岳 鋒 ， 楊 健 ， 周娟娟 ， 朱艷平 ， 李 鵬 ， 孫國(guó)鵬 ， 張艷芳 ， 王選年

(新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)研究中心 ， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

程序性死亡因子-1(Programmed Death-1，PD-1)屬于CD28超家族成員，是50 kDa～55 kDa左右的Ⅰ型跨膜蛋白分子，誘導(dǎo)表達(dá)于活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[1]。PD-1有PD-L1和PD-L2兩個(gè)配體。PD-L1廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞[2]。PD-L2則誘導(dǎo)性表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓源性肥大細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞[3]。PD-1/PD-L是重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)通路，PD-1所介導(dǎo)的負(fù)協(xié)同刺激信號(hào)能導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞的凋亡和功能耗竭[4]。PD-1/PD-L抑制途徑在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展以及慢性病毒感染中均發(fā)揮了重要作用[5-6]。采用抗體阻斷PD-1/PD-L通路可有效提高抗慢性病毒感染或腫瘤性疾病的免疫力[7-8]。因此,制備抗豬PD-1單克隆抗體具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白由本實(shí)驗(yàn)室純化保存，鼠NS0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存；BALB/c小鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 抗豬PD-1單抗的制備

1.2.1 免疫和細(xì)胞融合 重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白與弗氏佐劑乳化即為免疫原。頸背部皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠，50 μg/只，首免用弗氏完全佐劑，次免用弗氏不完全佐劑，每次間隔14 d，融合前3 d，加強(qiáng)免疫。融合前1 d制備飼養(yǎng)細(xì)胞。用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)融合免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和NS0細(xì)胞，融合好放置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆 融合細(xì)胞培養(yǎng)10 d吸取少量上清用于篩選；14 d陽(yáng)性孔半量更換HT培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)，準(zhǔn)備克隆化，間接ELISA法篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液，對(duì)篩選的特異性較強(qiáng)的陽(yáng)性孔轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)克隆化。直至所有克隆孔陽(yáng)性率為100%時(shí)，定雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.3 腹水的制備和純化 將8周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟致敏。7 d后腹腔注射5×106的雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水。IgG類單克隆抗體純化試劑盒純化單抗。

1.3 抗豬PD-1 單抗特異性鑒定 間接ELISA和 Western-Blot檢測(cè)單克隆抗體的特異性，酶標(biāo)儀讀取ELISAOD450值，Western-Blot結(jié)果顯色后拍照記錄。

1.4 單抗生物學(xué)特性鑒定

1.4.1 單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè) 雜交瘤細(xì)胞上清以2倍倍比梯度稀釋，重組PD-1胞外區(qū)蛋白包板，間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤上清和腹水效價(jià)，未免疫鼠血清為陰性對(duì)照，各孔OD450值以P/N>2.1為陽(yáng)性。

1.4.2 單克隆抗體亞型鑒定 用Ig亞類鑒定試劑盒鑒定上述單克隆抗體的Ig亞類，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.3 雜交瘤細(xì)胞株分泌單抗的穩(wěn)定性鑒定 分別收集體外連續(xù)傳代的雜交瘤細(xì)胞株上清，用間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，并凍存細(xì)胞，1個(gè)月后復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，檢測(cè)其培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià)，檢測(cè)3次，每次間隔1個(gè)月，評(píng)價(jià)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.4.4 單抗與豬外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上PD-1蛋白的結(jié)合 前腔靜脈采集豬抗凝血5 mL，密度梯度離心法分離PBMC細(xì)胞， 取106個(gè)PBMC加入終濃度10 μg/mL抗PD-1的單克隆抗體，鼠IgG1為同型抗體對(duì)照，37 ℃作用1 h，用PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500倍稀釋)，37 ℃避光作用 1 h，用PBS洗滌3次，PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清效價(jià) 首免后3只小鼠的血清抗體效價(jià)分別為3.2×103、3.2×103和6.4×103；三免后分別為2.56×104、2.56×104和5.12×104。

