陳碩，蔣電明，何彬，周敖

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

論著

新型自組裝肽納米纖維支架材料的生物安全性評價*

陳碩，蔣電明，何彬，周敖

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

目的評價新型自組裝肽納米纖維水凝膠支架材料D-RADA16的生物相容性及安全性，為該材料的臨床推廣應用提供試驗依據(jù)。方法根據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學評價標準》，選取體外細胞毒性試驗、全身急性毒性試驗、皮內刺激試驗、溶血試驗、熱源試驗、微核試驗評價D-RADA16的生物相容性。結果細胞毒性試驗中，材料共培養(yǎng)組相對增殖率均＞90％，細胞毒性為1級，材料無細胞毒性。溶血試驗結果顯示，生物材料D-RADA16的溶血率為0.96％，符合＜5％的國家標準。各組小鼠活動正常，7d內無小鼠死亡，各組動物未見中毒癥狀或不良反應，7 d后各組小鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。7 d后處死動物，肝、脾、腎大體觀察和蘇木精-伊紅染色法染色未見異常。熱原試驗顯示，3只動物體溫升高，最高0.5℃，升高總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標準。皮內刺激試驗顯示，兔各時間點注射肽溶液后原發(fā)性刺激指數(shù)均為0分。遺傳毒性試驗顯示，各實驗組與陰性對照組微核數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），各實驗組與陽性對照組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），材料未見明顯致突變性。結論新型納米生物支架材料D-RADA16無細胞毒性、溶血作用、急性毒性、致熱原性、皮膚刺激性、遺傳毒性，具有良好的生物安全性和生物相容性，為材料進一步的細胞生物學研究及臨床應用提供理論依據(jù)。

自組裝肽；右旋氨基酸；細胞毒性；生物安全性

自組裝肽（self-assembling peptide，SAP）是一種新型的生物支架材料。1995年ZHANG等[1]首次報道，SAP EAK16-Ⅱ（AEAEAKAKAEAEAKAK），此后各種新型SAP被陸續(xù)開發(fā)出來并廣泛應用于組織工程。目前應用較為廣泛的SAP大部分是由L型氨基酸構成，很容易被體內的蛋白酶降解，不能持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)揮生物學活性作用，限制其應用范圍[2]。為提高SAP在體內的穩(wěn)定性，研究人員開展大量的工作，而采用D型氨基酸來構建SAP是一種很好的解決方案[3]。為此，筆者設計并合成一種新型SAP：D-RADA 16（其氨基酸序列為：AcN-RADARADARADARADA -CONH2），僅由D型氨基酸構成。筆者推測D-RA DA16具有更好地生物學穩(wěn)定性，特別適用于在體內需要長時間發(fā)揮生物學效應的領域，如藥物的控制釋放、神經(jīng)修復及誘導成骨等。

然而，生物材料在與人體直接接觸或植入人體內時都可能存在一定的風險性；其次，生物材料可能被機體吸收，長期植入活體內可能發(fā)生明顯的生物降解；再次，生物材料與人體長時間接觸，在其緩慢的降解過程中也有可能釋放毒性物質。因此，一種生物材料應用于臨床前必須經(jīng)過一系列的生物安全性評價。

本試驗根據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學評價標準》[4]的生物相容性評價標準選取6個試驗，采用體外實驗與動物體內實驗相結合的方法，評價D-RADA16的生物相容性及安全性，為該材料的臨床推廣應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7～8周齡健康昆明小鼠50只，雌雄各半，體質量19～25 g；4周齡SD大鼠1只，體質量約160 g，雄性；6周齡新西蘭大白兔6只，體質量2.1～2.5 kg，雌性；上述動物均由重慶醫(yī)科大學試驗動物中心提供，實驗動物使用合格證:SCXK（渝）2016-0210。

