趙焱，彭翔，黃風(fēng)云

（華中科技大學(xué)附屬武漢市普愛(ài)醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢430032）

臨床論著

MicroRNA-93對(duì)膠質(zhì)瘤癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制研究

趙焱，彭翔，黃風(fēng)云

（華中科技大學(xué)附屬武漢市普愛(ài)醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢430032）

目的探討microRNA-93（miR-93）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其初步機(jī)制研究。方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體2（TGF-βR2）在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)，進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，并進(jìn)行熒光素酶驗(yàn)證，識(shí)別結(jié)腸癌中靶向TGF-βR2 miRNAs。體內(nèi)外分析miRNA介導(dǎo)TGF-βR2表達(dá)下調(diào)對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性的影響。結(jié)果膠質(zhì)瘤中TGF-βR2表達(dá)下降。TGF-βR2是膠質(zhì)瘤高侵襲性的標(biāo)志物。膠質(zhì)瘤中靶向TGF-β R2的主要miRNAs是miR-17-92及其同系物miR-93，其中miR-93的差異最大。miR-93介導(dǎo)TGF-βR2下調(diào)會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力下降。結(jié)論miR-93通過(guò)下調(diào)TGF-βR2表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

膠質(zhì)瘤；侵襲；轉(zhuǎn)移；miR-93；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體2

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)在不同腫瘤階段發(fā)揮的作用也不同，既能發(fā)揮腫瘤抑制作用，也能發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用，具體發(fā)揮哪種功能，可能與腫瘤類型及腫瘤所處階段有關(guān)[1]。microRNA（miRNA）是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要因子，可以通過(guò)誘導(dǎo)翻譯抑制和/或蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA，降解調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程。miR-93屬于miR-17-92miRNA簇的旁系同源miRNA（miR-106b-25），在多種類型腫瘤中表達(dá)下調(diào)，miR-93靶基因包括LASTS2、AICDA、ITGB8、PTEN、VEGFA、TP53INPI及DAB2等[2]，提示miR-93可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，但miR-93在膠質(zhì)瘤中的作用尚不明確。有研究表明，膠質(zhì)瘤中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體2（transforming growth factor receptor 2，TGF-βR2）表達(dá)升高[3]。盡管有多種miRNAs，例如miR-26a、miRNA-18a、miR-18b、miR-218、miR-216b、miR-663、miR-155、miR-205及EBV編碼miRNAs等，參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]，但是尚未證實(shí)其與靶向TGF-βR2表達(dá)有關(guān)。本研究采用miRNA表達(dá)譜分析膠質(zhì)瘤中miRNA表達(dá)特征，并根據(jù)TGF-βR2表達(dá)水平進(jìn)行分層，分析與TGF-βR2相關(guān)的miRNAs，以期為膠質(zhì)瘤治療提供潛在的新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2008年1月-2010年12月在本院神經(jīng)外科就診的膠質(zhì)瘤患者138例，均經(jīng)手術(shù)治療，手術(shù)前未接受放化療及其他治療，經(jīng)病理確診均為膠質(zhì)瘤，取其癌組織標(biāo)本。其中，男性75例，女性63例；年齡32～75歲，平均58歲。所有患者接受定期隨訪，直至死亡或隨訪結(jié)束（截止2013年12月）。評(píng)價(jià)隨訪期為48.2（6～58）個(gè)月?；颊叨ㄆ诮邮苌眢w檢查、超聲檢查，如有必要進(jìn)行CT掃描?？偵嫫谑侵甘中g(shù)至死亡間隔時(shí)間。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)共選擇373-MG、U87-MG、U251和SHG44 4種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和HEB正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞株，該細(xì)胞均采用含10％小牛血清，100 u/ml青鏈霉素的1640培基，在37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞總RNA提取使用美國(guó)Invitrogen公司Trizol試劑盒提取總RNA。稱取100mg膠質(zhì)瘤組織和正常癌旁組織，或1 ml膠質(zhì)瘤細(xì)胞株懸液，常溫下加裂解液1 ml篩網(wǎng)研磨，吸取裂解液后加氯仿混勻。4℃離心后留取上清液約400μl，加入等體積聚合液后混勻倒入內(nèi)套管，經(jīng)2次洗脫液洗脫，4次高速離心交叉進(jìn)行后，將內(nèi)套管移入新的離心管，在膜中央加洗脫液去RNA酶水，靜置、離心后獲得總RNA。分光光度儀檢測(cè)260/280在1.8～2.2。