2.2 單抗特異性鑒定

2.2.1 間接ELISA 鑒定 經(jīng)3次亞克隆，獲得1 株分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞株命名為2B5，分泌單抗為swPD1-2B5。該單抗能與重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白反應(yīng)，不與雞PD-1、Rosetta上清和pET-32a空載體蛋白反應(yīng)，說(shuō)明單抗具有良好的特異性。

2.2.2 Western-Blot 鑒定 Western-Blot 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，單抗swPD1-2B5與豬PD-1胞外區(qū)蛋白(分子量為33 kDa)發(fā)生特異性反應(yīng)條帶，但不與對(duì)照組Rosetta上清與pET-32a(+)空載體蛋白反應(yīng)。

圖1 Western-Blot鑒定結(jié)果

M: 蛋白Marker； 1： 豬PD-1胞外區(qū)蛋白； 2： Rosetta上清，3： pET-32a(+)空載體蛋白

2.3 單抗生物學(xué)特性鑒定

2.3.1 單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè) 雜交瘤細(xì)胞上清的效價(jià)為1∶212(2B5)；腹水的效價(jià)為1∶2.048×105(2B5)。

2.3.2 單抗Ig亞類及穩(wěn)定性鑒定 單抗swPD1-2B5亞型為IgG1。連續(xù)3個(gè)月復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，間接ELISA檢測(cè)上清效價(jià)均達(dá)到1∶1×212以上。

2.3.3 單抗與豬PBMC上PD-1蛋白的結(jié)合情況 豬PBMC細(xì)胞膜上表達(dá)PD-1蛋白，用豬PBMC細(xì)胞為試驗(yàn)材料，檢測(cè)單抗與PD-1天然蛋白的結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，單抗的熒光強(qiáng)度比同型抗體對(duì)照的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖2)，表明單抗swPD1-2B5可以與豬PBMC上的PD-1蛋白結(jié)合。

圖2 單抗與豬PBMC上PD-1 的結(jié)合

3 討論

PD-1/PD-L信號(hào)通路對(duì)獲得性免疫應(yīng)答起負(fù)調(diào)控作用，該種調(diào)控對(duì)機(jī)體自身而言是為了避免過(guò)度免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體組織的損傷，是一種自我保護(hù)機(jī)制，但在病毒慢性持續(xù)性感染過(guò)程中，PD-1/PD-L通路活化導(dǎo)致機(jī)體免疫功能損傷[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型感染，可以引起豬PD-1/PD-L通路活化，是導(dǎo)致機(jī)體免疫功能損傷的致病機(jī)制之一[9-10]，抗PD-1或PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L通路可以恢復(fù)機(jī)體的免疫功能，在相關(guān)性疾病治療中具有重要意義[4-7]。因此，制備抗豬PD-1單抗對(duì)檢測(cè)PD-1/PD-L通路活化和阻斷PD-1/PD-L具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)運(yùn)用常規(guī)的ELISA抗體篩選方法，以誘導(dǎo)表達(dá)純化的豬PD-1胞外區(qū)蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生針對(duì)靶分子的特異性免疫應(yīng)答。運(yùn)用ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出陽(yáng)性上清液的生長(zhǎng)孔內(nèi)常會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)以上的雜交瘤細(xì)胞克隆，有的克隆細(xì)胞分泌的不是目標(biāo)抗體，有的可能不分泌抗體，因此，要利用克隆培養(yǎng)方法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選出來(lái)。最常用的雜交瘤克隆培養(yǎng)法是有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法。檢測(cè)該單抗與豬天然PD-1蛋白結(jié)合與否對(duì)其應(yīng)用價(jià)值至關(guān)重要，由于PD-1蛋白主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[1]，因此可以用豬PBMC細(xì)胞來(lái)檢測(cè)該單抗與豬天然PD-1蛋白的結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，篩選單抗可以與豬PBMC上的PD-1蛋白有效結(jié)合。因此本研究獲得的單抗swPD1-2B5對(duì)研究豬體內(nèi)某些組織細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平變化與疾病的進(jìn)程關(guān)系具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

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