1.1.2 主要材料與儀器自組裝肽D-RADA16（上海波泰生物科技有限公司合成），SB-3200D超聲震蕩清洗儀（寧波新藝超聲設備有限公司），草酸鉀（四川成都科隆化工試劑廠），苯酚（北京化工廠），環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（上海碧云天生物技術有限公司），四唑鹽（美國Sigma公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），TE-2000U倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），Z52型醫(yī)用低速離心機（河北省保定市安新縣白洋離心機廠），高壓滅菌鍋（日本SANYO公司），600型恒溫水箱（金壇市中大儀器廠），移液器（德國Eppendorf公司），全波長酶標儀（芬蘭賽默飛世爾公司），萬分之一天平（日本島津公司），超純水儀（美國Milliore公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 肽母液的制備將肽130 mg溶于52 ml超純水中，配制母液濃度0.25％w/v（2.5 mg/ml），超聲震蕩30 s，4℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 材料浸提液制備使用0.9％無菌氯化鈉注射液作為浸提介質，浸提比例為每1 ml 0.9％氯化鈉注射液中加入0.2 g D-RADA16材料。先取16 ml D-RADA16材料母液，加入少量PBS待其充分形成水凝膠，再加入80 ml 0.9％無菌氯化鈉注射液，使水凝膠材料全部沒入0.9％無菌氯化鈉注射液中，將之放置于有蓋的玻璃瓶中，并轉移到37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中靜置，持續(xù)浸提72 h后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞毒性試驗采用GB/T 16886.5-2011體外細胞毒性試驗標準進行細胞形態(tài)學觀察及四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2, 5-diphenyl-2-h-tetrazolium bromide，MTT]檢測肽溶液對大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的毒性。取鼠齡4周，體質量約160 g的SD大鼠1只，采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，傳3代后消化細胞，得到終濃度為1×104個/ml的細胞懸液。在96孔培養(yǎng)板中，加入100 μl/孔細胞懸液，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察細胞貼壁后，棄培養(yǎng)板內原培養(yǎng)液，分材料共培養(yǎng)組（A組），陰性對照組（B組），陽性對照組（C組）3組，每組設12孔。A組加入50 μl/孔肽溶液和50 μl DMEM/F12培養(yǎng)液，B組每孔加入100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液，C組每孔加入50μl 64g/L的苯酚溶液和50 μl DMEM/F12培養(yǎng)液。將A、B、C組全部放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)2和4 d時取A、B、C組各6孔，加入MTT溶液20 μl/孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)中孵育4 h。4 h后吸去孔內液體，加入DMSO 150 μl，低速搖床反應10 min，用酶標儀于波長490 nm測其光密度（optical density，OD）值，并根據(jù)以下公式計算細胞的相對增殖率（the relative growth rate，RGR）。

PGR（％）=（實驗組平均OD值÷陰性對照組OD值）×100％

細胞毒性標準[5]：分6級評定材料的毒性程度，RGR≥100％為0級；75％～9％為1級；50％～74％為2級；25％～49％為3級；1％～24％為4級；0為5級。

1.2.4 溶血試驗采用GB/T 16886.4-2011推薦溶血試驗法。取1只健康新西蘭大白兔，麻醉后采用含3.2％枸櫞酸鈉抗凝劑的負壓采血管，采用心臟穿刺法獲取兔血5 ml。反復顛倒混勻后，立即取抗凝血4 ml加入0.9％無菌氯化鈉注射液5 ml稀釋，置于37℃、5％CO2、濕度為100％的培養(yǎng)箱中備用。實驗分為實驗組、陰性對照組、陽性對照組3組。實驗組加入浸提液5 ml，陰性對照組加入0.9％無菌氯化鈉注射液5 ml，陽性對照組加入蒸餾水5 ml。全部組別置于37℃恒溫水浴箱中，30 min后加入稀釋兔血0.1 ml。輕搖混勻后繼續(xù)置于37℃水浴箱中，60 min后2 500 r/min離心5 min，吸取上清液移入96孔板中，用酶標儀測定上清液在波長545 nm處的OD值，每組設6個復孔，取平均值計算溶血率。