1.2.3 miRNA表達(dá)譜分析取5μg膠質(zhì)瘤組織總RNA通過(guò)YM-100（Millipore）微離心過(guò)濾柱，得到片段＜300 nt的miRNA，Poly（A）聚合酶在分離到miRNA 3'端加上poly（A）尾巴，再將一寡聚核苷酸標(biāo)記與該poly（A）尾巴連接用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。使用特異性熒光標(biāo)記Cy3標(biāo)記膠質(zhì)瘤RNA樣品。miRNA雜交使用含有25％甲酰胺的100μ16×乙二胺四乙酸磷酸鈉鹽緩沖液（25％甲酰胺，NaCl 0.90 mol/L，Na2HPO4160 mmol/L，乙二胺四乙酸6 mmol/L，pH 6.8），34℃通過(guò)微循環(huán)泵雜交儀器在ParafloTM微流體芯片上雜交過(guò)夜，漂洗甩干后，采用Gene Pixo 4000B（美國(guó)Molecular Devices公司）激光共聚焦掃描儀采集雜交圖像，采用Array-Pro（美國(guó)Media Cybernetics公司）軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換，計(jì)算兩種檢測(cè)信號(hào)的比值和t檢驗(yàn)的P值，分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)位點(diǎn)。采用雙通道m(xù)iRNA芯片，芯片內(nèi)每個(gè)探針雜交布置≥3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中TGF-βR2 mRNA和miR-93表達(dá)qRT-PCR采用北京艾德萊miRNA Real-time PCR Assay kit實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系，美國(guó)ABI-step one PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，檢測(cè)TGF-βR2 mRNA和miR-93的表達(dá)，TGF-βR2mRNA和miR-93的正反向引物。反應(yīng)體系總體積為20μl，其中含有2×miRNA qPCR Mix（With Sybr Green）10μl，F(xiàn)orward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，miRNA 0.5μl，其余用ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃繼續(xù)延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，獲得CT值。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法（immunological histological chemistry，IHC）檢測(cè)TGF-βR2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)將組織蠟塊4μm連續(xù)切片，切片脫蠟至水，在3％過(guò)氧化氫-微波-甲醇中浸泡10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，采用枸椽酸-微波-鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法在10 mmol/L枸櫞酸（pH 6.0）中煮沸5 min，保溫10 min，10％羊血清封閉。即用型PV900試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色劑（購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司），兔抗人TGF-βR2多克隆抗體（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司）。磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，TGF-βR2陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切片作陽(yáng)性對(duì)照。隨機(jī)讀取有代表性的10個(gè)高倍鏡視野觀察陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，采用雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分。①根據(jù)染色程度：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：不著色為0分，＜25％為1分，25％～50％為2分，＞50％為3分。以兩者積分相加為該片得分：0～2分為陰性表達(dá)，3～6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染200 pmol mir-93mimics/scramble mimics或mir-93 inhibitors/scramble inhibitors用300μl無(wú)血清改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液稀釋，同樣將5μl脂質(zhì)體2 000用300μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋混勻，兩種稀釋液室溫靜置5 min。隨后，稀釋后的200 pmol mir-93 mimics/scramble mimics或mir-93 inhibitors/scramble inhibitors和脂質(zhì)體2000混合，總體積為600μl，用移液器輕微吹打混勻，常溫放置1h，使Mimics和脂質(zhì)體有足夠時(shí)間形成復(fù)合物。取300μl Mimics和脂質(zhì)體復(fù)合物加入6孔板中，水平振蕩器上輕微晃動(dòng)培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)4 h，將用含血清和抗生素培基更換掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)分析鑒定。

