酸同源性為99.47%，氨基酸的同源性為99.17%。在第72、185、412、532、579位及669位的氨基酸發(fā)生突變。CPV-2 a 型和CPV-2 b型只有569位氨基酸不同，569為D是CPV-2 b型特有的，569N為CPV-2 a型。本試驗所測的毒株的569位的氨基酸為N，表明該毒株為CPV-2 a型。重組質(zhì)粒pcDNA3-VP1即為構(gòu)建的基因疫苗。

2.4 陽性雜交瘤細胞的篩選 選擇兩只抗體較高的小鼠脾淋巴細胞進行細胞融合，以CPV為抗原，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗，經(jīng)間接ELISA法篩選得到3株陽性雜交瘤細胞并進行3～4次克隆純化。

2.5 雜交瘤細胞上清與腹水效價的測定 通過細胞融合，獲得3株穩(wěn)定分泌抗犬細小病毒VP1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，用間接ELISA方法測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水，上清效價為1∶16、1∶32 和1∶32；腹水效價為1∶25 600、1∶51 200和 1∶51 200。見表1。

2.6 單克隆抗體的特異性鑒定 3株單抗與CPV和FPV發(fā)生反應(yīng)，均不與CDV、CAV和AIV發(fā)生反應(yīng)。見表2。

表1 雜交瘤細胞株上清效價測定

表2 單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果

+: 陽性; -: 陰性

2.7 單克隆抗體的中和試驗 經(jīng)病毒中和試驗，3株單抗中，CPV～VP1-2和CPV～VP1-3兩株單抗對病毒有較強的中和能力，腹水的中和效價均為1∶256，而CPV～VP1-1株單抗腹水的中和效價小于1∶128。

3 結(jié)論與討論

基因疫苗由病原的保護性抗原基因及載體質(zhì)粒兩部分組成。應(yīng)用基因疫苗制備單抗為免疫學研究及疾病治療提供了一個全新的方法。人們可以根據(jù)需要，將針對任何抗原表位的基因克隆到真核表達載體中，免疫小鼠制備所需的抗體。對那些難以制備和純化的抗原以及在純化過程中其結(jié)構(gòu)易被破壞的抗原來說尤為適用。對于一些烈性傳染病，應(yīng)用基因疫苗制備單抗，比直接用病原體作抗原要安全得多。到目前為止，已有基因免疫制備單抗的報道。Barry等以人生長激素的基因疫苗免疫BALB/c小鼠，一次融合，即克隆篩選到20株抗hGH的單抗，這是最早以基因疫苗制備單抗的報道，

從而首次證明了基因免疫制備單抗的可行性。Schmolke等以人乙型肝炎病毒E2糖蛋白基因疫苗研制出8株抗乙肝病毒的單抗，用于鑒定其病毒粒子，這為基因疫苗及其單抗的研制提供了強有力的技術(shù)支持。

為了深入研究 CPV-2 的起源、病原特性、致病機理以及診斷和防治措施，國內(nèi)外學者開展了CPV-2 單克隆抗體的研究工作，用于CPV-2 濃縮與純化、起源與抗原變異、抗原結(jié)構(gòu)分析、抗CPV-2單抗S獨特型抗體的研究以及用于CPV-2 抗體和抗原的檢測[11]。王凈等用CPV-2 a 型分離株制備了4 株單抗且與狂犬病病毒、犬瘟熱病毒無交叉反應(yīng)；同時建立了雙抗夾心ELISA 方法，對病毒的最低檢出量為4.375 μg/mL，與美國RB 試劑盒相比，符合率為95%[12]。賀英等以純化的酵母重組表達的犬細小病毒VP2單位獲得4株能穩(wěn)定分泌抗犬細小病毒CPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，這些單抗僅與CPV及其VP2發(fā)生特異性反應(yīng)，而與CDV和CAV-1及CAV-2沒有交叉反應(yīng)，其中2株屬于IgG2b亞類，2株屬于IgG1亞類[13]。劉潔等用F81培養(yǎng)的CPV經(jīng)滅活、純化后制備單抗，獲得2 株分泌抗CPV 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，Ig亞類均為IgG1[14]。

本研究通過基因疫苗免疫制備單抗的方法制備了CPV的單抗，省去了復(fù)雜的抗原制備過程，但是由于基因疫苗的免疫效果沒有純化的病毒粒子及純化的蛋白質(zhì)的免疫效果好，使得免疫小鼠以及雜交瘤細胞上清和腹水的效價都不夠高，因此該方法制備的單抗一般中和效價也不高，不適合用于細小病毒感染的治療，但有可能篩選到特異性較好的單抗，適用于建立細小病毒快速診斷方法，為CPV的快速診斷方法的建立及改進奠定基礎(chǔ)。

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