甘春芳, 董 新, 劉曉蘭, 龐麗萍, 龐春玲, 黃燕敏, 崔建國

(廣西師范學院 北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點實驗室 化學與材料科學學院，廣西 南寧 530001)

·研究論文·

新型肟基取代豆甾類化合物的合成及其抗腫瘤活性

甘春芳, 董 新, 劉曉蘭, 龐麗萍, 龐春玲, 黃燕敏, 崔建國*

(廣西師范學院 北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點實驗室 化學與材料科學學院，廣西 南寧 530001)

以豆甾醇為原料，通過臭氧化將豆甾醇的C20—C22鍵斷裂，再經(jīng)過官能團轉(zhuǎn)換，合成了22-肟基取代的單肟基化合物(3和9)， 6,22-二肟基取代的雙肟基化合物(13和14)及3,6,22-三肟基化合物(17)，其中涉及4個中間體(5～8)及目標化合物9, 13, 14和17共8個新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。采用MTT法測試了化合物對人胃癌細胞(SGC-7901)、人肝癌細胞(Bel-7404)和人體乳腺癌細胞株(HeLa)的體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，具有22-肟基取代的3-羥基-5-烯結(jié)構(gòu)的豆甾化合物3對受試細胞均有一定活性，IC50分別為34±2 μmol·L-1, 32±1 μmol·L-1和38±3 μmol·L-1。但是進一步在甾核上引入肟基或羥基的其他幾種類型化合物的抗腫瘤活性沒有提高。

豆甾醇; 22-肟甾體化合物; 合成; 抗腫瘤增殖活性; 細胞毒性

甾體激素在維持生命、調(diào)節(jié)機體性能、提高免疫力及促進機體發(fā)育等方面具有不可替代的作用，是人類生命的金鑰匙。對甾核的結(jié)構(gòu)進行改造，如引入不同的官能團，改變甾核的側(cè)鏈，或取代甾核的骨架結(jié)構(gòu)，在甾核中引入一個或多個雜原子都有可能引起其生理活性的變化[1-5]。

某些含氮的甾體化合物被用于癌癥的治療，然而由于其對人體組織具有較高毒性而限制了其應用[6-8]。甾體肟類化合物在臨床上主要用于雌性激素和避孕等方面，一些肟基取代的化合物具有抗癌、抗菌及抗病毒等生理活性，引起了廣大醫(yī)藥研究及化學研究人員的關(guān)注[9-15]。近年來，本課題組[16-20]一直致力于甾體抗腫瘤藥物的研究，研究發(fā)現(xiàn)，當甾體的母核結(jié)構(gòu)為膽甾烷支鏈結(jié)構(gòu)，甾核的3,6-位被羥基或肟基取代時，某些化合物具有較好的細胞毒性。

為了尋找高效、低毒的甾體類抗腫瘤化合物，本文設(shè)計并合成了4個不同系列的22-肟基取代豆甾化合物。即以豆甾醇為原料，通過臭氧化將豆甾醇的C20—C22鍵斷裂，再經(jīng)過官能團轉(zhuǎn)換，分別合成了3-羥基，22-肟基和3,6-二羥基，22-肟基的單肟基化合物(3和9)， 3-羥基(或乙?；?，6,22-二肟基的雙肟基化合物(13和14)及3,6,22-三肟基化合物(17)(Scheme 1)，其中涉及4個中間體(5～8)及目標化合物9, 13, 14和17共8個新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。并對化合物的體外抗腫瘤活性進行篩選，研究其構(gòu)效關(guān)系，為甾體肟類化合物的醫(yī)藥開發(fā)應用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X6型顯微熔點儀(溫度未校正)；Bruker AV-300型超導核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Thermo Scientific Nicolet IS-10型傅立葉紅外光譜儀(KBr壓片)； Agilent 6210 TOFMS型質(zhì)譜儀；MLLTISKAN MK3型酶標儀。