1.2.7 TGF-βR2 3’UTR和mut-3’UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性分析①TGF-βR2 3’UTR和mut-3’UTR序列設(shè)計(jì)。根據(jù)Targetscan軟件分析結(jié)果，并結(jié)合TGF-βR2 3’UTR與miR-93結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)TGF-βR2 3’UTR的克隆序列。TGF-βR2 3’UTR，PmeⅠ正向引物：5’-CCGGTTTAAACATCG CTCGAGCAGCAGGGAGTGGGTGACAT-3’，反向引物：SgfⅠ：5’-CGCATCGCGGCCGCTGGCTGTGAGA CATGGAGCCGATCCCCTAGGCAATTTACACGC-3’。擴(kuò)增的TGF-βR2 3’UTR序列為ATTGCCTACATT TATCATGGGATCCCCTAGGGTCAAATAAACACTGG TAAGCTTCCCATTTATCCCTACATTGGTCGTTTAAA CGTG，含PmeⅠ和SgfⅠ酶切位點(diǎn)，以及miR-93種子區(qū)與TGF-βR2 3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)構(gòu)建TGF-βR2 3’UTR的突變克?。═GF-βR2 mut-3’UTR），其3’UTR中3’UTR與miR-93種子區(qū)結(jié)合的3’端序列TCAAATAAACACTGGTAAGCTT，突變成ATGCCATAACACTGCGCAAAGC。②TGF-βR2 3’-UTR和TGF-βR2 mut-3’UTR報(bào)告基因載體的設(shè)計(jì)。將TGF-βR2 3’UTR和TGF-βR2 mut-3’UTR克隆到psi-CHECK-2質(zhì)粒海腎熒光素酶（以下簡(jiǎn)稱Renilla）基因下游的PmeⅠ和SgfⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)建psi-CHECK-TGF-βR2-3’UTR質(zhì)粒和psi-CHECKTGF-βR2-mut-3’UT質(zhì)粒。雙熒光素酶報(bào)告基因載體的工作原理是psi-CHECK-2質(zhì)粒帶有螢火蟲(chóng)素酶基因和Renilla基因，miRNA與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合后，導(dǎo)致Renilla基因轉(zhuǎn)錄受阻，Renilla蛋白合成障礙，海腎熒光減弱，作為標(biāo)準(zhǔn)化參照螢火蟲(chóng)熒光素（以下簡(jiǎn)稱Firefly）酶的表達(dá)則不受影響，從而使海腎熒光素酶活性/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性（Renilla/Firefly）比值下降。

1.2.8 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移分析Transwell侵襲小室上室面鋪以細(xì)胞外基質(zhì)膠，小室下室加入500μl完全干細(xì)胞培養(yǎng)基，膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別加入100μl上述各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞懸液，放入37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，取出Transwell小室后，小室下室加入結(jié)晶紫500μl，染色20 min后用自來(lái)水清洗終止，在熒光倒置顯微鏡下觀察和計(jì)算穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)。生存曲線用Kaplan-Meier法繪制，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存率比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-βR2上調(diào)與膠質(zhì)瘤侵襲相關(guān)

2.1.1 TGF-βR2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)采用qRT-PCR檢測(cè)50例膠質(zhì)瘤和癌旁正常組織中TGF-βR2 mRNA的表達(dá)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.278，P=0.000），膠質(zhì)瘤組織中TGF-βR2 mRNA高于相應(yīng)癌旁正常組織（見(jiàn)圖1）。

2.1.2 TGF-βR2蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)TGF-βR2陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒產(chǎn)物，主要定位于細(xì)胞漿，呈彌漫分布。陽(yáng)性表達(dá)染色指數(shù)在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組高于無(wú)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組（見(jiàn)附表和圖2）。其確診時(shí)的年齡比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.609，P=0.612）。經(jīng)Kaplan-Meier生存分析和對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)（Log-rank），結(jié)果表明，TGF-βR2陽(yáng)性表達(dá)組生存率低于陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（見(jiàn)圖3）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)TGF-βR2 mRNA在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)（x±s）

