谷三煒，馬寧，趙令，劉濤，姜振宇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林長春130021）

臨床論著

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達及其與臨床特征的關(guān)系*

谷三煒，馬寧，趙令，劉濤，姜振宇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林長春130021）

目的探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FAS配體基因（FAS ligand，F(xiàn)ASLG）mRNA的表達情況，及其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關(guān)系。方法選取2015年1月-2015年12月于吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者47例作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡組，健康者47例作為對照組，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組又分為活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和非活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。觀察各組FAS和FASLGmRNA的表達，以及FAS和FASLGmRNA的表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床特點的關(guān)系。結(jié)果系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組（P＜0.05），活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組（P＜0.05）。FASLGmRNA相對表達量在各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。系統(tǒng)性紅斑狼瘡有發(fā)熱和無發(fā)熱者FASmRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有面部紅斑和無面部紅斑者FAS和FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有皮疹和無皮疹者FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞中FASmRNA水平升高，且與疾病活動期有關(guān)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點與FAS和FASLGmRNA的表達有關(guān)。

FAS基因；FASLG基因；系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起的機體免疫功能紊亂，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的免疫功能紊亂與細(xì)胞凋亡異常關(guān)系密切[1-2]，細(xì)胞凋亡功能紊亂和細(xì)胞凋亡清除異常在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡由多種信號途徑參與調(diào)節(jié)，其中FAS及其配體（FASLG）在細(xì)胞死亡受體途徑中起著重要作用，F(xiàn)AS/FASLG能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和機體自身平衡，當(dāng)FAS或者FASLG基因表達缺陷或者結(jié)構(gòu)異常時，限制其介導(dǎo)的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞凋亡，生成大量抗體，打破免疫耐受，引起自身免疫性疾病的發(fā)生[3-4]。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS/FASLG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生有關(guān)[5-6]，但研究主要集中在FAS/FASLG蛋白水平的檢測。本研究在基因轉(zhuǎn)錄水平探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達，并分析其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月-2015年12月于吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者47例作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡組，同期體檢中心健康體檢的健康者47例作為對照組，根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡組又分為活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和非活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者47例，其中男性45例，女性2例；年齡（33.4±12.3）歲。對照組患者47例，其中男性44例，女性3例；年齡（34.2±11.6）歲。對照組和系統(tǒng)性紅斑狼瘡組年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者簽署知情同意書，無其他全身性疾病，資料完整。

1.2 方法

1.2.1 資料收集收集兩組患者的年齡、性別、既往史、現(xiàn)病史等一般資料，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組收集發(fā)熱、面部紅斑、皮疹、脫發(fā)及關(guān)節(jié)炎等資料。

1.2.2 疾病活動度評分根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性指數(shù)量表進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動度評分，疾病緩解為0～9分，疾病活動為≥10分。

1.2.3 血液采集采集所有研究對象空腹外周血4ml于抗凝管中，在采集的外周血中加入適量的淋巴細(xì)胞分離液，離心，取上層液面和中層液面之間的乳白色單個核細(xì)胞層；采用Trizol法提取外周血單個核細(xì)胞的總RNA，根據(jù)260 nm吸光度計算RNA含量，采用紫外分光光度計檢測提取的單個核細(xì)胞總RNA的純度；根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；配制PCR的總反應(yīng)體系為20 μl，空白對照組加入20 μl超純水，RTQ-PCR檢測FAS/FASLG及內(nèi)參基因GAPDH的擴增情況；數(shù)據(jù)分析時，F(xiàn)AS/FASLG基因的相對定量用2-△Ct表示，△Ct為檢測基因的平均Ct值-內(nèi)參基因的平均Ct值。

1.3 主要觀察指標(biāo)

觀察各組FAS和FASLGmRNA的表達，以及FAS和FASLGmRNA的表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床特點的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，非正態(tài)分布以M（P25，P75）描述，正態(tài)分布用t檢驗，非正態(tài)分布用Mann-whitney秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 提取的外周血白細(xì)胞總RNA

用紫外分光光度計檢測提取的外周血白細(xì)胞總RNA吸光度值，發(fā)現(xiàn)A260/A280在1.8～2.0，RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后見2條清晰條帶，亮度和寬度基本符合2︰1的比例，RNA沒有明顯降解，比較完整。見圖1。