溶血率（％）=[（實驗組OD值-陰性對照組OD值）÷（陽性對照組OD值-陰性對照組OD值）]× 100％

1.2.5 急性毒性試驗采用GB/T16886.11-2011推薦系統(tǒng)毒性試驗。取20只7～8周齡的昆明小鼠，將其隨機分為實驗組、對照組，每組10只，記錄每只小鼠的初始體質量。實驗組小鼠腹腔注射肽溶液（濃度50 ml/kg），對照組小鼠腹腔注射0.9％無菌氯化鈉注射液（濃度50 ml/kg）。在注射后連續(xù)觀察7 d，每天觀察小鼠的進食、活動等一般情況及毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)量，并記錄注射后1、2和3 d后小鼠的體質量變化。注射后7 d采用10％水合氯醛以10 ml/kg的劑量處死所有小鼠，切開腹腔，觀察各小鼠腹腔內臟器有無腹水、腹腔臟器水腫、臟器粘連或壞死。每組隨機選2只小鼠的肝、脾、腎，切片后分別行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.2.6 熱原試驗采用GB/T 16886.10-2011推薦熱原試驗法。取3只健康新西蘭大白兔，體質量2.1～2.5 kg，雌雄不限。開始正式實驗前7 d預測兔肛溫，1次/h，共4次，體溫38.6～39.4℃，最大溫差≤0.4℃。根據(jù)標準符合實驗要求[6]。在相同環(huán)境下采用相同飼料飼養(yǎng)。7 d后于相同室溫和濕度下開始正式實驗。實驗前禁食2 h，將肛門體溫計插入兔肛門，深度約6 cm，時間約3 min，間隔30 min分別測3次體溫，取其平均值為正常體溫值。經(jīng)耳緣靜脈按10 ml/kg劑量緩慢注入已預熱至37℃的材料浸提液，注射后1、2和3 h測量動物肛溫，以3次肛溫最高值減去正常體溫即為體溫升高度數(shù)。

1.2.7 皮內刺激試驗采用GB/T 16886.10-2011推薦最大劑量耐受法進行皮內刺激試驗。取3只健康新西蘭大白兔，體質量2.1～2.5 kg，雌雄不限。試驗前24h，采用電動剃毛器小心剔除受試兔脊柱兩側各5 cm×30 cm的兔毛，避免造成皮膚損傷。75％乙醇消毒剔除兔毛后的局部皮膚。在受試兔脊柱兩側各選擇5個點，每點間隔2.5 cm，在右側各選取點處皮下注射0.2 ml肽溶液，左側各選取點處皮下注射0.2 ml 0.9％無菌氯化鈉溶液。注射后24、48和72 h注意觀察注射點局部及周圍皮膚有無紅斑和水腫等炎癥反應。根據(jù)皮內刺激評分系統(tǒng)[7]，記錄每只受試兔在所有3個試驗時間點注射肽溶液后出現(xiàn)紅斑和水腫的分數(shù)（皮內刺激反應評分見表1）再將所有得到的原發(fā)性刺激計分相加，用結果除以3，則為SAP水凝膠支架材料的原發(fā)性刺激指數(shù)（primarily stimulation index，PII）。其中0.0～0.4分為無刺激，0.5～1.9分為輕度刺激，2.0～4.9分為中度刺激，5.0～8.0分為強刺激。

表1 皮內刺激評分表

1.2.8 遺傳毒性試驗采用GB/T 16886.3-2011推薦遺傳毒性試驗法（骨髓微核試驗）。取50只健康昆明小鼠，體質量20～25 g，隨機分5組：A、B、C 3個試驗組，D（陽性對照組）和E組（陰性對照組），每組10只，雌雄各半。A、B、C組腹腔注射肽溶液（濃度分別為12.5、25和50 ml/kg），D組腹腔注射環(huán)磷酰胺（濃度60 mg/kg），E組腹腔注射0.9％無菌氯化鈉溶液。采用2次給藥法，2次給藥的時間間隔24 h，于第2次給藥后6h采用10％水合氯醛10ml/kg的劑量處死所有小鼠，取胸骨骨髓涂片，吉姆薩（Giemsa）染色。顯微鏡下觀察每只動物1 000個嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocytes，PCE），計數(shù)含有微核的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），若方差齊，則組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性試驗結果

培養(yǎng)2 d后，實驗組A組和陰性對照組B組細胞幾乎全部貼壁，折光性強，多為梭形和多角形，并見圓形分裂細胞；陽性對照組C組部分細胞未貼壁，成懸浮的死細胞，已貼壁的部分細胞圓縮化（見圖1A～C）。培養(yǎng)4 d，實驗組和陰性對照組細胞形態(tài)正常，生長旺盛，細胞膜完整，胞體呈長梭形，貼壁良好，整體呈漩渦狀改變；陽性對照組細胞數(shù)量減少，大部分殘存細胞胞體變小成圓形，核固縮，貼壁細胞聚集成團，為中毒形態(tài)（見圖1D～F）。各組細胞RGR及細胞毒性分級結果見表2。MTT試驗證實，D-RADA16與大鼠BMSCs共培養(yǎng)2和4d后，細胞RGR均＞90％。依據(jù)醫(yī)療器械生物學評價標準實施指南[8]規(guī)定的標準，D-RADA16的細胞毒性為1級，無細胞毒性。培養(yǎng)2和4 d后，各組OD值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=1 069.745和2 149.382，P= 0.211和0.194）。進一步兩兩比較，培養(yǎng)2和4 d后，試驗組與陰性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.161和-1.215，P=0.273和0.252）；試驗組與陽性對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=41.187和85.792，P=0.000）。各組細胞增殖趨勢見圖1G。