2.1.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TGF-βR2 mRNA和蛋白的表達(dá)TGF-βR2 mRNA和蛋白在4種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)高于正常膠質(zhì)細(xì)胞。TGF-βR2 mRNA和蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯上調(diào)。與轉(zhuǎn)移性和侵襲性較低的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U251和SHG44）相比，侵襲性和轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（373-MG和U87-MG）TGF-βR2 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)（見(jiàn)圖4），結(jié)果表明，TGF-βR2表達(dá)上調(diào)與膠質(zhì)瘤侵襲性相關(guān)。

2.2 miR-93在膠質(zhì)瘤中下調(diào)TGF-βR2的表達(dá)

2.2.1 膠質(zhì)瘤中miR-93表達(dá)與TGF-βR2表達(dá)的關(guān)系miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果表明，與其他兩組標(biāo)本比較，TGF-βR2 mRNA高表達(dá)組miR-93、miR-20a、miR-20b及miR-18a的表達(dá)明顯發(fā)生變化，這4種miRNA都屬于miR-17-92基因簇及其旁系同源miRNA（見(jiàn)圖5）。

2.2.2 TGF-βR2作為miR-93靶基因的信息學(xué)分析本研究采用RNA hybrid和Target Scan對(duì)miR-93靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，miR-93種子序列與TGF-βR2的3’UTR具有互補(bǔ)性（見(jiàn)圖6）。隨后的雙-熒光酶素報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，miR-93+TGF-β R2 wt 3’UTR熒光素酶活性與miR-93+TGF-βR2 mt 3’UTR，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.648，P=0.001），miR-93會(huì)嚴(yán)重減弱TGF-βR2 wt 3’UTR報(bào)告載體的熒光酶素活性，而miR-93對(duì)TGF-βR2 mt 3’UTR突變位點(diǎn)報(bào)告載體的熒光酶素活性無(wú)影響，提示miR-93通過(guò)3’UTR與TGF-βR2結(jié)合直接調(diào)節(jié)TGF-βR2表達(dá)（見(jiàn)圖7）。

附表不同影響因素間TGF-βR2表達(dá)陽(yáng)性率的比較

圖2 TGF-βR2蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2.3 miR-93 mimics/inhibitors轉(zhuǎn)染對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株TGFβR2表達(dá)的影響TGF-βR2在373-MG細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高，而在U251細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低。將miR-93抑制物和模擬物分別轉(zhuǎn)染373-MG和U251細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-βR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平在373-MG細(xì)胞中都有所降低（t=3.447，P= 0.001），而在U251細(xì)胞中升高（t=3.936，P=0.001）（見(jiàn)圖8），表明miR-93在膠質(zhì)瘤中直接抑制TGF-βR2的表達(dá)。

圖3 Kaplan-Meier生存分析TGF-βR2表達(dá)與患者生存期的相關(guān)性

圖4 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TGF-βR2 mRNA和蛋白的表達(dá)（x±s）

圖5 膠質(zhì)瘤miRNA表達(dá)譜差異分析

2.3 miR-93介導(dǎo)TGF-βR2表達(dá)下調(diào)對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性的影響

圖6 miR-93種子序列與TGF-βR2的3’UTR具有互補(bǔ)性

圖7 miR-93對(duì)TGF-βR2 wt 3’UTR和TGF-βR2 mt 3’UTR雙-熒光酶素報(bào)告載體熒光活性的影響

圖8 MiR-93 mimics/inhibitors轉(zhuǎn)染對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株TGF-βR2表達(dá)的影響

細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移分析表明，miR-93模擬物抑制373-MG細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而miR-93抑制物促進(jìn)U251細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究表明，利用siRNA方法敲除TGFβR2表達(dá)，能夠抑制373-MG細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力（見(jiàn)圖9）。本研究結(jié)果提示，miR-93通過(guò)下調(diào)TGF-βR2表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。

