吳超，楊新宇，李璇，周明，肖佩玲

（湖南省人民醫(yī)院血液科，湖南長沙410005）

臨床論著

TRPV5/6通道在急性髓系白血病中的表達(dá)研究

吳超，楊新宇，李璇，周明，肖佩玲

（湖南省人民醫(yī)院血液科，湖南長沙410005）

目的探討瞬時受體電位通道V5（TRPV5）、瞬時受體電位通道V6（TRPV6）在急性髓系白血?。ˋML）中的表達(dá)。方法提取AML患者骨髓細(xì)胞、捐獻(xiàn)者造血干細(xì)胞，以及AML細(xì)胞株的蛋白和總RNA，運(yùn)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及Western blot檢測TRPV5/6基因和蛋白的表達(dá)水平，并分析AML患者臨床指標(biāo)與TRPV5/6表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果初治組、復(fù)發(fā)組、細(xì)胞株組結(jié)果顯示，TRPV5/6的表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而完全緩解組與對照組TRPV5/6的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。AML患者TRPV5/6表達(dá)與骨髓原始細(xì)胞百分比呈正相關(guān)（P＜0.05），而與外周血白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)、性別、年齡及骨髓染色體核型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論TRPV5/6通道在AML中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，有望成為白血病診斷的新型標(biāo)志物，以及預(yù)后評估的分子靶點(diǎn)。

急性髓系白血??；TRPV5/6通道；骨髓細(xì)胞

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組以增殖異常、分化障礙、凋亡受阻為主要特征的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，也是成人白血病中最常見的類型。盡管臨床化療方案的改進(jìn)、新型分子靶向藥物的應(yīng)用，以及造血干細(xì)胞移植的發(fā)展提高白血病的療效，但年齡＜60歲患者的5年生存率僅有30％～40％，老年白血病5年生存率＜10％[1]，同時難治、復(fù)發(fā)、耐藥依然是血液科醫(yī)生目前面臨的難題。因此，研究白血病的發(fā)病機(jī)制，挖掘新的治療靶點(diǎn)，研發(fā)新型的治療藥物成為研究的熱點(diǎn)。瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道影響一些生理和病理過程，最近研究表明，TRP通道誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、異常分化、阻止細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散[2]。而瞬時受體電位通道V（transient receptor potential vanilloid receptor，TRPV）通道是其七大家族之一，同時包括6個亞型。TRPV通道參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、遷移及侵襲等[3]，此外，其表達(dá)的變化也可能抑制細(xì)胞凋亡，從而加速腫瘤的發(fā)展[4]。但是，目前國內(nèi)TRPV5/6通道在AML中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測AML患者骨髓細(xì)胞、AML細(xì)胞株細(xì)胞中TRPV5/6的表達(dá)，從而探討其在白血病中可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月1日-2016年6月30日湖南省人民醫(yī)院血液科住院患者經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、免疫分型、融合基因、基因突變等相關(guān)檢查，符合法、美、英國際分型，明確診斷為急性髓系白血病的臨床骨髓標(biāo)本39例（M3除外），包括初診患者26例，復(fù)發(fā)患者6例，完全緩解患者7例。其中，男性23例，女性16例；年齡25～74歲，中位年齡為48.5歲。選取湘雅三醫(yī)院血液科提供的動員后造血干細(xì)胞骨髓細(xì)胞3例作為對照組。所有患者同意臨床標(biāo)本的收集，以及未接受化療或激素治療，同時均通過了湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。本課題涉及AML的診治及療效評估均參考《威廉姆斯血液病學(xué)》第8版[5]。

1.2 試劑、儀器與設(shè)備

胎牛血清和洛斯維（roswell park memorial institute，RPMI）1640購于美國Gibco公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于美國Sigma公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，兔抗鼠TRPV5、TRPV6單克隆抗體購于英國Abcam公司，放

射免疫沉淀測定（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、電化學(xué)（electro-chemi-luminescence，ECL）超敏發(fā)光液、三氨基甲烷（tris aminomethane tween，TBST）購于美國Thermo公司。紫外線分光光度儀（上海菁華科技儀器有限公司），蛋白電泳儀、蛋白電泳槽、熒光顯微鏡、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀PIKO REAL 96、熒光PCR板（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 單個核細(xì)胞分離按常規(guī)無菌操作行骨髓穿刺術(shù)抽取新鮮骨髓標(biāo)本2 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝的無菌試管中，用Hanks平衡鹽溶液稀釋骨髓懸液1倍，1 500 r/min離心10 min去除上層脂肪細(xì)胞，運(yùn)用骨髓淋巴細(xì)胞分離液獲得單個核細(xì)胞，適量紅細(xì)胞裂解液去除殘余的紅細(xì)胞，Hanks平衡鹽溶液洗滌1次離心后留取沉淀即單個核細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑充分裂解細(xì)胞，直接提取總RNA，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞株培養(yǎng)急性髓系白血病細(xì)胞株（human acute monocytic leukemia cell line，THP1）、Kasumi-1及慢性髓系白血病細(xì)胞株K562培養(yǎng)于10％滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5％二氧化碳CO2濕化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液1次，隔2～3 d細(xì)胞傳代1次，實驗選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測TRPV5/6 mRNA的表達(dá)收集臨床骨髓標(biāo)本提取后的單個核細(xì)胞及細(xì)胞株細(xì)胞，Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單一目的片段從而分析熔解曲線。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算基因的相對表達(dá)量。在美國國立生物技術(shù)信息中心上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計PCR引物，引物序列見表1。