2.2 溶血試驗結果

離心后，實驗組與陰性對照組類似，上層液體無色透明，下層為離心得到的紅細胞沉淀（見圖2）；陽性對照組離心后上層液體呈淡紅色，下層有較少的紅細胞沉淀。試驗組、陰性對照組、陽性對照組OD值分別為（0.053±0.003）、（0.052±0.003）和（0.220± 0.005），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=3376.860，P=0.000）。進一步兩兩比較，試驗組與陰性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.787，P=0.449）；試驗組與陽性對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（t= -67.592，P=0.000）。根據(jù)醫(yī)療器械生物學評價標準實施指南[8]規(guī)定的標準，溶血率＜5％說明受檢材料符合醫(yī)用材料溶血要求，溶血率≥5％提示受檢材料有溶血作用。測得生物材料D-RADA16的溶血率為0.96％，符合＜5％的國家標準。

2.3 急性毒性試驗結果

各組小鼠觀察期內一般情況及進食、進水均正常，未見明顯呼吸困難、驚厥、癱瘓及死亡發(fā)生。實驗組和對照組小鼠體重呈上升趨勢。兩組小鼠24、48和72 h體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.003、0.000和0.177，P=0.957、0.997和0.679）（見表3）。7d后處死動物，切開腹腔發(fā)現(xiàn)無腹水，腹腔臟器無肉眼可見的粘連及壞死征象，主要腹腔臟器（肝、脾、腎）大體觀察和組織切片HE染色未見異常（見圖3）。

圖1 細胞毒性試驗結果

圖2 試驗組、陰性對照組、陽性對照組離心后大體觀察

表2 各組BMSCs增殖活力比較（n=6）

圖3 急性毒性試驗結果

2.4 熱原試驗結果

3只動物注射材料浸提液前，體溫分別是（39.13± 0.17）、（39.30±0.08）和（39.27±0.09）℃，注射材料浸提液后，3個時間點所測最高體溫分別為39.6、39.6和39.7℃，3只動物體溫分別升高為0.5、0.3和0.4℃，均＜0.6℃，升高的總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標準。

2.5 皮內刺激試驗結果

3只新西蘭大白兔在注射肽溶液后24、48和72 h，右側注射點出現(xiàn)的炎癥反應情況與左側各注射點注射0.9％無菌氯化鈉溶液的情況類似，未見明顯刺激反應（見圖4），無明顯紅斑、局部水腫或皮膚異常壞死等情況發(fā)生，24、48和72 h原發(fā)性刺激指數(shù)均為0分。

2.6 遺傳毒性試驗結果

各組小鼠胸骨髓嗜多染紅細胞的微核數(shù)見表4。雌性及雄性組分別行方差分析，雌性各組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=95.750，P=0.000）。進一步用兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，各實驗組（A、B、C組）微核數(shù)分別與陰性對照組（E組）比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.535、0.535和0.001，P=0.713、0.713和1.000）；A、B、C組微核數(shù)分別與陽性對照組（D組）比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-11.159、-11.159和-12.124，P= 0.000）。

雄性各組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 111.667，P=0.000）。進一步用兩兩比較LSD-t檢驗，A、B、C組微核數(shù)分別與E組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.447、1.897和0.632，P=0.672、0.211和0.672）；A、B、C組微核數(shù)分別與D組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-12.333、-13.510和-14.241，P=0.000）。

表3 兩組不同時間點材料對動物體質量的影響（n=10，g，x±s）

圖4 不同時間新西蘭大白兔注射局部及周圍皮膚組織反應

表4 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果（n=5，個，x±s）

3 討論

作為一種新型納米生物支架材料，SAP可在陽離子存在的水溶液中形成宏觀的水凝膠，以及微觀的納米纖維結構，納米纖維進一步形成三維網(wǎng)狀支架結構[1]。原子力顯微鏡和掃描電鏡顯示，其孔徑約為5～200 nm，其纖維直徑約為10 nm，作為細胞培養(yǎng)的支架，可實現(xiàn)真正意義上的三維培養(yǎng)要求[3]。此后，SAP作為一種具有極佳應用前景的納米纖維支架材料，逐步被應用于再生醫(yī)學和組織工程的各個領域，如骨修復、軟骨修復、神經(jīng)修復、心臟修復、創(chuàng)傷愈合、成血管、快速止血等等[9-13]。但一直以來，研究人員更傾向于使用L型即左旋氨基酸設計左旋自組裝肽構建納米纖維支架，用于組織工程的三維微環(huán)境構建[14]。然而，D型即右旋氨基酸構成的肽鏈及蛋白質更加穩(wěn)定，因為蛋白酶可以降解L型肽鏈，但不能降解D型肽鏈[14-15]。