1[21]， 4, 10, 15[17]參考文獻方法合成；RPMI 1640培養(yǎng)基，HyClone公司；MTT，Sigma公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液(100X)，Beyotime公司；胰酶，Sigma公司；DMSO，Amresco公司；腫瘤細胞購自上海通派生物細胞庫；豆甾醇及其余所用試劑均為分析純，百靈威科技有限公司，其中溶劑按常規(guī)方法干燥。

1.2 合成

(1) 22-降-3β-乙酰氧基豆甾-5-烯-22-肟(2)的合成

在反應瓶中依次加入1 54 mg(0.15 mmol)， 95%乙醇10 mL,于55～60 ℃攪拌使其溶解；加入AcONa·3H2O 24 mg(0.175 mmol),攪拌使其溶解；加入NH2OH·HCl 13 mg(0.18 mmol),于60 ℃反應1 h[TLC跟蹤,展開劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=4 ∶1]。減壓蒸除大部分乙醇(出現(xiàn)大量白色固體),殘余物加少許水(出現(xiàn)白色固體)。用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取，合并萃取液，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥,減壓蒸出乙酸乙酯得淡黃色固體,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=4 ∶1)純化得2 42 mg，產(chǎn)率75%， m.p. 175～177 ℃;1H NMRδ: 7.28(d,J=8.1 Hz, 1H, 22-H), 7.23(br s, 1H, NOH), 5.39(br d,J=4.8 Hz, 1H, 6-H), 4.67～4.56(m, 1H, 3-Hα), 2.05(s, 3H, CH3CO), 1.14(d,J=6.8 Hz, 3H, 21-H), 1.04(s, 3H, 19-H), 0.74(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 170.6(3-COCH3), 156.9(C22), 139.7(C5), 122.6(C6), 73.9(C3), 56.5(C14), 53.9(C17), 50.0(C9), 42.6(C13), 39.5(C12), 38.1(C4), 37.1(C10), 37.0(C1), 36.6(C20), 31.8(C7), 31.8(C8), 27.7(C2), 27.6(C16), 24.3(C15), 21.4(CH3CO), 21.0(C11), 19.3(C19), 17.9(C21), 12.1(C18); IRν: 3 358(OH), 2 933(CH3), 1 732(C=O), 1 442(C=N) cm-1。

(2) 22E-肟-22,23-斷豆甾-5-烯-3β-醇(3)的合成

將2 40 mg(0.103 mmol)溶于1 mol·L-1KOH/CH3OH(10 mL)中,攪拌下于室溫反應1 h[TLC跟蹤(展開劑：A=2 ∶1)]。減壓蒸去溶劑得白色固體，加入冰水10 mL，用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取，合并萃取液，依次用水和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得透明油狀液體，經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(洗脫劑：A=2 ∶1)純化得白色固體3 32 mg，產(chǎn)率90%, m.p. 154～155 ℃；1H NMRδ: 7.28(d,J=7.8 Hz, 1H, 22-H), 5.35(br s, 1H, 6-H), 3.61～3.45(m, 1H, 3-Hα), 1.12(d,J=6.3 Hz, 3H, 21-H), 1.01(s, 3H, 19-H), 0.72(s, 3H, 18-H);

Scheme 1

13C NMRδ: 156.7(C22), 140.7(C5), 121.6(C6), 71.7(C3), 56.5(C14), 53.9(C17), 50.1(C9), 42.6(C13), 42.2(C4), 39.5(C12), 37.2(C1), 37.1(C20), 36.5(C10), 31.9(C8), 31.8(C7), 31.5(C2), 27.7(C16), 24.3(C15), 21.0(C11), 19.4(C19), 17.9(C21), 12.1(C18); IRν: 3 416(OH), 2 933(CH3), 1 640(C=C), 1 454(C=N), 1 053(C—O) cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H36NO2{[M+H]+}346.274 6, found 346.272 7。

(3) 5α-豆甾-22-烯-3β,6α-二醇(5)