1.3.4 Western blot檢測TRPV5/6的蛋白表達(dá)收集臨床骨髓標(biāo)本提取后的單個核細(xì)胞及細(xì)胞株細(xì)胞，預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液洗滌，按照6孔板每孔細(xì)胞加入200μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，運(yùn)用聚氰基丙烯酸正丁酯法定量后調(diào)整蛋白量為60μg/泳道，10％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)膜、封閉。依據(jù)目的蛋白的分子量，切割聚偏二氟乙烯膜，用TRPV 5/6一抗（1∶10 000）4℃孵育過夜，然后1×TBST洗3次，15 min/次，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠（1∶3 000）二抗孵育1 h，結(jié)束后1×TBST洗膜3次，15 min/次。ECL發(fā)光、顯影。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參。結(jié)果采用Quantily One軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

Sigmaplot 10.0作圖，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以中位數(shù)±四分位數(shù)（x±s）表示，用方差分析或秩和檢驗或H檢驗，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序

2 結(jié)果

2.1 TRPV5/6通道在白血病中的基因表達(dá)水平

TRPV5、TRPV6在白血病中的基因表達(dá)水平，采用方差分析進(jìn)行多組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.841和14.672，P=0.016和0.021）。見圖1和圖2A。

圖1 TRPV5與TRPV6通道在AML及K562中mRNA的相對表達(dá)（x±s）

圖2 AML中TRPV5/6通道m(xù)RNA與蛋白的相對表達(dá)（x±s）

除完全緩解組外，TRPV5、TRPV6基因表達(dá)均上調(diào)，初治組（AML包括MO～M7 8個分型，其中M3除外）、復(fù)發(fā)組、細(xì)胞株組（包括Kasumi-1、THP1，其中K562是慢性髓系白血病細(xì)胞株）表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而完全緩解組中TRPV5、TRPV6的表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.2 TRPV5/6通道在白血病中的蛋白表達(dá)水平

采用方差分析進(jìn)行多組間比較，TRPV5、TRPV6在白血病中的蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 10.624和27.232，P=0.000）。見圖2B和圖3。

表2 TRPV5/6在白血病中基因表達(dá)的方差分析兩兩比較結(jié)果

圖3 TRPV5與TRPV6通道在AML及K562中蛋白的相對表達(dá)

除完全緩解組外，TRPV5、TRPV6蛋白表達(dá)均上調(diào)，初治組（AML包括MO～M78個分型，其中M3除外）、復(fù)發(fā)組、細(xì)胞株組（包括Kasumi-1、THP1，其中K562是慢性髓系白血病細(xì)胞株）表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而完全緩解組中TRPV5、TRPV6的表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.3 AML患者TRPV5/6表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

39例臨床AML患者TRPV5/6表達(dá)水平與骨髓原始幼稚細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與行骨髓形態(tài)學(xué)分析當(dāng)天的外周血白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.4 AML患者TRPV5/6表達(dá)與性別、年齡、骨髓染色體核型的相關(guān)性

AML患者依據(jù)性別及年齡，以60歲為界，劃分為兩組，運(yùn)用秩和檢驗對各組間TRPV5、TRPV6表達(dá)進(jìn)行差異性分析，結(jié)果表明TRPV5/6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。39例AML患者中可供分析的骨髓染色體核型24例。其中預(yù)后良好組9例，包括5例t（15；17）（q31；q22），3例t（8；21）（q22；q22），1例inv（16）；預(yù)后中等組11例，包括2例+8，3例t（11q23），6例正常核型；預(yù)后差組4例，包括2例-5，1例-7，1例復(fù)雜核型（47，XY+?8[2]/46，XY[18]），TRPV5、TRPV6在3組間表達(dá)比較，經(jīng)H檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、6。

表3 AML中TRPV5/6蛋白表達(dá)的方差分析兩兩比較結(jié)果

表4 AML患者TRPV5/6的表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性（％）

表5 不同性別、年齡和骨髓染色體核型患者TRPV5表達(dá)水平的比較（％）

表6 不同性別、年齡和骨髓染色體核型患者TRPV6表達(dá)水平的比較

3 討論

隨著人口老齡化，白血病的發(fā)病率逐年升高，而急性白血?。╝cute leukemia，AL）是涉及多種分子遺傳學(xué)異常的起病急、病程短、預(yù)后差的惡性克隆性疾病。雖然不斷研發(fā)的新型化療藥物的臨床運(yùn)用，以及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展明顯改善其療效和預(yù)后，但是AL的復(fù)發(fā)、難治及耐藥仍是目前研究白血病領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)[6]。