圖9 miR-93調(diào)控TGF-βR2表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

3 討論

本研究主要探討miR-93和TGF-βR2在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及其臨床意義。目前研究證實(shí)，TGF-β R2在多種腫瘤發(fā)生中的作用。HAN等[5]研究表明，TGF-βR2在膠質(zhì)瘤中異常高表達(dá)。TGF-βR2表達(dá)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可能通過(guò)多種機(jī)制表達(dá)上調(diào)，如TGF-βR2啟動(dòng)子異常激活[6-7]，以及本文中所研究的miRNA調(diào)控。miR-17-92及其旁系同源基因是目前研究較為廣泛的miRNA基因簇，其在正常發(fā)育中起關(guān)鍵作用，miR-17-92表達(dá)調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病。有研究在臨床樣本中采用全局miRNA表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中沒(méi)有任何一種miRNAs能夠靶向TGF-βR2，與其他研究結(jié)果相似[8-10]。然而，本研究基于該miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)對(duì)膠質(zhì)瘤臨床樣本分類，將膠質(zhì)瘤分為TGF-βR2高表達(dá)、低表達(dá)組及正常對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TGF-β R2相關(guān)的miRNAs基因簇（miR-93、miR-20a、miR-20b及miR-18a）都屬于miR-17-92基因簇及其旁系同源基因。

另有少量研究表明，miR-17-92基因簇及其旁系同源基因在腫瘤細(xì)胞中參與TGF-βR2功能調(diào)控。miR-17-5p和miR-21能夠在HCT116 p53-null人類結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制TGF-βR2[11]。JIANG等[12]也用熒光酶素報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-βR2是miR-20a的靶基因。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-93的某些潛在靶基因可以在多種癌癥中調(diào)控腫瘤形成及癌變過(guò)程[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-βR2是miR-93主要靶點(diǎn)，可以介導(dǎo)膠質(zhì)瘤中的致瘤作用。

本研究采用體內(nèi)外和臨床分析等綜合手段探討miR-93介導(dǎo)TGF-βR2表達(dá)下調(diào)在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，根據(jù)多組臨床數(shù)據(jù)提出假說(shuō)并支持本研究結(jié)論?？傊z質(zhì)瘤中miR-93介導(dǎo)TGF-βR2下調(diào)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。

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（童穎丹 編輯）

TGFβR2 is a major target of miR-93 in glioma motility and invasiveness

Yan Zhao,Xiang Peng,Feng-yun Huang
(Department of Neurosurgery,the Affiliated Puai Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430032,China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-93 on motility and invasiveness of glioma cells and its mechanism.MethodsThe expression of transforming growth factor receptor 2(TGFβR2)in clinical samples was evaluated.A miRNA expression profiling analysis was carried out,which was followed by multi-validations including luciferase reporter assay,and identification of miRNAs targeting TGFβR2 in glioma cells.In vitroandin vivostudies were performed to further investigate the effect of miRNA-mediated TGFβR2 downregulation on glioma cells aggressiveness.Finally,the associated pathway and genes influenced by this miRNA-mediated TGFβR2 down-regulation were explored.ResultsTGFβR2 was down-regulated in more than 50％of the glioma patients.It was an unfavorable prognosis factor contributing to clinical aggressiveness of glioma.A cluster of 4 TGFβR2-associated miRNAs was identified.The main miRNAs targeting TGFβR2 in glioma were miR-17-92 and its homologue miR-93,of which miR-93 was the most significant one.miR-93 mediated down-regulation of TGFβR2 decreased the invasiveness of glioma cells.ConclusionsThe present study reports involvement of miR-93-mediated TGFβR2 down-regulation in glioma aggressiveness,thus giving extended insights into molecular mechanisms underlying cancer aggressiveness.

glioma;metastasis;invasiveness;miR-93;transforming growth factor receptor 2

R739.41

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.013

1005-8982（2017）01-0064-07

2016-05-18

黃風(fēng)云，E-mail：106926899@qq.com