將4 839 mg(1.98 mmol)溶于甲醇(50 mL)中，攪拌下加熱使其完全溶解;加入NiCl2·6H2O 471 mg(1.98 mmol)，溶解后，加入NaBH4451 mg(11.9 mmol),反應1 h(TLC監(jiān)測,展開劑：A=2 ∶1)。用1 mol·L-1鹽酸淬滅反應，蒸出大部分甲醇，用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并萃取液，依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑得白色固體797 mg，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2 ∶1)純化得白色固體5 613 mg,產(chǎn)率72%，m.p. 204～206 ℃；1H NMRδ: 5.17(dd,J=15.0 Hz, 8.4 Hz, 1H, 23-H), 5.03(dd,J=15.0 Hz, 8.7 Hz, 1H, 22-H), 4.23～4.17(m, 1H, 3-Hα), 3.78～3.74(m, 1H, 6-Hβ), 1.04(d,J=6.3 Hz, 3H, 21-H), 1.03(s, 3H, 19-H), 0.87(d,J=6.3 Hz, 3H, 27-H), 0.82(t,J=6.9 Hz, 3H, 29-H), 0.81(d,J=6.3 Hz, 3H, 26 or 27-H), 0.73(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 138.3(C22), 129.3(C23), 72.3(C3), 66.7(C6), 56.3(C17), 56.1(C14), 54.2(C24), 51.2(C5), 42.6(C13), 41.7(C9), 40.5(C20), 39.8(C12), 39.7(C1), 36.1(C10), 34.0(C7), 33.1(C4), 31.9(C8), 30.3(C25), 29.1(C2), 28.9(C16), 25.4(C28), 24.3(C15), 21.2(C27), 21.1(C26), 20.6(C11), 19.0(C21), 14.9(C19), 12.3(C18), 12.2(C29); IRν: 3 432(OH), 2 933(CH3), 1 640(C=C), 1 037(C—O) cm-1。

(4) 3β,6α-二乙酰氧基-5α-豆甾-22-烯(6)和3β-乙酰氧基-6-氧代豆甾-22-烯(11)的合成(以6為例)

將5 688 mg(1.6 mmol)溶于吡啶(15 mL)中，攪拌使其溶解；緩慢滴加乙酸酐2.5 mL，滴畢，反應0.5 h。于室溫靜置24 h，加蒸餾水15 mL，用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取，依次用1 mol·L-1鹽酸、飽和NaHCO3溶液及水洗滌，再用飽和食鹽水洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸出溶劑，當有較大量固體析出時，停止蒸餾，加熱使固體溶解，靜置結(jié)晶得白色片狀晶體6 738 mg。

用類似方法合成11。

6： 產(chǎn)率90%， m.p. 120～122 ℃；1H NMRδ: 5.17(dd,J=15.0 Hz, 8.4 Hz, 1H, 22-H), 5.03(dd,J=15.0 Hz, 8.1 Hz, 1H, 22-H), 4.98～4.92(m, 1H, 6-Hβ), 4.79～4.68(m, 1H, 3-Hα), 2.06(s, 3H, 6-COCH3), 2.04(s, 3H, 3-COCH3), 1.03(s, 3H, 19-H), 1.02(d,J=6.0 Hz, 3H, 21-CH3), 0.86(d,J=6.3 Hz, 3H, 26 or 27-H), 0.82(t,J=7.2 Hz, 3H, 29-H), 0.81(d,J=6.3 Hz, 3H, 26 or 27-H), 0.72(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 170.6(6-COCH3), 170.5(3-COCH3), 138.2(C22), 129.4(C23), 73.5(C6), 73.4(C3), 56.1(C17), 56.0(C14), 53.9(C9), 51.2(C24), 46.2(C5), 42.5(C13), 40.5(C20), 39.7(C12), 38.0(C1), 36.3(C10), 35.5(C7), 31.9(C8), 31.3(C2), 31.0(C25), 28.8(C4), 27.3(C16), 25.4(C28), 24.2(C15), 21.4(6-CH3CO), 21.3(3-CH3CO), 21.2(C27), 21.1(C26), 20.9(C11), 19.0(C21), 15.1(C19), 12.3(C18), 12.2(C29); IRν: 2 958(CH3), 1 740(C=O), 1 707(C=O), 1 610(C=C), 1 025(C—O) cm-1。