最近的研究表明，TRPV通道是選擇性陽離子通道[7]，同時是各種可興奮細(xì)胞興奮或者恢復(fù)過程中鈣內(nèi)流的重要途徑，與腫瘤息息相關(guān)，在多種實體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如腎癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等[8-11]，并且TRPV通道有可能作為腫瘤藥物治療的潛在靶點(diǎn)。TRPV通道參與機(jī)體許多生理和病理功能，包括鈣離子平衡、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、血管新生甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12-14]。此外，腫瘤細(xì)胞可自身分泌蛋白水解酶或者誘導(dǎo)宿主細(xì)胞來降解蛋白酶，從而改變離子通道（如鈣離子介導(dǎo)的TRPV通道）和細(xì)胞膜受體的功能，導(dǎo)致正常細(xì)胞演變?yōu)榧?xì)胞增生、化生、不典型增生、腫瘤細(xì)胞，最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。越來越多的研究澄清TRPV通道與腫瘤之間的關(guān)聯(lián)，同時其涉及到細(xì)胞的增殖增強(qiáng)、異常分化、凋亡抑制，最后導(dǎo)致無法控制的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。目前已有研究表明，TRPV5/6通道在正常人單個核細(xì)胞存在表達(dá)，同時LEE等[17]研究表明，維生素D3濃度減低可抑制TRPV5/6通道的表達(dá)，從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡，但是關(guān)于AML患者骨髓細(xì)胞及AML細(xì)胞株中的TRPV5/6的表示水平檢測的研究尚未見報道。綜上所述，TRPV5/6通道有望成為白血病診斷的新型標(biāo)志物，以及預(yù)后評估的分子靶點(diǎn)。

臨床診斷白血病依賴于骨髓穿刺術(shù)完善骨髓形態(tài)學(xué)、免疫分型，以及分子遺傳學(xué)等綜合診斷方法，因此骨髓細(xì)胞標(biāo)本易于收集，且39例臨床標(biāo)本均獲得患者的同意。本研究采用qRT-PCR、Western blot檢測臨床AML、AML細(xì)胞株及K562中TRPV5/6的表達(dá)水平。結(jié)果表明，初治組、復(fù)發(fā)組、細(xì)胞株組（AML細(xì)胞株及K562）的表達(dá)均高于對照組。而完全緩解組的表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有待進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。同時K562為慢性髓系白血病細(xì)胞株，其表達(dá)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是否臨床患者慢性髓系白血病骨髓細(xì)胞存在高表達(dá)，有待于本課題組接下來的實驗研究。同時TRPV5/6的表達(dá)與臨床骨髓原始幼稚細(xì)胞百分比呈正相關(guān)。TRPV5/6不僅僅在AML中存在高表達(dá)，并且其高表達(dá)與AML的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。望本研究為將來探索白血病的診療及預(yù)后評估奠定理論基礎(chǔ)，并開辟新的研究思路。

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（童穎丹 編輯）

Expression of transient receptor potential channel 5 and 6 in acute myeloid leukemia

Chao Wu,Xin-yu Yang,Xuan Li,Ming Zhou,Pei-ling Xiao
(Department of Hematology,Hunan Provincial People's Hospital, Changsha,Hunan 410005,China)

ObjectiveTo observe the expressions of transient receptor potential channel TRPV 5 and TRPV6 in acute myeloid leukemia(AML).MethodsThe protein and total RNA were extracted from bone marrow cells of AML patients,hematopoietic stem cells of healthy donors and AML cell lines.Quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blot were used respectively to examine the expression levels of TRPV5 and TRPV 6.The relationships between TRPV 5 and TRPV6 expressions and clinical features of the patients were analyzed.ResultsThe expressions of TRPV5 and TRPV6 in the initial treatment group,the relapse group and the cell line group were significantly higher than that in the control group(P＜0.05).The expressions of TRPV5 and TRPV6 in the complete remission group showed no significant difference from that in the control group(P＞0.05).The expressions of TRPV5 and TRPV6 in the AML patients had positive correlations with the percentage of bone marrow progenitor cells(P＜0.05),but had no obvious correlation with WBC count,hemoglobin,platelet count of peripheral blood,sex,age,or bone marrow chromosome(P＞0.05).ConclusionsTRPV5 and TRPV6 are excessively up-regulated in acute myeloid leukemia and correlated with tumor load of the patients.They could be new markers of prognosis and molecular targets for diagnosis of AML.

acute myeloid leukemia;transient receptor potential channel 5 and 6;bone marrow cell

肖佩玲，E-mail：xiaopl@163.com；Tel：13507431491

R733

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.014

1005-8982（2017）01-0071-06

2016-07-15