2.2 各組的FASmRNA表達

外周血白細(xì)胞中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者FAS mRNA相對表達量為0.0182（0.0002～0.1879），對照組FASmRNA相對表達量為0.0089（0.0003-0.0874），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.012，P=0.009），系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組；活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量為0.0297（0.0062～0.1154），非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量為0.0131（0.0003～0.0427），經(jīng)mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.276，P=0.043），活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組（見圖2）。表明外周血白細(xì)胞FASmRNA表達量與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其嚴(yán)重程度相關(guān)。

圖1 外周血白細(xì)胞總RNA電泳圖

圖2 各組的FASmRNA表達比較

2.3 各組的FASLGmRNA表達

外周血白細(xì)胞中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者FASLG mRNA相對表達量為0.0019（0.0001～0.0786），對照組FASLGmRNA相對表達量為0.0017（0.003～0.0168），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.201，P=0.342）；活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASLGmRNA相對表達量為0.0020（0.0003-0.0775），非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASLGmRNA相對表達量為0.0013（0.0001～0.0425），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.908，P=0.795）（見圖3）。表明外周血白細(xì)胞FASLGmRNA表達量與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其嚴(yán)重程度無關(guān)。

圖3 各組的FASLG mRNA表達

2.4 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細(xì)胞中FAS mRNA表達及與臨床特點的關(guān)系

外周血白細(xì)胞中，有發(fā)熱和無發(fā)熱患者FASmRNA表達量分別為0.0148（0.0003～0.0357）和0.0271（0.0061～0.1031），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.756，P=0.015），無發(fā)熱組FASmRNA表達量高于有發(fā)熱組；有面部紅斑和無面部紅斑患者FASmRNA表達量分別為0.0272（0.0103～0.1078）和0.0157（0.0005～0.0978），經(jīng)Mannwhitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.426，P=0.037），有面部紅斑患者FASmRNA表達量高于無面部紅斑患者；有脫發(fā)和無脫發(fā)患者FASmRNA表達量分別為0.0243（0.0003～0.1054）和0.0171（0.0047～0.1042），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.029，P=0.563）；有關(guān)節(jié)炎患者和無關(guān)節(jié)炎患者FASmRNA表達量分別為0.0181（0.0003～0.1052）和0.0224（0.0054～0.1143），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.968，P=0.634）；有皮疹和無皮疹患者FASmRNA表達量分別為0.0187（0.0121～0.1213）和0.0214（0.0007～0.1124），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.215，P=0.523）（見圖4）。表明外周血白細(xì)胞中FASmRNA表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者發(fā)熱和面部紅斑相關(guān)。

圖4 FASmRNA表達和臨床特點的關(guān)系

2.5 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細(xì)胞中FASLG mRNA表達及與臨床特點的關(guān)系

外周血白細(xì)胞中，有發(fā)熱和無發(fā)熱患者FASLG mRNA表達量分別為0.0012（0.0001～0.0296）和0.0018（0.0003～0.0374），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.065，P=0.512）；有面部紅斑和無面部紅斑患者FASLGmRNA表達量分別為0.0039（0.0004～0.0323）和0.0011（0.0002～0.0378），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.204，P=0.021），有面部紅斑患者FASLGmRNA表達量高于無面部紅斑患者；有脫發(fā)和無脫發(fā)患者FASLGmRNA表達量分別為0.0018（0.0002～0.0231）和0.0015（0.0001～0.0315），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.783，P=0.748）；有關(guān)節(jié)炎患者和無關(guān)節(jié)炎患者FASLGmRNA表達量分別為0.0014（0.0002～0.0314）和0.0023（0.0006～0.0324），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.879，P=0.623）；有皮疹和無皮疹患者FASLG mRNA表達量分別為0.0034（0.0007～0.0324）和0.0011（0.0001～0.0364），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.026，P=0.025），有皮疹患者FASLGmRNA表達量高于無皮疹患者（見圖5）。表明外周血白細(xì)胞中FASmRNA表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者面部紅斑及皮疹相關(guān)。

圖5 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細(xì)胞中FASLGmRNA表達及與臨床特點的關(guān)系