11： 產(chǎn)率83%, m.p. 138～140 ℃;1H NMRδ: 5.16(dd,J=15.3 Hz, 8.4 Hz, 1H, 23-H), 5.03(dd,J=15.3 Hz, 8.4 Hz, 1H, 22-H), 4.74～4.63(m, 1H, 3-Hα), 2.36～2.25(m, 2H, 7-H), 2.04(s, 3H, 3-CH3CO), 1.03(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 0.82(t,J=7.5 Hz, 3H, 26 or 27-H), 0.80(d,J=6.6 Hz, 3H, 26 or 27-H), 0.78(s, 3H, 19-H), 0.69(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 210.4(C6), 170.6(3-COCH3), 138.0(C22), 129.6(C23), 72.8(C3), 56.8(C14), 56.5(C17), 55.9(C5), 53.8(C9), 51.2(C24), 46.7(C7), 42.9(C13), 41.0(C20), 40.4(C12), 39.3(C10), 37.9(C8), 36.4(C1), 31.9(C25), 28.7(C16), 26.8(C2), 26.1(C28), 25.4(C4), 24.0(C15), 21.5(C11), 21.3(3-CH3CO), 21.2(C27), 21.1(C26), 19.0(C21), 13.0(C19), 12.3(C18), 12.2(C29); IRν: 2 958(CH3), 1 740(C=O), 1 707(C=O), 1 466(C=C) cm-1。

(5) 3β,6α-二乙酰氧基-22,23-斷-5α-豆甾-22-醛(7)， 3β-乙酰氧基-6-氧代-22,23-斷-5α-豆甾-22-醛(12)和3,6-二氧代-22,23-斷-5α-豆甾-22-醛(16)的合成(以7為例)

將6 340 mg(0.24 mmol)加至圓底燒瓶中，加入二氯甲烷16 mL和甲醇4 mL，攪拌使其完全溶解；置于液氮冷卻的乙酸乙酯保溫瓶中冷卻至-78 ℃，通入富含有O3的氧氣流，反應30 min(TLC跟蹤,展開劑：A=4 ∶1);停止通入O3，此時溶液變?yōu)榈{色，通入氧氣反應0.5 h；加入二甲硫醚3 mL，升至室溫，反應過夜。減壓蒸除大部分溶劑得白色固體的混合油狀物，用二氯甲烷(50 mL)溶解，加入蒸餾水10 mL，分液，有機層用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得無色透明油狀物，干燥后經(jīng)快速柱層析(洗脫劑：A=4 ∶1)純化得油狀液體7 214 mg。

用類似方法合成12和16。

7： 產(chǎn)率74.7%;1H NMRδ: 9.57(d,J=3.3 Hz, 1H, 22-H), 4.98～4.90(m, 1H, 6-Hβ), 4.78～4.67(m, 1H, 3-Hα), 2.42～2.31(m, 1H, 20-H), 2.05(s, 3H, 6-CH3CO), 2.03(s, 3H, 3-CH3CO), 1.13(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 1.03(s, 3H, 19-H), 0.75(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 205.0(C22), 180.9(6-COCH3), 170.6(3-COCH3), 73.4(C6), 73.2(C3), 55.2(C14), 53.8(C9), 51.0(C17), 49.4(C20), 46.1(C5), 43.2(C13), 39.4(C12), 38.0(C1), 36.3(C7), 35.5(C10), 31.0(C8), 30.9(C4), 27.3(C2), 27.0(C16), 24.5(C15), 21.3(6-CH3CO), 21.4(3-CH3CO), 20.9(C11), 15.1(C19), 13.4(C21), 12.5(C18); IRν: 2 941(CH3), 1 736(C=O), 1 728(C=O), 1 707(C=O) cm-1。