SAP在水溶液中可吸收大量水分凝膠化，從而使水分充斥于納米纖維的三維網(wǎng)狀結構中，較大程度地伸展被交聯(lián)的大分子肽鏈，使整個材料形成含水量極高（＞99％）的水凝膠結構，這與充盈大量液體的機體組織及其相似。水凝膠材料柔軟、濕潤的表面，以及與組織的親和性大大減少材料對于機體的刺激性。因此，一般認為SAP材料具有良好的生物相容性。

然而，任何一種生物材料在獲準臨床應用之前，首先應該具備使用的安全性和良好的生物相容性，而體內外實驗是目前評價材料生物安全性的主要手段[16]。作為一種新型材料，D-RADA16的安全性尚不明確。顯而易見，D-RADA16的降解產(chǎn)物是D型氨基酸。目前已知一些D型氨基酸對細胞的生長有毒性和抑制作用，如D-丙氨酸和D-天冬氨酸[17]。為確保新型生物材料D-RADA16在臨床應用時的安全性，必須進行生物學評價試驗，以便提供進一步有關安全性的數(shù)據(jù)和資料。

醫(yī)療器械生物學評價系列標準（即GB/T16886/ IS010993）是醫(yī)療器械安全性評價兩大基礎標準之一，對于保證醫(yī)療器械安全性發(fā)揮重要作用。為保證本研究的規(guī)范性、時效性及結果的準確性，筆者依據(jù)最新版本GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學評價標準》規(guī)定和推薦的評價生物材料生物安全性的主要體內外實驗方法，選擇細胞毒性試驗、溶血試驗、急性毒性試驗、熱原試驗、皮內刺激試驗、微核試驗對D-RADA16的生物安全性和生物相容性進行全面評價。

細胞毒性試驗采用體外細胞培養(yǎng)技術，測定由材料導致的細胞溶解或死亡，以及對細胞生長的抑制和其他影響。該試驗屬體外試驗，能在短期內檢出材料對細胞新陳代謝的影響，對毒性物質具有較高的敏感性，同時可直接觀察到細胞在材料表面的粘附情況及界面反應，可為材料的細胞相容性提供最直觀的證據(jù)[18]，從而能快速篩選材料，是所有生物學試驗中首選的項目。本研究通過倒置相差顯微鏡觀察到D-RADA16水凝膠支架材料與BMSCs共培養(yǎng)2和4 d后，細胞生長旺盛，形態(tài)正常，整體呈漩渦狀改變。MTT試驗進一步證實其細胞RGR均＞90％，根據(jù)《醫(yī)療器械生物學評價標準》，生物材料D-RADA16對大鼠BMSCs的細胞毒性為1級，說明該材料無細胞毒性。

溶血試驗評價血液接觸材料后的相互作用，被認為是細胞毒性評價的一個補充實驗，同時也是醫(yī)療器械生物學安全性測評中最為常用的實驗。本研究中實驗組及陰性對照組涂片鏡檢均未見紅細胞破裂或凝聚。酶標儀檢測OD值后計算出D-RADA16的溶血率為0.96％，符合溶血率＜5％的國家標準，說明D-RADA16材料溶血性符合安全標準，無溶血作用。

急性全身毒性試驗是體內試驗之一，根據(jù)材料與人體的接觸途徑，將材料在24 h以內通過靜脈注射、口服、腹腔注射或吸入、皮膚接觸等途徑作用于受試動物體內，觀察動物的全身反應，從而評價醫(yī)療器械是否釋放毒性物質。其優(yōu)點包括程序簡單，成本低，用時省，廣泛適用于短期或長期應用于體內的器械。本研究中結果顯示實驗組與對照組比較，小鼠一般狀況良好，體質量正常增加。7 d后處死動物，大體觀察和組織切片HE染色均未見異常。另外該部分實驗還包括熱原試驗，檢測材料的致熱反應。其方法是將一定量的材料浸提液經(jīng)靜脈途徑注入動物體內，在規(guī)定時間點監(jiān)測動物體溫變化，以確定浸提液中的熱原量是否符合要求。本試驗中各觀察時間點兔體溫升高均＜0.6℃，升高的總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標準，說明材料D-RADA16對受試動物無致熱作用。