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機制與機體內(nèi)的自身免疫耐受和免疫平衡被打破有關(guān)[7-8]。細(xì)胞凋亡是指在特定信號的誘導(dǎo)下和特定基因的調(diào)控下，細(xì)胞發(fā)生的主動性死亡，細(xì)胞的凋亡能夠清除體內(nèi)生長異常的細(xì)胞及體內(nèi)老化的細(xì)胞，對機體的組織穩(wěn)態(tài)、免疫耐受及免疫平衡具有一定意義，F(xiàn)AS/FASLG在自身免疫性疾病中介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[9-10]。FAS屬于神經(jīng)生長因子和腫瘤壞死因子受體家族成員之一，具有膜受體特性，胞漿區(qū)有死亡域，死亡域在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[11]。FAS基因由8個內(nèi)含子和9個外顯子組成，位于第10號染色體上，其翻譯的產(chǎn)物sFAS能夠和FASLG結(jié)合，對FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用。FASLG屬于腫瘤壞死因子家族成員之一，F(xiàn)ASLG含有3個內(nèi)含子和5個外顯子，位于第1號染色體上。在機體的病原體或者抗原被清除后，F(xiàn)AS相關(guān)的凋亡清除激活的T細(xì)胞，在FADD、Caspase-8和10的參與下，F(xiàn)AS引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與機體免疫調(diào)節(jié)，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機體內(nèi)淋巴細(xì)胞過度活化和細(xì)胞凋亡的異常產(chǎn)生大量自身抗體及免疫復(fù)合物，引起組織損傷[12-13]。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，F(xiàn)AS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡紊亂，T淋巴細(xì)胞凋亡增加，外周血B細(xì)胞和T細(xì)胞FAS蛋白表達增加；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者淋巴細(xì)胞過度活化，F(xiàn)AS參與的淋巴細(xì)胞的凋亡功能亢進，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的抗原在機體免疫系統(tǒng)中引起自身抗體的產(chǎn)生，使免疫耐受被打破[14]。關(guān)于FAS/FASLG和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)系的研究主要集中在血清FAS/ FASLG表達和FAS/FASLG抗原蛋白水平[15]，關(guān)于FAS/FASLGmRNA和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)系的研究比較少，WU等[16]發(fā)現(xiàn)FASmRNA可能參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程。本研究筆者在基因轉(zhuǎn)錄水平探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達，并分析其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組，活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。FASLG mRNA相對表達量在各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。系統(tǒng)性紅斑狼瘡有發(fā)熱和無發(fā)熱者FASmRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義；有面部紅斑和無面部紅斑者FASmRNA和FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義；有皮疹和無皮疹者FASLG mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞中FASmRNA水平升高，且與疾病活動期有關(guān)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點和FAS和FASLGmRNA的表達有關(guān)。FAS和FASLG結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子相關(guān)因子的相互作用激活NF-κB通路和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時能夠釋放大量炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)FAS在細(xì)胞上表達升高，因此FAS/FASLG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點相關(guān)可能和上述機制有關(guān)。

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（童穎丹 編輯）

Expressions of FASmRNA and FASLGmRNA in patients with systemic lupus erythematosus and their relationships with clinical features*

San-wei Gu,Ning Ma,Ling Zhao,Tao Liu,Zhen-yu Jiang
(Division of Rheumatology,the First Hospital of Jilin University, Changchun,Jilin 130021,China)

ObjectiveTo explore the expressions of FASmRNA and FAS ligand(FASLG)mRNA in patients with systemic lupus erythematosus(SLE),and to analyze their relationships with the clinical features of SLE.MethodsForty-seven patients treated for systemic lupus erythematosus in the Division of Rheumatology of the First Hospital of Jilin University between Jan.2015 and Dec.2015 were selected as SLE group,47 healthy people as control group.The SLE group was further divided into active SLE group and inactive SLE group.The expressions of FASmRNA and FASLGmRNA,as well as the relationships of the expressions of FASmRNA and FASLGmRNA with the clinical characteristics of SLE patients were observed in each group.ResultsThe relative expression of FASmRNA in the SLE group was higher than that of the control group(P＜0.05).The relative expression of FASmRNA in the active SLE group was higher than that in the inactive SLE group(P＜0.05).There was no significant difference in relative expression of FASLGmRNA between any two groups(P＞0.05).The difference of FASmRNA expression had no significant difference between the sys－temic lupus erythematosus patients with fever and those without fever(P＜0.05).The differences in theFAS mRNA and FASLGmRNA expressions were statistically significant between the SLE patients with facial erythema and those without(P＜0.05).The difference of the FASLGmRNA expression was statistically significant between the SLE patients with rash and those without rash(P＜0.05).ConclusionsThe FASmRNA level in the peripheral mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients elevates and is related to disease activity.Part of the clinical features of the patients are correlated to the expressions of FASmRNA and FASLGmRNA.

FASgene;FASLGgene;systemic lupus erythematosus

R593.241

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.011

1005-8982（2017）01-0055-05

2016-05-18

國家自然科學(xué)基金青年基金（No：81401332）

姜振宇，E-mail：buksbbdk@126.com；Tel：13804354389