12： 無色膠狀物，產(chǎn)率71%, m.p. 154～156 ℃;1H NMRδ: 9.60(d,J=3.0 Hz, 1H, 22-CHO), 4.74～4.63(m, 1H, 3-Hα), 2.37～2.26(m, 2H, 7-H), 2.05(s, 3H, 3-CH3CO), 1.15(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 0.80(s, 3H, 19-H), 0.73(3H, s, 18-H);13C NMRδ: 210.0(C6), 204.7(C22), 170.6(3-COCH3), 72.8(C3), 56.5(C14), 55.9(C5), 53.8(C9), 50.9(C17), 49.4(C20), 46.5(C7), 43.5(C13), 41.0(C12), 39.1(C10), 37.8(C8), 36.4(C1), 26.9(C2), 26.8(C4), 26.1(C16), 24.3(C15), 21.4(3-CH3CO), 21.3(C11), 13.4(C19), 13.0(C18), 12.4(C21); IRν: 2 937(CH3), 1 723(C=O), 1 707(C=O) cm-1。

16： 白色固體，產(chǎn)率70%, m.p. 168～169 ℃;1H NMR(DMSO-d6)δ: 9.54(d,J=6.5 Hz, 1H, 22-H), 2.78(dd,J=13.5 Hz, 4.0 Hz, 1H, 5-H), 1.05(d,J=6.5 Hz, 3H, 21-H), 0.87(s, 3H, 19-H), 0.69(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 209.4(C3), 209.3(C6), 205.7(C22), 56.5(C14), 55.5(C5), 52.4(C17), 51.0(C20), 49.0(C13), 46.2(C9), 43.5(C7), 41.0(C10), 39.0(C4), 37.7(C12), 37.6(C2), 37.4(C1), 37.2(C8), 26.9(C16), 24.4(C15), 21.6(C11), 13.6(C19), 12.6(C18), 12.5(C21); IRν: 2 931(CH3), 1 709(C=O) cm-1。

(6) 22,23-斷-3β,6α-二乙酰氧基-5α-豆甾-22E-肟(8)， 3β-乙酰氧基-22,23-斷-5α-豆甾-6E,22E-二肟(13)和(3E,6E,22E)-三肟基-22,23-斷-5α-豆甾烷(17)的合成(以8為例)

在反應瓶中依次加入7 242 mg(0.56 mmol)和95%乙醇30 mL，加熱攪拌使其溶解；加入三水乙酸鈉77 mg(0.56 mmol), 溶解后分3批緩慢加入鹽酸羥胺49 mg(0.7 mmol),加畢(10 min),溶解完全后,控制反應溫度在65 ℃左右反應1 h(TLC跟蹤,展開劑：A=4 ∶1)。減壓蒸除大部分乙醇(析出大量白色固體),加少許蒸餾水(析出白色沉淀)，加入乙酸乙酯溶解,用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取,合并萃取液,依次用蒸餾水和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得白色固體，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=4 ∶1)純化得8 207 mg。

用類似方法合成13和17。

8： 白色固體，產(chǎn)率82.7%， m.p. 90～91 ℃;1H NMRδ: 7.56(br s, 1H, NOH), 7.27(d,J=8.1 Hz, 1H, 22-H), 4.95(br d,J=2.7 Hz, 1H, 6-Hβ), 4.78～4.67(m, 1H, 3-Hα), 2.34～2.44(m, 1H, 20-H), 2.06(s, 3H, 6-CH3CO), 2.04(s, 3H, 3-CH3CO), 1.13(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 1.03(s, 3H, 19-H), 0.75(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 170.6(3, 6-COCH3), 156.7(C22), 73.4(C6), 73.3(C3), 55.8(C14), 53.9(C17), 53.8(C9), 46.1(C13), 42.9(C5), 39.5(C12), 38.0(C10), 37.1(C1), 36.3(C7), 35.5(C20), 30.9(C8), 29.7(C4), 27.6(C2), 27.3(C16), 24.2(C15), 21.4(6-CH3CO), 20.9(3-CH3CO), 18.4(C11), 17.9(C21), 15.1(C19), 12.4(C18); IRν: 3 452(OH), 2 937(CH3), 1 740(C=O), 1 728(C=O), 1 638(C=C) cm-1。