皮內刺激試驗屬體內試驗，方法相對比較成熟，敏感性較高，因此為各類醫(yī)用材料及器械必須評價的項目之一。試驗結果顯示實驗組與對照組各時相點注射后反應情況相似，未見皮膚刺激反應，說明材料D-RADA16無刺激性。

本課題組選用GB/T 16886.5-2011/ISO 10993-5:2009標準中推薦的短期遺傳毒性試驗做初步篩選，如果短期試驗陰性可暫不進行致癌試驗。小鼠骨髓嗜多染紅細胞核試驗是目前應用最為廣泛的微核試驗。在眾多的致突變初篩試驗中，該試驗經(jīng)濟、簡單、快速，尤適用于檢驗材料可浸出成分的潛在致突變性[19]。實驗結果顯示，各實驗組小鼠骨髓微核試驗陰性，表明材料D-RADA16不具有致染色體畸變作用。

綜上所述，依據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1:2009《醫(yī)療器械生物學評價標準》最新版本所規(guī)定和推薦的體內外實驗方法，選擇細胞毒性試驗、溶血試驗、急性毒性試驗、熱原試驗、皮內刺激試驗、遺傳毒性試驗對D-RADA16的生物安全性和生物相容性進行全面評價，得到如下結論：新型SAP納米纖維水凝膠支架材料D-RADA16無細胞毒性、溶血作用、急性毒性、致熱原性、皮膚刺激性、遺傳毒性，具有良好的生物安全性和生物相容性，具有廣闊的臨床應用前景。本研究為材料D-RADA16下一步的細胞生物學研究及臨床應用提供理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Biological safety of designer self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffolds*

Shuo Chen,Dian-ming Jiang,Bin He,Ao Zhou (Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo evaluate the biological safety of designer self-assembling peptide(SAP)nanofiber hydrogel scaffolds D-RADA16,so as to provide experimental evidence for the clinical application of the material.MethodsAccording to Biological Evaluation of Medical Devices(GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1: 2009),physiological saline lixivium of the biomaterial or the hydrogel biomaterial was used for in vitro cytotoxicity test,hemolysis test,acute toxicity test,pyrogen test,intradermal irritation test,and micronucleus test to evaluate the biocompatibility of the material.ResultsIn the cytotoxicity test,the relative growth rate of the experimental group was above 90％,and the toxicity of D-RADA16 was graded 1,indicating no cytotoxicity. The hemolysis rate of the lixivium was 0.96％,which was lower than the national standard(＜5％).The activity of mice was normal in the acute toxicity test.No animal died and no toxicity symptom or adverse effect was shown within 7 d.The increase of average daily weight showed no statistically significant difference between the experimental group and the control group after 7 d(P＞0.05).The mice were sacrificed after 7 d,and no abnormal changes were observed in general observation and HE staining of the liver,spleen or kidneys.Themaximum increase of the body temperature in the experimental group was 0.5℃,and the total increase of body temperature of the three experimental animals was 1.2℃,which met the national standard in the pyrogen test(＜1.4℃).Intradermal irritation test showed that the primary irritation index was 0 at every defined time point.In the micronucleus test,the results showed that there was no statistically significant difference at micronucleus number between the experimental groups and the negative control group(P＞0.05),and there were statistically significant differences between the experimental groups and the positive control group(P＜0.01). Therefore,potential mutagenicity was not observed in the micronucleus test.ConclusionsDesigner SAP hydrogel scaffolds D-RADA16 does not have cytotoxicity,hemolytic effect,acute toxicity,pyrogenicity,skin irritation or genetic toxicity.It has good biological safety and biocompatibility,therefore exhibits a promising clinical application prospect and provides theoretical basis for further research of cell biology study and clinical application.

self-assembling peptide;D-amino acid;cytotoxicity;biological safety

R318.08

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.004

1005-8982（2017）01-0016-08

2016-04-12

國家自然科學基金（No：81472057）

蔣電明，E-mail：jdm571026@vip.163.com

陳碩，現(xiàn)工作單位為四川省都江堰市人民醫(yī)院骨科