13： 白色固體，產(chǎn)率92.8%, m.p. 132～133 ℃;1H NMRδ: 8.35(s, 1H, NOH), 7.87(s, 1H, NOH), 7.28(d,J=7.8 Hz, 1H, 22-H), 4.75～4.64(m, 1H, 3-Hα), 3.34(dd,J=13.5 Hz, 4.5 Hz, 1H, 7-Hβ), 2.39(dd,J=15.6 Hz, 7.8 Hz, 1H, 5-H), 2.04(s, 3H, 3-CH3CO), 1.14(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 0.79(s, 3H, 19-H), 0.71(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 170.7(3-COCH3), 159.6(C6), 156.5(C22), 73.2(C3), 56.3(C14), 54.2(C17), 53.9(C9), 49.3(C5), 43.2(C13), 39.3(C12), 38.9(C10), 37.2(C20), 36.0(C1), 35.7(C8), 29.5(C4), 27.6(C7), 27.5(C2), 27.0(C16), 24.1(C15), 21.4(3-CH3CO), 21.3(C11), 17.8(C19), 12.5(C21), 12.3(C18); IRν: 3 374(OH), 2 941(CH3), 1 723(C=O), 1 650(C=C), 1 450(C=N) cm-1。

17： 白色固體，產(chǎn)率65%, m.p.173～175 ℃;1H NMR(CD3OD)δ: 7.20(d,J=4.8 Hz, 1H, 22-H), 3.38～3.32(m, 2H, 2-Hα, 7-Hβ), 0.76(s, 3H, 18-H), 1.12(d,J=6.5 Hz, 3H, 21-H), 0.88(s, 3H, 19-H);13C NMR(CD3OD)δ: 159.7(C6), 158.2(C3), 155.7(C22), 56.2(C14), 53.9(C17), 50.9(C9), 49.6(C5), 42.7(C13), 39.3(C12), 39.2(C10), 36.8(C20), 35.5(C8), 29.0(C7), 28.0(C2), 27.2(C1), 26.9(C16), 23.7(C19), 21.1(C15), 20.8(C4), 19.4(C11), 17.1(C21), 11.3(C18); IRν: 3 375(OH), 2 937(CH3), 1 649(C=C), 1 457(C=N) cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H36N3O3{[M+H]+}390.275 7, found 390.274 2。

(7) 22E-肟-22,23-斷-5α-豆甾-3β,6α-二醇(9)和6E,22E-二肟基-22,23-斷-5α-豆甾-3β-醇(14)的合成(以9為例)

將9 113 mg(0.25 mmol)溶于KOH/CH3OH(5 ∶95)溶液15 mL中，攪拌下于室溫反應0.5 h(TLC跟蹤,展開劑：A=1 ∶1)。減壓蒸除溶劑得白色固體，加冰水10 mL，用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并萃取液，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得白色固體，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=1 ∶1)純化得白色固體9 75 mg。

用類似方法合成14。

9： 產(chǎn)率82%， m.p. 156～158 ℃;1H NMR(CD3COCD3)δ: 9.44(s, 1H, NOH), 7.20(d,J=7.8 Hz, 1H, 22-H), 3.75(br s, 1H, 6-Hβ), 3.58～3.49(m, 1H, 3-Hα), 2.38～2.27(m, 1H, 20-H), 1.10(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 1.06(s, 3H, 19-H), 0.76(s, 3H, 18-H);13C NMR(CD3COCD3)δ: 154.5(C22), 70.9(C3), 70.8(C6), 56.1(C14), 54.5(C17), 54.2(C5), 47.8(C9), 42.7(C13), 40.1(C12), 39.7(C1), 38.6(C7), 37.0(C8), 35.9(C4), 35.4(C10), 31.6(C2), 30.4(C20), 27.5(C16), 24.1(C15), 20.9(C11), 17.6(C19), 15.3(C21), 11.8(C18); IRν: 3 420(OH), 2 933(CH3), 1 695(C=C) cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H38NO3{[M+H]+}364.285 2, found 364.283 3。

14： 白色固體，產(chǎn)率85.5%, m.p. 238～240 ℃;1H NMRδ: 8.27(s, 1H, NOH), 7.55(s, 1H, NOH), 7.28(d,J=7.8 Hz, 1H, 22-H), 3.65～3.55(m, 1H, 3-Hα), 3.34(dd,J=4.5 Hz, 13.8 Hz, 1H, 7-Hβ), 2.45～2.32(m, 1H, 20-H), 1.14(d,J=6.6 Hz, 3H, 21-H), 0.78(s, 3H, 19-H), 0.72(s, 3H, 18-H);13C NMRδ: 159.9(C6), 156.6(C22), 71.1(C3), 56.4(C14), 54.3(C17), 53.9(C9), 49.5(C5), 43.1(C13), 39.4(C12), 38.9(C10), 37.1(C20), 36.2(C1), 35.7(C8), 31.6(C4), 30.8(C2), 29.5(C7), 27.6(C16), 24.1(C15), 21.4(C11), 17.8(C19), 12.6(C21), 12.3(C18); IRν: 3 391(OH), 2 937(CH3), 1 732(C=O), 1 650(C=C), 1 446(C=N) cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H37N2O3{[M+H]+}377.280 4, found 377.278 7。

1.2 抗腫瘤活性測定

采用MTT法測試了化合物對人胃癌細胞(SGC-7901)、人肝癌細胞(Bel-7404)和人體乳腺癌細胞株(HeLa)的體外抗腫瘤活性。

首先將化合物溶解在DMSO中配制成10 mg·mL-1溶液，置冰箱保存;將對數(shù)生長期的腫瘤細胞分別以約(1～3)×104個·mL-1的密度接種于96孔板中,每孔接種200 μL,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;按預設(shè)的濃度梯度加入待測樣品,每一濃度梯度設(shè)3個平行孔,同時分別采用順鉑作為陽性對照和等量的DMSO作為空白對照;在二氧化碳培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)72 h。每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL,在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育4 h;抽取上清液,加入DMSO 200 μL,在振動器上震蕩10 min溶解沉淀,隨后用酶標儀在492 nm波長測定OD值，計算抑制率[抑制率=(1-OD值樣品/OD對照)×100%][22]，以抑制率對藥物濃度作圖,求出每個樣品的IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在3的合成中，1與鹽酸羥胺反應生成化合物2，隨后在KOH的甲醇溶液中進行脫酯反應合成化合物3。

在9的合成中，首先，化合物4在NiCl2存在下用NaBH4還原制得72%的化合物5。然后，通過酯化反應保護3,6-羥基得化合物6?；衔?在4 ∶1的CH2Cl2/MeOH中于-78 ℃進行臭氧化反應，通入O2除去過量O3，并且加入Me2S生成臭氧化物得化合物7。接著，化合物7與鹽酸羥胺反應制得化合物8。最后，化合物8在KOH的甲醇溶液中進行脫酯化反應合成化合物9。

為了解多肟基取代對化合物毒性的影響，首先，通過化合物4在Ni2+存在下進行選擇性還原制得10,酯化制得化合物11，接著，化合物11進行臭氧化反應生成12。化合物12與鹽酸羥胺在乙醇和醋酸鈉存在下反應以93%產(chǎn)率獲得化合物13。最后，化合物13在KOH/CH3OH(1 mol·L-1)中于室溫進行水解反應合成化合物14。

為進一步評價肟基在甾核的不同位置上對化合物細胞毒性的影響，本文還合成了3-, 6-, 22-位三肟基取代的豆甾化合物17。在17的合成中，化合物4還原生成化合物10和5的混合物，然后直接氧化生成豆甾-22-烯-3,6-二酮15,后經(jīng)臭氧化斷鍵形成醛基，再通過控制鹽酸羥胺的用量和反應時間合成化合物17。

在這些合成的化合物中，化合物5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 17均為新化合物。

2.2 抗腫瘤活性

為測定肟基在不同位置對生物活性的影響，本文測試了化合物對SGC 7901， Bel 7404和HeLa腫瘤細胞株的活性，結(jié)果見表1。由表1可以看出，具有22-肟基的3-羥基-5-烯結(jié)構(gòu)的豆甾化合物3對受試細胞均有一定的活性，IC50分別為34±2 μmol·L-1, 32±1 μmol·L-1和38±3 μmol·L-1。將3-酯基變?yōu)?-羥基時，細胞毒性變化略微提高，然而，將化合物3中的5,6-雙鍵變?yōu)?-羥基(9)或6-肟基(14)時，這些化合物的體外抗腫瘤增殖活性降低。但是，在3-, 6-, 22-位同時引入肟基官能團時，具有三肟基取代結(jié)構(gòu)的化合物17的體外抗腫瘤增殖活性與化合物9和14相比有明顯的提高。以上結(jié)果表明3-肟基官能團在化合物17中對這些腫瘤細胞的毒性有明顯的提高。然而，引入3-或(和)6-肟基冠能團并沒有明顯地提高這些化合物的細胞毒性。從測試的結(jié)果與之前我們的工作相比，在甾核中引入多肟基官能團并不能明顯提高化合物的細胞毒性。

表1 化合物的體外抗腫瘤活性(IC50/μmol·L-1)

以豆甾醇為起始原料，合成了不同系列的22-肟基結(jié)構(gòu)的甾體化合物,包含8個新化合物。其中，具有22-肟基和3-羥基5-烯結(jié)構(gòu)的化合物3對人胃癌細胞(SGC-7901)、人肝癌細胞(Bel-7404)和人體乳腺癌細胞株(HeLa)顯示了中等強度的抗腫瘤增殖活性，IC50分別為34±2 μmol·L-1, 32±1 μmol·L-1和38±3 μmol·L-1。然而，在3-或6-位引入肟基時并不能提高這些甾體化合物的抗腫瘤增殖活性。該研究結(jié)果為設(shè)計新穎的化學抗腫瘤藥物提供了理論參考。

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Synthesis and Antiproliferative Activities of Novel Stigmastane Compounds Substituted with Hydroximino Groups

GAN Chun-fang, DONG Xin, LIU Xiao-lan, PANG Li-ping, PANG Chun-ling, HUANG Yan-min, CUI Jian-guo*

(College of Chemistry and Material Science, Key Laboratory of Beibu Gulf Environment Change and Resources Utilization, Guangxi Teachers Education University, Nanning 530001, China)

A series of stigmastane compounds substituted with 22-hydroximino(3, 9), 6,22-dihydroximino(13, 14) and 3,6,22-trihydroximino(17) were synthesized through ozonation and functional group transformation methods using stigmasterol as starting material. Eight novel compounds including four intermediates(5～8) and target compounds(9, 13, 14 and 17) were involved. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR， IR and HR-MS(ESI). The antiproliferative activities of compounds were evaluated against human gastric carcinoma(SGC-7901), human cervical carcinoma(HeLa) and human liver carcinoma(Bel-7404) cells. The results showed that compound 3 with 22-hydroximino and 3-hydroxy-5-enekey features displayed distinct antiproliferative activities to these cells with IC50of 34±2 μmol·L-1, 32±1 μmol·L-1and 38±3 μmol·L-1, respectively, and a further introduction of hydroximino or hydroxyl groupon steroidal nucleus did not enhance the antiproliferative activities of compounds.

stigmasterol； 22-hydroximino groupsteroid; synthesis; antiproliferative activity; cytotoxicity

2016-09-21

國家自然科學基金資助項目(21462009, 21562007); 廣西高?？茖W研究項目(KY2015ZD077)

甘春芳(1973-)，女，漢族，廣西南寧人，博士，主要從事甾體化合物的合成及抗腫瘤活性研究。 Tel. 0771-3113518，E-mail: ganchunfang2008@126.com

崔建國，教授， Tel. 0771-3908065， E-mail: cuijg1954@126.com

O621.3; O629.2

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.01.16244